一种黑曲霉酯水解酶AnCu3、编码基因及其在水解DEHP中的应用

摘要

本发明公开了一种黑曲霉酯水解酶AnCu3，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；还公开了所述黑曲霉酯水解酶AnCu3在水相体系催化水解塑化剂邻苯二甲酸双(2‑乙基己)酯(DEHP)中的应用。本发明首次提供了一种黑曲霉来源的可以催化水解邻苯二甲酸双(2‑乙基己)酯的酶和编码基因，为水解邻苯二甲酸双(2‑乙基己)酯提供了一种新的途径。

权利要求

1.一种黑曲霉酯水解酶AnCu3，其特征在于：所述黑曲霉酯水解酶AnCu3的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种黑曲霉酯水解酶AnCu3编码基因，其编码如权利要求1所述的黑曲霉酯水解酶AnCu3。

3.如权利要求2所述的黑曲霉酯水解酶AnCu3编码基因，其特征在于，所述编码基因的cDNA序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种含有权利要求2或3所述的黑曲霉酯水解酶AnCu3编码基因的表达载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是大肠杆菌表达载体。

6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是pET-28a(+)表达载体。

7.一种含有如权利要求4至6任一项所述的表达载体的重组细胞系。

8.如权利要求7所述的重组细胞系，其特征在于，所述重组细胞系是重组细菌。

9.如权利要求8所述的重组细胞系，其特征在于，所述重组细菌是大肠杆菌。

10.如权利要求1所述一种黑曲霉酯水解酶AnCu3在水解邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯中的应用。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，是在水相体系中进行催化水解。

12.一种水解邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯的方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的黑曲霉酯水解酶AnCu3对邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯进行催化水解。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，将所述黑曲霉酯水解酶AnCu3加入至邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯的溶液中，经水浴摇床进行催化水解反应。

14.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉酯水解酶AnCu3通过基因重组方法获得。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉酯水解酶AnCu3是培养含有所述黑曲霉酯水解酶AnCu3基因的表达载体的大肠杆菌，经超声波细胞破碎仪破碎细胞，离心取上清液作为酶液。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，还对所述酶液进行进一步纯化。

说明书

一种黑曲霉酯水解酶AnCu3、编码基因及其在水解DEHP中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种黑曲霉酯水解酶AnCu3在水解邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯(DEHP)中的应用。技术背景

[0002] 邻苯二甲酸酯(又称酞酸酯，phthalic acid esters，PAEs)，是邻苯二甲酸形成的酯的统称，俗称塑化剂、增塑剂。PAEs常被作为主要功能成分添加到聚氯乙烯(又名塑料，polyvinyl chloride，PVC)中，以增加PVC的柔韧性和耐久性。目前PAEs的用量超过800万吨/年，PAEs可用作油漆、粘合剂、化妆品和润滑剂的添加剂，并作为主要添加成分用于PVC材料的柔性改进，所生产改性PVC材料普遍用于建筑、汽车、医疗产品和电缆等行业。根据PAEs和PVC的相互作用，可将PAEs分为内增塑剂和外增塑剂。内增塑剂与PVC通过共价键相互作用，可被看作是PVC的固有部分；外增塑剂与PVC常通过氢键和范德华力等发生相互作用。因此，外增塑剂比内增塑剂更容易通过蒸发、迁移或萃取等途径进入环境。然而，内增塑剂对PVC材料的柔性改变相对更弱，所获得改性PVC材料的柔韧性和耐久性较差，难以满足实际的工业需求。与之相比，外增塑剂对PVC材料的改性效果更加显著，因而外增塑剂是目前主要的PVC改性添加材料。

[0003] 常见PAEs包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)、邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯(DEHP)和邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)。其中邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)在PAEs的使用中占比较高，约37.1％，每年超过300万吨。研究表明，PAEs在人体内具有类似雌性激素的作用，会干扰内分泌，使男子精液量和精子数量减少，精子运动能力低下，精子形态异常。很多化妆品的芳香成分也含有这类物质，会通过女性的呼吸系统和皮肤进入体内，如果过多使用，会增加女性患乳腺癌的风险，并有一定几率危害到所孕男婴的生殖系统。2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布致癌物清单，邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯属于2B类致癌物。目前上述6种PAEs均被美国环境保护署、欧盟(欧盟)和中国国家环境监测中心列为优先监测的污染物。

[0004] PAEs已经成为人们日常接触的最常见的化学物质之一，在塑料制品的生产、使用和处置过程中，PAEs会迁移到不同的生态系统中，比如土壤和水体。目前在各种生境甚至南极冰雪中都检测到PAEs。人们可以通过多种方式摄入PAEs，如饮食和皮肤接触等。由于PAEs对环境和人体健康的毒理学效应，研究PAEs的降解方法意义重大。目前已知的降解方法包括水解、光化学降解以及生物降解等。其中，生物降解法由于效率高、环境友好、二次污染小等优势，被认为是最重要的PAEs降解方法之一。挖掘降解PAEs的各种生物材料，比如各种微生物，以及更深入的层次，微生物所携带的有效降解PAEs的酶资源，具有重要的科学意义和实际应用价值。

发明内容

[0005] 黑曲霉目前无文献报道具有邻苯二甲酸酯水解特性的羧酸酯水解酶，但本发明人在前期研究发现黑曲霉具有酯水解特性，推测可能是黑曲霉携带的羧酸酯水解酶在起作用。但羧酸酯水解酶为一个非常大的酶家族，包含95个亚家族，蛋白种类非常多，发明人通常研究最终筛选获得1个具有酯水解特性的酶。因此，本发明首次公开一个黑曲霉来源酯水解酶，具有水解邻苯二甲酸酯的能力，为邻苯二甲酸酯的生物降解提供优选的酶资源。。

[0006] 因此，本发明首先提供一种黑曲霉酯水解酶AnCu3，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0007] 进一步提供一种黑曲霉酯水解酶AnCu3编码基因，其编码上述的黑曲霉酯水解酶AnCu3。优选地，所述编码基因其的cDNA序列如SEQ ID No.2所示。

[0008] 同时，本发明提供一种含有上述基因的表达载体，优选地所述表达载体是大肠杆菌表达载体，如pET-28a(+)表达载体。本发明还进一步提供含有上述表达载体的重组细胞系，优选为重组细菌，如大肠杆菌。

[0009] 本发明进一步还提供一种水解邻苯二甲酸酯，优选为邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯的方法，其特征在于，利用上述的黑曲霉酯水解酶AnCu3对邻苯二甲酸酯，优选为邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯进行催化水解。

[0010] 更具体的是，将所述黑曲霉酯水解酶AnCu3加入至邻苯二甲酸酯，优选为邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯的溶液中，经水浴摇床进行反应。

[0011] 优选地，所述黑曲霉酯水解酶AnCu3通过基因重组方法获得，更具体的是培养含有所述黑曲霉酯水解酶AnCu3基因的表达载体的大肠杆菌，经超声波细胞破碎仪破细胞，离心取清液作为酶液，优选还进一步纯化。

[0012] 本发明的有益效果：本发明利用生物基因工程技术，克隆并诱导表达获得黑曲霉酯水解酶AnCu3及其编码基因。实验表明，通过构建含有酯水解酶AnCu3编码基因的大肠杆菌表达质粒，将该质粒转入大肠杆菌中，经过诱导表达获得该酶，并经催化体系验证具有在水相体系催化水解邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯(DEHP)的能力，实验中采用粗酶液时，其水解率可高达41.20％。本发明首次获得黑曲霉来源的酯水解酶AnCu3，可以为邻苯二甲酸酯，尤其是DEHP的有效水解提供可选择的酶资源。

附图说明

[0013] 图1酯水解酶AnCu3编码基因PCR扩增结果。

[0014] 图2酯水解酶AnCu3编码基因诱导表达结果。

[0015] 图3酯水解酶AnCu3催化水解DEHP结果。

具体实施方式

[0016] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。

[0017] 实施例1酯水解酶AnCu3编码基因的克隆

[0018] 1、黑曲霉培养

[0019] 在无菌操作条件下，将黑曲霉接种含有100mL发酵培养基的300mL三角瓶，摇床30±1℃，150±10r/min培养4-8d。所述发酵培养基，其组成为葡萄糖70g/L、黄豆饼粉10g/L、MgSO4 0.20g/L、NaNO3 2.0g/L、NaH2PO4 1.0g/L，调节pH为4.5，115℃灭菌20min。

[0020] 2、黑曲霉总RNA的提取

[0021] 对上述培养6天的黑曲霉取样，采用BIOMIGA真菌RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：

[0022] (1)称取100mg真菌培养物到1.5mL或者2.0mL离心管中，液氮冷冻，用研磨小杵将真菌研磨成粉末(如果有条件，将组织置于研钵中，液氮研磨成粉末，迅速转移100mg研磨粉末到离心管中，效果更好)。样品的破碎程度将影响组织细胞裂解效果和RNA得率。

[0023] (2)加入10倍体积(1mL)Buffer RLY和1倍体积(100μl)Plantaid(使用前请摇匀)到离心管中，瞬时涡旋，充分打散研磨物。

[0024] 确保β-巯基乙醇已加入到Buffer RLY中。

[0025] (3)转移上述裂解液到DNA清除柱中，13,000×g离心2分钟，弃掉DNA清除柱，保留下面收集管中的裂解液。

[0026] (4)向裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇(如500μl上清液应加入250μl无水乙醇)，颠倒混合均匀。

[0027] (5)转移以上混合液至一个带有收集管的吸附柱中(包括可能生成的任何沉淀)，室温下，13,000×g离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新转移至收集管中。

[0028] (6)加入500μl Buffer RB，室温下，13,000×g离心30s，弃废液，将吸附柱放回到收集管中。

[0029] (7)加入500μl RNA Wash Buffer，室温下，13,000×g离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回到收集管中。

[0030] 确保无水乙醇已加入到RNA Wash Buffer中。

[0031] (8)再次加入500μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，室温下，13,000×g离心30s，弃废液和收集管，将吸附柱转移至一个新的收集管中。

[0032] (9)室温下，13,000×g离心2分钟(可选操作，开盖离心将更有助于乙醇的去除)，去除残留的乙醇。

[0033] 注意：乙醇的残留将会降低洗脱效果和影响下游实验，开盖离心或者适当延长离心时间，将有助于乙醇的去除。

[0034] (10)将吸附柱放入一个RNase-Free的1.5mL收集管中，加入50–100μl的DEPC-treated ddH2O，室温放置2分钟，13,000×g离心1分钟洗脱RNA。提取到的RNA可直接用于后续实验或者-20℃存放。

[0035] 3、cDNA模板的制备

[0036] 采用TIANGEN反转录试剂盒FastQuant RT Kit(with gDNase)制备cDNA模板，具体步骤如下：

[0037] 50ng–2μg总RNA可建立20μl反应体系。

[0038] (1)将提取的RNA样品在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。

[0039] 以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。

[0040] (2)按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。

[0041] 表1gDNA去除反应体系

[0042]组成成分 使用量(μl)
5*gDNA Buffer 2
Total RNA -
RNase-Free ddH2O 补足到10

[0043] (3)按照表2的反转录反应体系配制混合液。

[0044] 表2反转录反应体系

[0045] 组成成分 使用量(μl)10*Fast RT Buffer 2
RT Enzyme Mix 1
FQ-RT Primer Mix 2
RNase-Free ddH2O 补足到10

[0046] (4)将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。

[0047] (5)42℃，孵育15min。

[0048] (6)95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。

[0049] 4、PCR扩增酯水解酶编码基因

[0050] 依据已经在NCBI公布的黑曲霉基因组信息和注释结果，设计了多对引物克隆黑曲霉的羧酸酯水解酶编码基因。

[0051] 第一对引物：

[0052] AnCu1.f:GCCTGGTGCCAAGAGGAAGTACCGACGCCGAAAACCTC；AnCu1.r:TGTTAGCAGCCGGATCTCAGTTAGAGACCTCCAAAAAAAG。其克隆的基因称为AnCu1。

[0053] 第二对引物：

[0054] AnCu2f:GCCTGGTGCCAAGAGGAAGTGAACGTCAACTTTCCGATG；AnCu2r:TGTTAGCAGCCGGATCTCAGTTAGAAAAGTGATGCCAG，其克隆到的基因称为AnCu2；

[0055] 第三对引物：

[0056] AnCu3.f:GCCTGGTGCCAAGAGGAAGTATGTCCAGCAGTGGTAGCGGC；

[0057] AnCu3.r:TGTTAGCAGCCGGATCTCAGCTAAGAAGAAGAAACCC，其克隆的基因称为AnCu3。

[0058] 依据实施例2和3的操作步骤构建工程菌株诱导表达后获得粗酶液，以其测定DEHP的水解效率，结果表明仅AnCu3基因具有DEHP降解特性的酶(见图3)，后续以仅描述AnCu3基因的克隆和表达的具体操作如下(其中AnCu1和AnCu2基因的验证过程方法相同，因此没有重复描述)。

[0059] 通过PCR扩增黑曲霉来源的酯水解酶AnCu3的编码基因。

[0060] PCR反应体系见下表。

[0061] 表3PCR反应体系扩增AnCu3的编码基因

[0062] 试剂组成 使用量(μl)ddH2O 21.0
dNTP Mixture(2.5mM each) 3.0
10×Ex Taq Buffer 3.0
正向引物(10μM) 0.6
反向引物(10μM) 0.6
模板cDNA 0.8
Ex Taq(5U/μl) 1.0
Total 30.0

[0063] PCR扩增循环

[0064]

[0065] 基因扩增结果通过凝胶电泳检测，结果如图1所示。

[0066] 实施例2构建表达酯水解酶AnCu3的大肠杆菌工程菌株

[0067] 1、pET-28a(+)载体的线性化

[0068] 设计引物通过PCR进行pET-28a(+)载体的线性化。引物设计如下：

[0069] 正向引物：5'-CTGAGATCCGGCTGCTAA-3'，

[0070] 反向引物：5'-ACTTCCTCTTGGCACCAGGCCGCTGCT-3'

[0071] PCR反应体系见表4。

[0072] 表4线性化载体pET-28a(+)的PCR反应体系

[0073]试剂 体积(μl)
ddH2O 21.0
dNTPs(2.5mM each) 3.0
10×Ex Taq Buffer 3.0
正向引物(10μM) 0.6
反向引物(10μM) 0.6
pET-28a(+)载体 0.8
Q5DNA Polymerase(5U/μl) 1.0
Total 30.0

[0074] PCR扩增循环

[0075]

[0076]

[0077] 扩增DNA条带通过DNA纯化后，用于质粒的构建。

[0078] 2、pET-AnCu3质粒构建

[0079] 通过 II进行质粒构建。引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15–20bp)。基于此原则设计基因扩增的引物进行重组反应，于冰水浴中配制如下反应体系。反应体系组成见表5。

[0080] 表5质粒连接反应体系

[0081] 组成成分 使用量5*CE II Buffer 4μl
线性化克隆载体 50–200ng
基因扩增产物 20–200ng
Exnase II 2μl
ddH2O 补足到10μl

[0082] 体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分。置于37±1℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

[0083] 3、质粒的转化

[0084] 取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45–90秒，冰水浴孵育2min。加入600μl的LB培养基，37±1℃摇菌60min充分复苏。取100μl菌液均匀涂布在含有适当硫酸卡那霉素抗生素的LB培养基平板上。将平板倒置，于37±1℃过夜培养。所述LB培养基配方：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，固体添加2％的琼脂粉，调节pH为7.0，121℃灭菌20min。

[0085] 实施例3酯水解酶AnCu3粗酶液水相体系催化水解DEHP

[0086] 1、酯水解酶AnCu3的诱导表达

[0087] 挑取经验证正确的转化子，转接含有适当硫酸卡那霉素抗生素的LB液体试管，37±1℃过夜培养，然后以1％(v/v)的接种量接种含有100mL LB培养基的300mL三角瓶，摇床37±1℃、200±10rpm培养3h，然后加入终浓度0.5mM的诱导剂IPTG，20±1℃、200±10rpm培养20h。

[0088] 2、酯水解酶AnCu3粗酶液的制备

[0089] 大肠杆菌诱导表达后13,000rpm离心5min收集菌体，用pH 7.5的0.05M Tris-HCl缓冲液悬浮洗涤菌体2次，然后悬浮菌体。超声波细胞破碎仪破细胞，13,000×g离心5min，上清液作为粗酶液，首先进行SDS-PAGE电泳，确定目标蛋白表达(图2)，然后进行水解酶AnCu3的酯合成特性检测。

[0090] 3、AnCu3粗酶液的DEHP催化水解

[0091] 10mL反应体系如下：

[0092] 粗酶液，1mL；Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液，9mL；DMSO溶解的DEHP母液(10g/L)20μL，终浓度为200mg/L。30±1℃，150±10rpm水浴摇床反应12h。3mL正己烷萃取，通过气相色谱标准曲线法定量检测DEHP的水解量。

[0093] 以不含有酯水解酶AnCu3编码基因的pET-28a(+)载体作为对照。

[0094] 4、气相色谱定量检测

[0095] 色谱柱：Agilent 19091N-213I

[0096] 检测条件：80℃，保持5min；以20℃/min的速度升至240℃，保持23.5min。进样量1μl，不分流。载气为氮气，流速为1mL/min，FID检测器。

[0097] 结果证实，表达酯水解酶AnCu3的大肠杆菌工程菌的粗酶液具有在水相体系催化水解DEHP的能力，12h可以水解82.4mg/L的DEHP，水解率为41.20％，而pET-28a(+)载体、以及AnCu1(对应载体为pET-AnCu1)和AnCu2(对应载体为pET-AnCu2)没有显示有水解能力(见图3)。