一种氨基酸脱氢酶及其应用

摘要

本发明公开了一种氨基酸脱氢酶及其应用，对如SEQ ID NO.01所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，上述突变包括如下至少之一：将第57位的L突变为E、第60位的G突变为S或T、将第76位的K突变为S、将第285位的Y突变为L或M、将第288位的N突变为E和将第333位的M突变为D或R。本发明通过对获得自海洋菌株Bacillus nanhaiensis的苯丙氨酸脱氢酶的分子改造，使其底物结合口袋发生了重塑，不仅可以容纳这些大位阻底物，同时拉近了底物与辅酶之间的距离，使其获得对大位阻底物的催化活性，拓展了其催化功能用于生物合成系列具有大位阻疏水侧链的非天然氨基酸。

权利要求

1.一种氨基酸脱氢酶，其特征在于：对如SEQ ID NO. 01 所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，上述突变为如下之一：将第60位的G突变为S；

将第76位的K突变为S；

将第333位的M突变为D；

将第333位的M突变为R；

将第285位的Y突变为L；

将第285位的Y突变为M；

将第76为的K突变为S，同时将第60位的G突变为T；

将第285位的Y突变为L，同时将第76位的K突变为S；

将第285位的Y突变为L，同时将第76位的K突变为S以及将第288位的N突变为E。

2.权利要求1所述的一种氨基酸脱氢酶在催化制备非天然氨基酸中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：构建反应体系，于20‑50℃且100‑300rpm的转速震荡反应10‑100h，获得所述非天然氨基酸；

上述反应体系包括如下：

以pH=8‑10的甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液为溶剂，其中含有：0.001‑1 mol/L酮酸或酮酸酯，0.2‑500mM/L NADH，助溶剂，1‑300 mg/L的所述氨基酸脱氢酶 。

说明书

一种氨基酸脱氢酶及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种氨基酸脱氢酶及其应用。

背景技术

[0002] 手性氨基酸，包括天然氨基酸和非天然氨基酸，是合成手性药物、手性农药和手性食品添加剂等精细化学品的关键中间体。例如，D‑苯甘氨酸是β‑内酰胺类半合成抗生素的
重要中间体，作为氨苄青霉素、匹夫氨苄等的重要侧链，市场前景广阔。高苯丙氨酸(L‑
Homophenylalanine)，即(S)‑2‑氨基‑4‑苯基丁酸是一种非天然的手性α‑氨基酸，该氨基酸
是20种全球已上市的抗高血压药物血管紧张素抑制剂普利类药物，例如贝那普利、西拉普
利、赖若普利、依那普利、地那普利及卡托普利等用于治疗高血压和各种心血管疾病的血管
紧张素转换酶抑制剂普利类药物合成的共同手性中间体，作为常见的结构单元起着中心药
效基团的作用。年需求量约1000吨且逐年递增。制备大位阻非天然氨基酸主要通过化学合
成法和酶催化法。化学合成法存在诸多不足，反应过程复杂；反应条件苛刻；生成成本高；环
境污染严重等。酶催化法具有高立体选择性，生产过程简单，反应安全等优势。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种氨基酸脱氢酶。

[0004] 本发明的另一目的在于提供上述氨基酸脱氢酶的应用。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 一种氨基酸脱氢酶，对如SEQ ID NO.01所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，上述突变包括如下至少之一：

[0007] 将第57位的L突变为E、第60位的G突变为S或T、将第76位的K突变为S、将第285位的Y突变为L或M、将第288位的N突变为E和将第333位的M突变为D或R。

[0008] 在本发明的一个优选实施方案中，所述氨基酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示。

[0009] 进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第57位的L突变为E所用的引物为L57E‑F和L57E‑R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.03和04所示。

[0010] 进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中，将第60位的G突变为S所用的引物为G60S‑F和G60S‑R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.05和06所示，将第60位的G突变为T所用
的引物为G60T‑F和G60T‑R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.07和08所示。

[0011] 进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第76位的K突变为S所用的引物为K76S‑F和K76S‑R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.09和10所示。

[0012] 进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第285位的Y突变为L所用的引物为Y285L‑F和Y285L‑R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11和12所示，将第285位的Y突变为M所
用的引物为Y285M‑F和Y285 M‑R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13和14所示。

[0013] 进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第288位的N突变为E所用的引物为N288E‑F和N288E‑R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15和16所示

[0014] 进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第333位的M突变为D所用的引物为M333D‑F和M333D‑R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.17和18所示，将第333位的M突变为R所
用的引物为M333R‑F和M333R‑R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19和20所示。

[0015] 本发明的另一技术方案如下：

[0016] 上述氨基酸脱氢酶在催化制备非天然氨基酸中的应用。

[0017] 在本发明的一个优选实施方案中，构建反应体系，于10‑70℃且100‑300rpm的转速震荡反应10‑100h，获得所述非天然氨基酸；

[0018] 上述反应体系包括如下：

[0019] 以pH＝8‑10的甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液为溶剂，其中含有：0.001‑1mol/L酮酸或酮酸酯，0.2‑500mM/L NADH，助溶剂，1‑300mg/L的所述氨基酸脱氢酶。

[0020] 本发明的有益效果是：

[0021] 1、本发明通过对获得自海洋菌株Bacillus nanhaiensis(CGMCC NO.8969)的苯丙氨酸脱氢酶的分子改造，使其底物结合口袋发生了重塑，不仅可以容纳这些大位阻底物，同
时拉近了底物与辅酶之间的距离，使其获得对大位阻底物的催化活性，拓展了其催化功能
用于生物合成系列具有大位阻疏水侧链的非天然氨基酸。

[0022] 2、本发明操作方便，具有产品光学纯度高、收率高等优点，设备简单，在生物催化制备非天然氨基酸领域具有较好的工业应用前景。

附图说明

[0023] 图1苯丙氨酸脱氢酶基因单点突变电泳图。

[0024] 图2部分苯丙氨酸脱氢酶基因单点突变SDS‑PAGE电泳图。

[0025] 图3苯丙氨酸脱氢酶部分基因组合突变电泳图。

具体实施方式

[0026] 以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

[0027] 实施例1：

[0028] 构建单点突变(G60S)的氨基酸脱氢酶突变体，对60位氨基酸进行突变，具体步骤如下：

[0029] (1)引入突变：根据SEQ ID NO.02所示的核苷酸设计引物，设计包含有不同位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：

[0030] 上游引物(SEQ ID NO.05)：G60S‑F GTGCTGAGATTGTCAAAATCAATG

[0031] 下游引物(SEQ ID NO.06)：G60S‑R TGATTTTGACAATCTCAGCACATC

[0032] 将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD‑Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物，如图1所示。

[0033] (2)粗酶液的制备：构建可表达带His‑tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的重组表达菌株：苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)基因的原始序列来自Bacillus nanhaiensis，如SEQ ID NO.01
所示；根据上述原始序列和所示的上下游引物，采用PCR法构建5’端和3’端分别带有NdeI和
Xhol酶切位点的苯丙氨酸脱氢酶基因，PCR合成过程由上海生工生物工程技术服务有限公
司完成。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收PheDH基因片段，用NdeI和XhoI
酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pET‑28a质粒(带有His‑tag标签)进行
连接，连接好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到pET28a‑PheDH质粒。将上述质粒转化
至E.coli BL21(DE3)，得到可表达带His‑tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的重组表达菌株
E.coli BL21(DE3)/pET28a。

[0034] 重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200mLLB培养基中。LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母浸膏，10g/LNaCl。培养
条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6
小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/mL，继续在25℃、200rpm条件下培养12小时。培
养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉
淀用磷酸缓冲液(pH＝7)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，用磷酸缓冲液(pH 7)配制成
浓度为50g/L的细胞悬液。将制备的细胞悬液置于冰浴中，利用超声破碎仪对细胞液进行处
理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声3秒，间隔6秒，超声60次，功率200W。然
后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有带His‑tag标签的苯丙氨
酸脱氢酶的粗酶液。

[0035] (3)氨基酸脱氢酶制备：采用GE公司的His Trap镍柱(HistrapTM HP，5mL)对步骤(1)得到的粗酶液进行分离纯化，并用PALL公司的10K的超滤离心管进行超滤除盐。所述的
纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His‑tagged标签的蛋白质的HisTrap HP柱，
其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除
盐；除盐后获得的液体即为纯化的带His‑tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的纯酶溶液。纯化后的
酶液SDS‑page图如图2所示。

[0036] (4)酶活力检测：催化反应体系包含40mM NADH、0.2mol/L甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液(pH 9.5)，助溶剂为20％的异丙醇，40mM的2‑氧代‑4‑苯基丁酸乙酯和20mg/ml酶，37℃下
反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol 
+
NAD所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为0.192U/mg。

[0037] (5)产物分析：利用NMR进行步骤(4)的酶活力检测后的产物分析，获得NMR图谱为1
H NMR：δ1.86‑1.98(2H，1.92(dt，J＝7.6，7.4Hz)，1.92(dt，J＝7.6，7.4Hz))，2.61‑2.69
(2H，2.65(t，J＝7.4Hz)，2.65(t，J＝7.4Hz))，3.44(1H，t，J＝7.6Hz)，7.14‑7.21(3H，7.18
(tt，J＝7.7，1.3Hz)，7.17(dddd，J＝7.8，1.3，1.1，0.5Hz))，7.26(2H，dddd，J＝7.8，7.7，
1.8，0.5Hz).符合L‑高苯丙氨酸的特征。

[0038] 实施例2

[0039] 构建单点突变(K76S)的氨基酸脱氢酶突变体，对76位氨基酸进行突变，具体步骤如下：

[0040] (1)引入突变：根据SEQ ID NO.02所示的核苷酸设计引物，设计包含有不同位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：

[0041] 上游引物(SEQ ID NO.9)：K76S‑F CTTCGGTGGAGGTTCATCGGTCAT

[0042] 下游引物(SEQ ID NO.10)：K76S‑R GAACCTCCACCGAAGTCAACATCT

[0043] 将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD‑Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物，如图1所示。

[0044] 实验步骤(2)‑(3)如实施例1的步骤(2)‑(3)。

[0045] (4)酶活力检测：催化反应体系包含100mM NADH、0.4mol/L甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液(pH 10.5)，助溶剂为10％的乙腈，40mM的L‑2‑羰基‑5‑苯基戊酮酸和50mg/ml酶，37℃
下反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μ
+
mol NAD所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为0.103U/mg。

[0046] (5)利用NMR进行步骤(4)的酶催化产物分析，获得NMR图谱为1H NMR：δ1.67‑1.90(4H，1.75(tt，J＝7.4，7.3Hz)，1.84(dt，J＝7.6，7.4Hz)，1.84(dt，J＝7.6，7.4Hz)，1.75
(tt，J＝7.4，7.3Hz))，2.56‑2.65(2H，2.60(t，J＝7.3Hz)，2.60(t，J＝7.3Hz))，3.43(1H，t，
J＝7.6Hz)，7.14‑7.20(3H，7.18(tt，J＝7.7，1.3Hz)，7.17(dddd，J＝7.8，1.3，1.1，
0.5Hz))，7.26(2H，dddd，J＝7.8，7.7，1.8，0.5Hz).符合L‑2‑氨基‑5‑苯基戊酸的特征。

[0047] 实施例3

[0048] 构建单点突变(M333D)的氨基酸脱氢酶突变体，对333位氨基酸进行突变，具体步骤如下：

[0049] (1)引入突变：根据SEQ ID NO.02所示的核苷酸设计引物，设计包含有不同位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：

[0050] 上游引物(SEQ ID NO.17)：M333D‑FCAGATATCTACGGATGAAGCAGCA

[0051] 下游引物(SEQ ID NO.18)：M333D‑R ATCCGTAGATATCTGGTTCTTTGT

[0052] 将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD‑Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物。

[0053] 实验步骤(2)‑(3)如实施例1的步骤(2)‑(3)。

[0054] (4)酶活力检测：催化反应体系包含20mM NADH、0.2mol/L甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液(pH 8.0)，助溶剂为15％的吐温‑80，80mM的L‑2‑壬酮酸和10mg/ml酶，50℃下反应，340nm
+
波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol NAD所需
要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为0.362U/mg。

[0055] (5)利用NMR进行步骤(4)的酶催化的产物分析，获得NMR图谱为1H NMR：δ0.86(3H，t，J＝7.0Hz)，1.16‑1.38(9H，1.28(quint，J＝7.0Hz)，1.28(h，J＝7.0Hz)，1.24(quint，J＝
7.0Hz)，1.24(quint，J＝7.0Hz)，1.23(quint，J＝7.0Hz)，1.23(quint，J＝7.0Hz)，1.30
(tt，J＝7.4，7.0Hz)，1.30(tt，J＝7.4，7.0Hz)，1.28(quint，J＝7.0Hz))，1.28(1H，h，J＝
7.0Hz)，1.59‑1.71(2H，1.65(td，J＝7.4，7.3Hz)，1.65(td，J＝7.4，7.3Hz))，3.43(1H，t，J
＝7.3Hz).符合产物L‑2‑氨基壬酸的特征。

[0056] 实施例4

[0057] 构建单点突变(M333R)的氨基酸脱氢酶突变体，对333位氨基酸进行突变，具体步骤如下：

[0058] (1)引入突变：根据SEQ ID NO.02所示的核苷酸设计引物，设计包含有不同位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：

[0059] 上游引物(SEQ ID NO.19)：M333R‑FCAGATATCTACGCGTGAAGCAGCA

[0060] 下游引物(SEQ ID NO.20)：M333R‑RACGCGTAGATATCTGGTTCTTTGT

[0061] 将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD‑Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物。

[0062] 实验步骤(2)‑(3)参照实施例1的步骤(2)‑(3)。

[0063] (4)酶活力检测：催化反应体系包含10mM NADH、0.2mol/L甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液(pH 9.0)，助溶剂为30％的异丙醇，20mM的2‑氧代‑4‑苯基丁酸乙酯和20mg/ml酶，20℃下
反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol 
+
NAD所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为0.054U/mg。

[0064] (5)利用NMR进行步骤(4)的酶活力检测后的产物分析，获得NMR图谱同实施例1，符合的L‑高苯丙氨酸的特征。

[0065] 实施例5

[0066] 构建单点突变(Y285L)的氨基酸脱氢酶突变体，对285位氨基酸进行突变，具体步骤如下：

[0067] (1)引入突变：根据SEQ ID NO.02所示的核苷酸设计引物，设计包含有不同位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：

[0068] 上游引物(SEQ ID NO.11)：Y285L‑F TACGGACCCGATCTCATCGTGAAC

[0069] 下游引物(SEQ ID NO.12)：Y285L‑R GAGATCGGGTCCGTATAAAATTCC

[0070] 将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD‑Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物。

[0071] 实验步骤(2)‑(3)参照实施例1的步骤(2)‑(3)。

[0072] (4)酶活力检测：催化反应体系包含100mM NADH、0.5mol/L甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液(pH 11)，助溶剂为20％的乙醇，60mM的L‑2‑羰基‑3‑苯基丁酮酸和80mg/ml酶，40℃下
反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol 
+
NAD所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为0.032U/mg。

[0073] (5)利用NMR进行步骤(4)的酶催化的产物分析，获得NMR图谱1H NMR：61.26(3H，d，J＝6.7Hz)，3.18(1H，dq，J＝7.1，6.7Hz)，3.64(1H，d，J＝7.1Hz)，7.21(2H，dddd，J＝7.8，
1.3，1.2，0.5Hz)，7.28‑7.40(3H，7.35(dddd，J＝7.8，7.7，1.9，0.5Hz)，7.31(tt，J＝7.7，
1.3Hz)).符合产物L‑2‑氨基‑3‑苯基丁酸的特征。

[0074] 实施例6：

[0075] 构建单点突变(L57E)的氨基酸脱氢酶突变体，对57位氨基酸残基进行突变，具体步骤如下：

[0076] (1)引入突变：根据SEQ ID NO.02所示的核苷酸设计引物，设计包含有不同位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：

[0077] 上游引物(SEQ ID NO.03)：L57E‑F GATGTGCTGAGAGAATCAAAAGGT

[0078] 下游引物(SEQ ID NO.04)：L57E‑R TTCTCTCAGCACATCCTCAAGTGC

[0079] 将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD‑Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物。

[0080] 实验步骤(2)‑(3)参照实施例1的步骤(2)‑(3)。

[0081] (4)酶活力检测：催化反应体系包含60mM NADH、0.2mol/L甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液(pH 9)，助溶剂为10％的甲醇，70mM的邻甲基苯丙酮酸和30mg/ml酶，37℃下反应，340nm
+
波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol NAD所需
要的酶量为一个酶活力单位。测定无酶活。

[0082] 实施例7

[0083] 构建单点突变(Y285M)的氨基酸脱氢酶突变体，对288位氨基酸残基进行突变，具体步骤如下：

[0084] (1)引入突变：根据SEQ ID NO.02所示的核苷酸设计引物，设计包含有不同位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：

[0085] 上游引物(SEQ ID NO.13)：Y285M‑FTACGGACCCGATATGATCGTGAAC

[0086] 下游引物(SEQ ID NO.14)：Y285M‑R CATATCGGGTCCGTATAAAATTCC

[0087] 将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD‑Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物。

[0088] 实验步骤(2)‑(3)参照实施例1的步骤(2)‑(3)。

[0089] (4)酶活力检测：催化反应体系包含120mM NADH、0.3mol/L甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液(pH 9)，助溶剂为30％的二甲基亚砜，100mM的对甲基苯丙酮酸和70mg/ml酶，37℃下反
应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol 
+
NAD所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为0.02U/mg。

[0090] (5)利用NMR进行步骤(4)的酶催化产物分析，获得NMR图谱1H NMR：δ2.25(3H，s)，2.99‑3.04(2H，3.01(d，J＝7.6Hz)，3.01(d，J＝7.6Hz))，3.64(1H，t，J＝7.6Hz)，7.02(2H，
ddd，J＝8.0，1.2，0.5Hz)，7.20(2H，ddd，J＝8.0，1.4，0.5Hz)符合的L‑对甲基苯丙氨酸的特
征。

[0091] 实施例8

[0092] 在实施例2的突变K76S的基础上进一步设计G60T的叠加突变，获得G60T/K76S双突变体。

[0093] (1)引入突变：根据SEQ ID NO.02所示的核苷酸设计引物，设计包含有不同位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：

[0094] 上游引物(SEQ ID NO.07)：G60T‑F AGATTGTCAAAAACTATGACATAC

[0095] 下游引物(SEQ ID NO.08)：G60T‑R AGTTTTTGACAATCTCAGCACATC

[0096] 将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD‑Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物。

[0097] 实验步骤(2)‑(3)参照实施例1的步骤(2)‑(3)。

[0098] (4)酶活力检测：催化反应体系包含40mM NADH、0.2mol/L甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液(pH 9.5)，助溶剂为10％的二甲基亚砜，30mM的2‑氧代‑4‑苯基丁酸乙酯和20mg/ml酶，37
℃下反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1
+
μmol NAD所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为1.245U/mg。

[0099] (5)利用NMR进行步骤(4)的酶催化后的产物分析，获得NMR图谱同实施例1和4，符合L‑高苯丙氨酸的特征图谱。

[0100] 实施例9

[0101] (1)在实施例5的Y285L的基础上进一步设计氨基酸引物序列(K76S)进行叠加突变，获得K76S/Y285L双突变体。引物序列见实施例2和实施例5。将引物和模板质粒混合后，
加入高保真Taq聚合酶KOD‑Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物。

[0102] 实验步骤(2)‑(3)参照实施例1的步骤(2)‑(3)。

[0103] (4)酶活力检测：催化反应体系包含40mM NADH、0.2mol/L甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液(pH 9.5)，助溶剂为10％的丙酮，50mM的对乙基苯丙酮酸和20mg/ml酶，37℃下反应，
+
340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol NAD
所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为0.031U/mg。

[0104] (5)利用NMR进行步骤(4)的酶活力检测后的产物分析，获得NMR图谱，1H NMR：δ1.06(3H，t，J＝7.5Hz)，2.62‑2.67(2H，2.65(q，J＝7.5Hz)，2.65(q，J＝7.5Hz))，2.99‑3.04
(2H，3.01(d，J＝7.6Hz)，3.01(d，J＝7.6Hz))，3.64(1H，t，J＝7.6Hz)，7.13‑7.19(4H，7.16
(ddd，J＝8.0，1.4，0.5Hz)，7.16(ddd，J＝8.0，1.3，0.5Hz)).符合L‑对乙基苯丙氨酸的特征
图谱。

[0105] 实施例10

[0106] 在实施例9的K76S/Y285L的基础上进一步设计氨基酸引物序列N288E进行叠加突变，获得K76S/Y285L/N288E三点突变体。

[0107] (1)引入突变：根据SEQ ID NO.02所示的核苷酸设计引物，设计包含有不同位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：

[0108] 上游引物(SEQ ID NO.15)：N288E‑F GATTATATCGTGGAGGCAGGAGGG

[0109] 下游引物(SEQ ID NO.16)：N288E‑R CTCCACGATATAATCGGGTCCGTA

[0110] 将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD‑Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物。

[0111] 实验步骤(2)‑(3)参照实施例1的步骤(2)‑(3)。组合突变蛋白电泳图如图3所示。

[0112] (4)酶活力检测：催化反应体系包含50mM NADH、0.5mol/L甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液(pH 9.0)，助溶剂为30％的乙腈，25mM的2‑氧代‑4‑苯基丁酸乙酯和80mg/ml酶，20℃下反
应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol 
+
NAD所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为1.445U/mg。

[0113] (5)利用NMR进行步骤(4)的酶催化后的产物分析，图谱同实施例1、4和8，符合L‑高苯丙氨酸的特征图谱。

[0114] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。