桑树植原体ltrA基因及其在桑树植原体分子检测中的应用

摘要

本发明公开了桑树植原体ltrA基因及其在桑树植原体分子检测中的应用。本发明首先提供了一种桑树植原体的ltrA基因，该基因可用于桑树植原体的检测。并以ltrA基因为靶基因设计了一组桑树植原体特异性检测引物，进一步构建了桑树植原体检测用试剂盒和检测方法，该方法以及试剂盒的操作简便快速，检测结果准确可靠，特异性强、灵敏度高，检测灵敏度高达1.0×10‑6ng/μL，能够在桑树植原体引起的相关病害出现明显的病症、病害大爆发前，及时对桑园中桑树植原体引起的相关病害进行监测和控制，为检验检疫工作提供了技术支持，具有非常好的推广应用前景。

权利要求

1.一种桑树植原体的ltrA基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种桑树植原体特异性检测引物，其特征在于，所述特异性检测引物由上游引物

927F和下游引物1538R组成，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

3.一种桑树植原体检测用阳性对照质粒，其特征在于，所述阳性对照质粒为质粒pMD™

19‑ltrA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种权利要求3所述阳性对照质粒的构建用引物，其特征在于，所述构建用引物由上游引物ltrA F和下游引物ltrA R组成，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

5.权利要求2所述特异性检测引物和权利要求3所述阳性对照质粒的组合在桑树植原体分子检测或制备桑树植原体分子检测产品中的应用。

6.一种桑树植原体检测用试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的特异性检测引物和权利要求3所述的阳性对照质粒。

7.一种桑树植原体检测方法，其特征在于，该方法是检测待测样品核酸中是否存在权利要求1所述ltrA基因，若存在，则待测样品为桑树植原体阳性。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，以待测样品核酸为模板，利用权利要求2所述特异性检测引物进行PCR扩增反应，以权利要求3所述阳性对照质粒作为对照，若扩增结果为阳性，则代表待测样品为桑树植原体阳性。

说明书

桑树植原体ltrA基因及其在桑树植原体分子检测中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于病原分子检测技术领域。更具体地，涉及桑树植原体ltrA基因及其在桑树植原体分子检测中的应用。

背景技术

[0002] 植原体(Candidatus phytoplasma)在分类上属细菌界(Bacteria)，硬壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)，非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)，非固醇菌
原体科(Acholeplasmataceae)；对四环素类的抗生素敏感，细胞通常呈圆形或椭圆形，没有
细胞壁，在细胞质外具有单层膜，细胞质内有颗粒状的核糖体、可溶性蛋白质、RNA及代谢物
等。植原体细胞没有细胞核，基因组是双链闭合环状的DNA，属于革兰氏阳性菌。植原体与
1000多种植物病害有关，包括一些重要的园艺作物病害，如葡萄黄化病、草莓黄化病、洋葱
黄化病等，其主要症状包括丛枝、黄化、花变叶、花器褪化等，严重时引起植株早衰，直至整
株枯死，造成大量经济损失。中国也报道了100多种与植原体相关的植物病害，其中比较重
要的有枣疯病、泡桐丛枝病、小麦蓝矮病等。桑树植原体属于翠菊黄化病组(Aster yellows 
groups)B亚组。植原体虽然可以进行体外微量培养，但其培养条件苛刻，人工培养困难，导
致植原体至今未能成功的大量分离培养，阻碍了植原体的快速检测研究进展。

[0003] 目前，桑树植原体引起的相关病害大多通过发病后的病症来判断，分子检测手段应用较少。而随着分子生物学的发展，分子检测技术以其快速、灵敏等优势逐渐成为重要检
测手段。现有技术中，刘清神等采用植原体16S‑23S rDNA序列而设计的通用引物和巢式引
物，建立了快速准确的桑树植原体的巢式PCR检测技术；但是，该巢式PCR检测技术存在检测
过程复杂、检测特异性和灵敏性低等缺点，不利于在基层检测单位中推广和使用。因此，亟
需进一步研究探索出一种适用范围广、简单、快速和准确的检测桑树植原体的方法。

[0004] 因此，选择合适的基因区段作为靶基因，建立一种适用范围广、简单、快速准确、特异性的检测桑树植原体的方法，对于监测和控制桑树植原体引起的相关病害具有重要意
义。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有桑树植原体检测技术的缺陷和不足，提供一种桑树植原体ltrA基因及其在桑树植原体分子检测中的应用。

[0006] 本发明能够在桑树植原体引起的相关病害出现明显的病症、病害大爆发前，检测桑树植原体的存在，且在桑树植原体含量极低的情况下也能准确的检测出其存在，进而及
时对桑园中桑树植原体引起的相关病害及时监测和控制。具体是以桑树植原体的ltrA基因
为靶基因，经过大量的研究和探索，科学的设计出了桑树植原体特异性检测引物，建立了快
速检测桑树植原体的方法；该方法的检测结果准确可靠，操作简便快速，检测特异性强、灵
敏度高，在桑树植原体引起的相关病害的实际监测和控制中具有广泛的应用价值和重要意
义。

[0007] 本发明的第一个目的是提供一种桑树植原体的ltrA基因。

[0008] 本发明的第二个目的是提供所述ltrA基因或其片段在桑树植原体分子检测或制备桑树植原体分子检测产品中的应用。

[0009] 本发明的第三个目的是提供一种桑树植原体特异性检测引物。

[0010] 本发明的第四个目的是提供一种桑树植原体检测用阳性对照质粒。

[0011] 本发明的第五个目的是提供一种所述阳性对照质粒的构建用引物。

[0012] 本发明的第六个目的是提供所述特异性检测引物、所述阳性对照质粒或所述构建用引物在桑树植原体分子检测或制备桑树植原体分子检测产品中的应用。

[0013] 本发明的第七个目的是提供一种桑树植原体检测用试剂盒。

[0014] 本发明的第八个目的是提供一种桑树植原体检测方法。

[0015] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0016] 本发明首先提供了一种桑树植原体的ltrA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0017] 所述ltrA基因或其片段在桑树植原体分子检测中的应用，以及在制备桑树植原体分子检测产品中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

[0018] 基于本发明对桑树植原体的ltrA基因的研究和针对性分析总结，选择ltrA基因为靶基因，设计出了一种桑树植原体特异性检测引物，分别为上游引物927F和下游引物
1538R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

[0019] 上游引物927F的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：5’‑AAAGGTGGTGTCCTGGTTAG‑3’；

[0020] 下游引物1538R的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：5’‑GTGCGACCTAGGAAGGTATTT‑3’。

[0021] 本发明还提供了一种桑树植原体检测用阳性对照质粒，所述阳性对照质粒的序列包含ltrA基因序列。可以是全长序列，也可以是部分序列。当为部分序列时，需覆盖检测引
物组的扩增区段。

[0022] 所用载体可为本领域常用载体，如pMDTM19。

[0023] 即一种桑树植原体检测用阳性对照质粒pMDTM19‑ltrA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0024] 本发明还提供了一种所述阳性对照质粒的构建用引物，分别为上游引物ltrAF和下游引物ltrA R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

[0025] 上游引物ltrA的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)：5’‑ATGCAAATGCAACCAAC‑3’；

[0026] 下游引物ltrA R的核苷酸序列(SEQ  ID NO.6)：5’‑TTATTCAGACGTATTTA TTTTTCTTT‑3’。

[0027] 所述特异性检测引物的特异性强、灵敏度高，基于该引物能够简便、快速的检测桑树植原体，对于监测和控制桑树植原体引起的相关病害具有重要意义。

[0028] 因此，所述特异性检测引物、所述阳性对照质粒或所述构建用引物在桑树植原体分子检测或制备桑树植原体分子检测产品中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

[0029] 本发明还提供了一种桑树植原体检测用试剂盒，包含所述的特异性检测引物或所述的构建用引物。

[0030] 优选地，所述试剂盒还包括DNA提取所需试剂或PCR扩增反应所需试剂。

[0031] 另外，本发明还提供了一种桑树植原体检测方法，该方法是检测待测样品核酸中是否存在所述ltrA基因，若存在，则待测样品为植原体阳性。

[0032] 优选地，以待测样品核酸为模板，利用可用于扩增所述ltrA基因的引物进行PCR扩增反应，以所述阳性对照质粒作为对照，若扩增结果为阳性，则代表待测样品为植原体阳
性。

[0033] 更优选地，所述可用于扩增ltrA基因的引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示特异性检测引物，或SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示构建用引物。

[0034] 其中，当引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示特异性检测引物时，扩增片段大小为611bp；当引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示构建用引物时，扩增片段大小为
1758bp。

[0035] 其中，所述待测样品为桑叶样品。

[0036] 优选地，所述PCR扩增反应的体系为：

[0037]

[0038] 其中，所述2×反应缓冲液的组分为：Taq DNA聚合酶，160mM Tris‑HCl，40mM(NH4)2SO4，3.0mM MgCl2，400μM dNTP。

[0039] 优选地，所述PCR扩增反应的程序为：94℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃45s，32个循环；72℃10min。

[0040] 本发明具有以下有益效果：

[0041] 本发明提供了桑树植原体ltrA基因及其在桑树植原体分子检测中的应用。本发明以桑树植原体的ltrA基因为靶基因，经过大量的研究和探索，科学的设计出了桑树植原体
‑6
特异性检测引物，该引物的特异性强、灵敏度高，检测灵敏度高达1.0×10 ng/μL，基于该引
物能够简便、快速的检测桑树植原体，对于监测和控制桑树植原体引起的相关病害具有重
要的指导意义。

[0042] 基于上述引物，本发明还提供了快速检测桑树植原体的方法以及检测用试剂盒，该方法以及试剂盒的操作简便快速，检测结果准确可靠，能够在桑树植原体引起的相关病
害出现明显的病症、病害大爆发前，检测桑树植原体的存在，且在桑树植原体含量极低的情
况下也能准确的检测出其存在，进而及时对桑园中桑树植原体引起的相关病害进行监测和
控制，为桑树植原体的检测，尤其是检验检疫工作提供了技术支持，在桑树植原体引起的相
关病害的实际监测和控制中具有非常好的推广应用前景。

附图说明

[0043] 图1是基于桑树植原体的ltrA基因的氨基酸序列构建的系统发育树结果图。

[0044] 图2是基于桑树植原体的16s rRNA基因的核苷酸序列构建的系统发育树结果图。

[0045] 图3是上游引物927F和下游引物1538R用于桑树植原体检测的特异性验证结果图；TM
其中，M代表TaKaRa DL1000 Marker；1代表阳性对照质粒pMD 19‑ltrA；2代表桑花叶型萎缩
病相关病毒；3代表桑脉带相关病毒；4代表桑青枯病病原菌‑茄科劳尔式菌；5代表桑枯萎病
病原菌‑阴沟肠杆菌；6代表桑菌核病病原菌‑肉阜状杯盘菌；7代表桑里白粉病病原菌‑桑球
针壳；8代表健康桑叶提取的DNA；9代表患桑树植原体病症桑叶提取的DNA；10代表水。

[0046] 图4是上游引物927F和下游引物1538R用于桑树植原体检测的灵敏性验证结果图；‑1
其中，M代表TaKaRa DL1000 Marker；1～7分别代表DNA浓度分别为1.0×10 ng/μL、1.0×
‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6 ‑
10 ng/μL、1.0×10 ng/μL、1.0×10 ng/μL、1.0×10 ng/μL、1.0×10 ng/μL、1.0×10
7 ‑8
ng/μL、1.0×10 ng/μL；8代表ddH2O。

[0047] 图5是对不同地区的桑树病叶进行桑树植原体检测结果图；其中，M代表TaKaRa DL1000 Marker；1代表健康桑叶提取的DNA；2～10分别代表华南农业大学桑园病叶、广东省
农业科学院蚕业研究所病叶、广东省翁源县桑病叶、广东省英德市桑病叶、广西省柳城县凤
山镇示范区桑病叶、广西省宾阳县桑病叶、广西省柳城县冲脉镇桑病叶、云南省曲靖市盘江
TM
镇桑病叶、云南蒙自市草坝镇桑病叶；11代表阳性对照质粒pMD 19‑ltrA。

具体实施方式

[0048] 以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0049] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0050] 实施例1桑树植原体的ltrA基因全长核苷酸序列的获得

[0051] 1、实验方法

[0052] 利用高通量测序的方法获得桑树植原体的ltrA基因全长核苷酸序列，对ltrA基因进行注释，并进行序列比对分析，构建系统发育树。

[0053] 2、实验结果

[0054] 桑树植原体的ltrA基因的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其全长核苷酸序列的长度为1758bp，ltrA基因注释的结果如表1所示。

[0055] 表1 ltrA基因注释的结果

[0056]

[0057] 对桑树植原体的ltrA基因的全长核苷酸序列进行序列比对分析，发现桑树植原体的ltrA基因的全长核苷酸序列与NCBI中的其他核苷酸序列一致性均低于75％，具有显著的
差异性；另外，在氨基酸水平上，对桑树植原体的ltrA基因的氨基酸序列进行序列比对分
析，发现桑树植原体的ltrA基因的氨基酸序列与NCBI中的其他氨基酸序列具有同源性，但
是同源性均低于75％，具有显著的差异性，推测植原体的ltrA基因在核酸与氨基酸水平上
的差异与寄主的选择侵染具有一定的关联。

[0058] 另外，基于桑树植原体的ltrA基因的氨基酸序列构建的系统发育树结果如图1所示，基于桑树植原体的16s rRNA基因的核苷酸序列构建的系统发育树结果如图2所示，证实
了植原体的ltrA基因的氨基酸序列有明显的分支，具有很高的特异性，进一步说明植原体
的ltrA基因的氨基酸序列在寄主的选择侵染上具有显著的差异性。

[0059] 实施例2检测引物设计及PCR扩增方法的建立

[0060] 1、引物设计

[0061] 在实施例1获得的桑树植原体的ltrA基因全长核苷酸序列的基础上，以ltrA基因为靶基因，优化筛选出了用于桑树植原体检测的特异性检测引物：上游引物927F和下游引
物1538R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；以及用于桑树植原体检测
的阳性对照质粒的构建用引物，分别为上游引物ltrA F和下游引物ltrA R，其核苷酸序列
分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

[0062] 上游引物927F的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：5’‑AAAGGTGGTGTC CTGGTTAG‑3’；

[0063] 下游引物1538R的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：5’‑GTGCGACCTAG GAAGGTATTT‑3’；

[0064] 上游引物ltrA的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)：5’‑ATGCAAATGCAACCAAC‑3’；

[0065] 下游引物ltrA R的核苷酸序列(SEQ  ID NO.6)：5’‑TTATTCAGACGTATTTA TTTTTCTTT‑3’。

[0066] 2、PCR扩增方法的建立

[0067] 提取桑叶样品的总DNA为模板，分别利用上述特异性检测引物(上游引物927F和下游引物1538R、上游引物ltrA F和下游引物ltrA R)进行PCR扩增反应。

[0068] (1)上游引物927F和下游引物1538R的PCR扩增反应体系和程序为：

[0069] PCR扩增反应的体系为：

[0070]

[0071] 其中，所述2×反应缓冲液的组分为：Taq DNA聚合酶，160mM Tris‑HCl，40mM(NH4)2SO4，3.0mM MgCl2，400μM dNTP。

[0072] PCR扩增反应的程序为：94℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃45s，32个循环；72℃10min。

[0073] (2)上游引物ltrA F和下游引物ltrA R的PCR扩增反应体系和程序为：

[0074] PCR扩增反应的体系为：

[0075]

[0076] 其中，所述2×反应缓冲液的组分为：Taq DNA聚合酶，160mM Tris‑HCl，40mM(NH4)2SO4，3.0mM MgCl2，400μM dNTP。

[0077] PCR扩增反应的程序为：94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃60s，32个循环；72℃10min。

[0078] 3、结果判断

[0079] 利用琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增反应产物，若上游引物927F和下游引物1538R的PCR扩增反应产物的片段大小为611bp，则待测样品中含有桑树植原体；反之，则无；
若上游引物ltrA F和下游引物ltrA R的PCR扩增反应产物的片段大小为1758bp，则待测样
品中含有桑树植原体；反之，则无。

[0080] 实施例3阳性对照质粒pMDTM19‑ltrA的构建

[0081] 桑树植原体的ltrA基因的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明对桑树植原体的ltrA基因的研究和针对性分析总结，设计扩增包含桑树植原体的ltrA基因的全长核
苷酸序列的引物，包括上游引物927F和下游引物1538R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2
和SEQ ID NO.3所示，PCR扩增反应体系和程序如实施例2所示，按照Takara生物公司
TM TM
pMD 19‑T Vector Cloning Kit试剂盒构建阳性对照质粒pMD 19‑ltrA，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.4所示。

[0082] 实施例4上游引物927F和下游引物1538R用于桑树植原体检测的特异性验证

[0083] 1、实验方法

[0084] 分别以患桑树植原体病症桑叶提取的DNA，本实验室保存的桑树病原DNA(本领域技术人员可以采用其他常规渠道获得的病原)：桑花叶型萎缩病相关病毒(Mulberry 
Mosaic Draft  Associated Virus)、桑脉带相关病毒(Mulberry Vein Banding 
Associated Virus)、桑青枯病病原菌‑茄科劳尔式菌(Ralstonia solanacearum)、桑枯萎
病病原菌‑阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、桑菌核病病原菌‑肉阜状杯盘菌(Ciboria 
carunculoides)、桑里白粉病病原菌‑桑球针壳(Phyllactinia moricola)，以及健康桑叶
TM
提取的DNA作为模板，以实施例3构建得到的阳性对照质粒pMD 19‑ltrA作为阳性对照，以
ddH2O作为阴性对照；利用上游引物927F和下游引物1538R，以实施例2所述反应体系和程序
进行PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增反应产物。

[0085] 2、实验结果

[0086] 上游引物927F和下游引物1538R用于桑树植原体检测的特异性验证结果如图3所TM
示，可以看出，只有患桑树植原体病症桑叶提取的DNA才能扩增出与阳性对照质粒pMD 19‑
ltrA相同长度(611bp)的条带。结果显示，上游引物927F和下游引物1538R能够检测桑树植
原体，且检测特异性强。

[0087] 实施例5上游引物927F和下游引物1538R用于桑树植原体检测的灵敏性验证

[0088] 1、实验方法

[0089] 提取患桑树植原体病症桑叶的DNA，原始浓度为1.0×10‑1ng/μL，将上述DNA用1×2 3 4 5 6 7 ‑1
TE进行稀释，分别稀释10、10、10、10、10、10、10倍，即得到DNA浓度分别为1.0×10 ng/μ
‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6
L、1.0×10 ng/μL、1.0×10 ng/μL、1.0×10 ng/μL、1.0×10 ng/μL、1.0×10 ng/μL、1.0
‑7 ‑8
×10 ng/μL、1.0×10 ng/μL；以上述各浓度的DNA作为模板，以ddH2O作为阴性对照，利用上
游引物927F和下游引物1538R，以实施例2所述反应体系和程序进行PCR扩增反应，琼脂糖凝
胶电泳检测上述PCR扩增反应产物。

[0090] 2、实验结果

[0091] 上游引物927F和下游引物1538R用于桑树植原体检测的灵敏性验证结果如图4所‑1 ‑6
示，可以看出，当DNA浓度为1.0×10 ～1.0×10 ng/μL时，均能够扩增出长度为611bp的条
‑7 ‑8
带，而当DNA浓度为1.0×10 ～1.0×10 ng/μL时，没有扩增出条带。结果显示，上游引物
‑6
927F和下游引物1538R能够检测桑树植原体，且检测灵敏度高达1.0×10 ng/μL。

[0092] 实施例6对不同地区的桑树病叶进行桑树植原体检测

[0093] 1、实验材料的选取

[0094] 随机选取各地区的包括华南农业大学桑园病叶、广东省农业科学院蚕业研究所病叶、广东省翁源县桑病叶、广东省英德市桑病叶、广西省柳城县凤山镇示范区桑病叶、广西
省宾阳县桑病叶、广西省柳城县冲脉镇桑病叶、云南省曲靖市盘江镇桑病叶、云南蒙自市草
坝镇桑病叶，以及健康桑叶作为实验材料。

[0095] 2、总DNA的提取

[0096] 使用CTAB法进行实验材料总DNA的提取，步骤如下：

[0097] 将实验材料使用液氮充分研磨至粉末；1.5mL离心管中加入800μL的2％的CTAB溶液，并添加β‑巯基乙醇至终浓度0.1％；加入液氮研磨后的粉末样品，65℃恒温金属浴4小时
或过夜；先使用500μL酚/氯仿振荡混匀5分钟，后12000r/min离心5分钟，取上清；加入500μL
氯仿/异戊醇，振荡混匀5分钟，后12000r/min离心5分钟，取上清；将上清吸入新的1.5mL离
心管中离心5分钟，取上清；上清中加入同体积的异丙醇，放置于‑20℃1小时，取出后
12000r/min离心5分钟，倒上清，加入1mL的70％的乙醇溶液洗涤，混匀后，12000r/min离心5
分钟；去上清，倒置风干，除去异丙醇及乙醇。加入50μL TE Buffer，4℃放置1小时，即可获
得总DNA。

[0098] 3、PCR检测

[0099] 以上述得到的实验材料总DNA为模板，以实施例3构建得到的阳性对照质粒TM
pMD 19‑ltrA作为阳性对照，利用上游引物927F和下游引物1538R，以实施例2所述反应体系
和程序进行PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增反应产物。

[0100] 4、实验结果

[0101] 对不同地区的桑树病叶进行桑树植原体检测结果如图5所示，可以看出，不同地区TM
的桑树病叶提取的DNA均能扩增出与阳性对照质粒pMD 19‑ltrA相同长度(611bp)的条带，
而健康桑叶提取的DNA未扩增出条带。结果显示，上游引物927F和下游引物1538R对不同地
区的桑树病叶进行桑树植原体具有特异的检测效果。

[0102] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。