TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体及其应用转让专利
申请号 : CN201910875313.4
文献号 : CN110615847B
文献日 : 2021-07-09
发明人 : 张同存 , 祝海川 , 张子健
申请人 : 武汉波睿达生物科技有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种嵌合型抗原受体,其特征在于,从N端到C端顺次拼接信号肽、识别并结合肿瘤细胞表面TCRγδ的单链抗体ScFv、Strep tagⅡ、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4‑
1BB、CD3ζ、F2A、IL‑7、F2A、CCL19;所述单链抗体ScFv由重链可变区VH、连接多肽Linker、轻链可变区VL组成;所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述F2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示,所述IL‑7的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示,所述CCL19的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示
2.一种嵌合型抗原受体,其特征在于,从N端到C端顺次拼接信号肽、识别并结合肿瘤细胞表面TCRγδ的单链抗体ScFv、Strep tagⅡ、CD8铰链区、CD28跨膜区、4‑1BB、CD3ζ,所述单链抗体ScFv由重链可变区VH、连接多肽Linker、轻链可变区VL组成;所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种重组嵌合型抗原受体的基因载体,其特征在于,包括以慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、转座子载体或非病毒瞬时表达载体为骨架,插入如权利要求1‑2任一项所述的嵌合型抗原受体的编码核苷酸序列。
4.一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞,其特征在于,由编码权利要求1‑2任一项所述的嵌合型抗原受体的核苷酸序列或权利要求3所述的重组嵌合型抗原受体基因载体转染免疫细胞得到,所述免疫细胞选自脐带血、外周血或IPSC来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、CD4+T细胞,CD8+T细胞;所述嵌合型抗原受体的单链抗体ScFv结合肿瘤细胞表面的TCRγδ。
5.一种权利要求1‑2任一项所述的嵌合型抗原受体或权利要求3所述的重组嵌合型抗原受体的基因载体或权利要求4所述的表达嵌合型抗原受体免疫细胞在制备治疗淋巴细胞白血病的药物中的用途。
6.编码权利要求2所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列转染T细胞得到的表达嵌合型抗原受体的免疫细胞和糖皮质激素组成的药物组合物在制备治疗淋巴细胞白血病的药物中的用途。
说明书 :
TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
背景技术
法,将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(Scfv)与CD3ζ链的胞内区在体外偶联为一个
嵌合蛋白,通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞,使其表达嵌合抗体受体(CAR)。
患者的T细胞被“重编程”后,生成大量具有杀伤性的CAR‑T细胞,能够特异性的靶向肿瘤细
胞。CAR‑T与传统的免疫疗法相比,具有治疗更精确、靶向更精准、杀瘤更广泛、效果更持久
等显著优势。
原受体(TCR)类型差异,通常将成熟的T细胞分为γδT细胞亚型和αβT细胞亚型。在T细胞淋
巴瘤/白血病中,一些特定的肿瘤细胞起源于γδT细胞,因此肿瘤细胞表面均会强表达TCR
γδ,例如皮肤γδT细胞淋巴瘤,肝脾T淋巴细胞瘤及一部分外周T细胞淋巴瘤,亲上皮性肠
道T淋巴细胞瘤等淋巴瘤疾病。γδT细胞淋巴瘤在临床上面临着没有特定药物靶点从而导
致治疗效果差,复发率高和死亡率高等现象。然而,并未见以TCRγδ为靶点有效治疗肿瘤方
法。
发明内容
效的杀伤任何表面表达TCRγδ的肿瘤细胞。
述单链抗体ScFv识别并结合肿瘤细胞表面的TCRγδ。
CD83中的一种或多种,优选为CD28和4‑1BB;所述胞内信号刺激域选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、
CD3ε、CD8、FcγRI‑γ、FcγRIII‑γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、CD79a,优选为
CD3ζ。
所示,所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,优选地,所述重链可变区VH的核
苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
序列如SEQ ID NO.5所示,所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,优选地,所
述重链可变区VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,所述轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ
ID NO.8所示。
SEQ ID NO.16所示,所述CCL19的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示,更优选地,所述F2A的核
苷酸序列如SEQ ID NO.18所示,所述IL‑7的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示,所述CCL19的
核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。胞内结构域还包括共刺激结构域,共刺激结构域为CD28
和4‑1BB,胞内信号刺激域为CD3ζ。更优选地,嵌合型抗原受体,从N端到C端顺次拼接信号
肽、单链抗体ScFv、Strep tag Ⅱ、CD8 hinge、CD28跨膜区、共刺激结构域CD28、4‑1BB、胞内
信号刺激域CD3ζ、F2A、IL‑7、F2A、CCL19。其中,单链抗体ScFv的重链可变区VH的核苷酸序列
如SEQ ID NO.3所示,轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
型抗原受体核苷酸序列;优选地,以病毒载体PTK881‑EF1α为骨架,插入上述的嵌合型抗原
受体核苷酸序列。
胞选自脐带血、外周血或IPSC来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、CD4+T细胞,CD8+T细
胞,优选为外周血来源的αβT细胞;嵌合型抗原受体的单链抗体ScFv结合肿瘤表面的TCRγ
δ;优选地,CRISPR、RNA干扰技术联合嵌合型抗原受体原件的表达。
防、诊断肿瘤的药物或试剂盒,优选地,所述肿瘤为γδT细胞淋巴白血病。
马替尼、来那度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、波尼松龙、阿糖胞苷、环磷酰胺、6‑巯基
嘌呤、左旋门冬酰胺酶、甲氨碟呤、长春新碱、达沙替尼中的一种或多种,优选地,权利要求3
所述的嵌合型抗原受体转化T细胞得到的表达嵌合型抗原受体的免疫细胞与糖皮质激素联
用;所述抗体选自PD‑1、PD‑L1、TIM‑3、CTLA‑4抗体,所述溶瘤病毒选自呼肠孤病毒、腺病毒、
单纯性孢疹病毒、水泡型口炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒;
CD4、CD8、CD3、CD5、TCRαβ、CD1a。
的治疗,尤其对γδT细胞淋巴白血病杀瘤效果显著。2、本发明提供的嵌合抗原受体在CD3ζ
链后添加IL‑7、CCL19其杀瘤效率得到显著提高。3、C3‑2‑CAR‑T和糖皮质激素联合使用,对
TCRγδ阳性靶细胞Loucy、PEER的裂解产生了协同效应,取得了1+1>2的效果。
附图说明
具体实施方式
件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪
器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
NO.8所示的核苷酸片段构成SP‑C3‑2。连接多肽Linker为氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS,
核苷酸序列为ggcggtggcggtagcggtggcggtggctctggtggtggtggcagc。
段。采用Overlap PCR技术将SP‑C3‑1与片段Strep tag Ⅱ、CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞
内结构域、4‑1BB、CD3ζ顺次扩增连接成带有酶切位点EcoR I和BamH I的C3‑1‑CAR,采用
Overlap PCR技术将SP‑C3‑2与片段Strep tag Ⅱ、CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构
域、4‑1BB、CD3ζ顺次扩增连接成带有酶切位点EcoR I和BamH I的C3‑2‑CAR,C3‑1‑CAR、C3‑
2‑CAR结构示意图如图1所示;同样地,用Overlap PCR技术将SP‑C3‑1与片段Strep tag Ⅱ、
CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4‑1BB、CD3ζ、F2A、IL‑7、F2A、CCL19顺次扩增连接
成带有酶切位点EcoR I和BamH I的C4‑CAR,结构示意图如图2所示。
链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,重链可变区VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.3
所示,轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;单链抗体ScFv:SP‑C3‑2:重链可变
区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,重
链可变区VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.8
所示。
的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示,4‑1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示,CD3ζ的核苷
酸序列如SEQ ID NO.14所示,F2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示,IL‑7的氨基酸序列如
SEQ ID NO.16所示,CCL19的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示,F2A的核苷酸序列如SEQ ID
NO.18所示,IL‑7的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示,CCL19的核苷酸序列如SEQ ID NO.20
所示。
收试剂盒回收相应的片段,并测定产物的纯度和浓度。
小时;将连接液取出10μL加入100μL DH5α感受态细胞冰浴30min后42℃热激90s,完成后加
入500μL soc培养基37℃、220rpm培养2小时;2小时后将Eppendorf管4000g离心1min移除
400μL多余液体。将剩余液体涂布在LB平板37℃培养12小时;分别在平板上挑取单菌落,接
种到5mL LB液体培养基中37℃、220rpm培养12小时。
进行含质粒PTK881‑EF1α‑C3‑1、PTK881‑EF1α‑C3‑2、PTK881‑EF1α‑C4的DH5α菌株保种。
PTK881‑EF1α‑C3‑1、PTK881‑EF1α‑C3‑2的完整图谱示意图如图3所示,PTK881‑EF1α‑C4的完
整图谱示意图如图4所示。
6000g离心20min,弃上清。
淀在Buffers P1中完全分散。
15min。
倒入50mL洁净离心管内。
入烘箱内预热。
将管壁上的液体甩到管底后吹打混匀。
C3‑1、PTK881‑EF1α‑C3‑2、PTK881‑EF1α‑C4。
因不会发生改变,可用于下一环节的生产和正确表达蛋白。
×)),在37℃含5%CO2培养箱中培养24小时。分别将混有320μg质粒(PTK881‑EF1α‑C3‑1:
BZ1质粒:BZ2质粒:BZ3质粒=12:10:5:6)、混有320μg质粒(PTK881‑EF1α‑C3‑2:BZ1质粒:
BZ2质粒:BZ3质粒=12:10:5:6)、混有320μg质粒(PTK881‑EF1α‑C4:BZ1质粒:BZ2质粒:BZ3
质粒=12:10:5:6)的DMEM基础培养基加入960μg PEI管中,漩涡震荡,室温平衡10min。将上
述35mL PEI与质粒的混合液与525mL DMEM完全培养基混匀,换入上述多层细胞培养瓶中。
将多层细胞培养瓶置于37℃含5%CO2培养箱培养3天后,收集细胞培养上清液。
离心2.5h。去除上清,加入1mL T细胞培养基重悬沉淀。重悬后,留20μL做病毒活性滴度检
测,剩余慢病毒浓缩液分装,分别标记为Lenti3‑C3‑1‑CAR、Lenti3‑C3‑2‑CAR、Lenti3‑C4‑
CAR并置于‑80℃保存备用。
细胞中的表达情况。
(Gibco)收集293T细胞送流式细胞学检测CAR阳性293T细胞比例,并换算得到Lenti3‑C3‑1‑
CAR、Lenti3‑C3‑2‑CAR、Lenti3‑C4‑CAR慢病毒浓缩液活性滴度。
8
Lenti3‑C3‑1‑CAR 2.3×10
8
Lenti3‑C3‑2‑CAR 2.1×10
8
Lenti3‑C4‑CAR 1.3×10
后,使用适量CD3 MicroBeads,human(美天旎)分选CD3阳性细胞,并以1.0~2.0×10个/mL
TM TM
密度在T细胞完全培养液(OpTmizer CTS T‑Cell Expansion Basal Medium,
TM
OpTmizer CTS T‑Cell Expansion Supplement(Invitrogen),500IU/mL的IL‑2(双鹭药
6
业))中培养,同时按每10 个细胞加入25μl Dynabeads Human T‑Activator CD3/CD28
(Invitrogen)活化T细胞。
基进行培养。
细胞完全培养液,并调整活细胞密度为1.0‑2.0×10/mL,继续培养扩增10~20天,每天进
行观察和计数,并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养,始终保持细胞培养密度为1.0‑
6
2.0×10/mL。
CAR‑T细胞制剂成品。
细胞在总细胞中的比率。C3‑1‑CAR‑T、C3‑2‑CAR‑T、C4‑CAR‑T细胞转导效率检测结果分别如
图5所示。图5表明成功制备了C3‑1‑CAR‑T、C3‑2‑CAR‑T、C4‑CAR‑T细胞。
两次后,通过流式细胞仪分别检测FITC和PE荧光信号,测量FITC和PE阳性细胞比率,反映了
不同T细胞淋巴瘤TCR分型及表达水平,结果汇总至图6。由图6可以看出Loucy和PEER细胞系
为TCRγδ阳性细胞,Jurkat和Molt‑4为TCRγδ阴性细胞。
病(非γδT细胞淋巴白血病)细胞系Jurkat、Molt‑4细胞系进行CAR‑T体外杀瘤实验,上述细
胞系TCR类型见表2。
5 5
30min。常温,洗两遍后将细胞重悬至0.5×10/mL,96孔板中每孔加入0.5×10/mL个细胞,
按4:1的效靶比分别加入T、C3‑1‑CAR‑T、C3‑2‑CAR‑T、C4‑CAR‑T细胞,37℃孵育2~3小时。孵
育完成后取上清,测量其中钙黄绿素的荧光强度,并根据自发释放对照和最大释放对照,计
算靶细胞裂解百分数。靶细胞裂解百分数结果如图7所示,结果显示,C3‑1‑CAR‑T、C3‑2‑
CAR‑T、C4‑CAR‑T细胞均能明显促进TCRγδ阳性靶细胞(Loucy、PEER)裂解,而对TCRγδ阴性
靶细胞(Jurkat、Molt‑4)几乎没有杀伤效果。并且C3‑1‑CAR‑T、C4‑CAR‑T细胞促进TCRγδ阳
性靶细胞(Loucy、PEER)裂解效果优于C3‑2‑CAR‑T。
5 5
育30min。常温,洗两遍后将细胞重悬至0.5×10/mL,96孔板中每孔加入靶0.05×10/mL个
细胞,按4:1的效靶比加入C3‑2‑CAR‑T细胞,再加入糖皮质激素使糖皮质激素终浓度为2×
‑3
10 ug/μl,37℃孵育2~3小时。200g离心30秒,37℃孵育2~3小时。孵育完成后取上清,测量
其中钙黄绿素的荧光强度,并根据自发释放对照和最大释放对照,计算靶细胞Loucy、PEER
裂解百分数,分别为82.1%,83.8%。
5 5
育30min。常温,洗两遍后将细胞重悬至0.5×10/mL,96孔板中每孔加入0.05×10/mL个靶
‑3
细胞,加入糖皮质激素使糖皮质激素终浓度为2×10 ug/μl,37℃孵育2~3小时。200g离心
30秒,37℃孵育2~3小时。孵育完成后取上清,测量其中钙黄绿素的荧光强度,并根据自发
释放对照和最大释放对照,计算靶细胞Loucy、PEER裂解百分数,分别为5.8%,8.1%。
5%胎牛血清)常温,洗两遍后将细胞重悬至0.5×10/mL,96孔板中每孔加入0.05×10/mL
个靶细胞,按4:1的效靶比加入T、C3‑1‑CAR‑T、C3‑2‑CAR‑T、C4‑CAR‑T细胞,200g离心30秒,
37℃孵育18小时。孵育完成后取上清,测量其中IFN‑γ的浓度。T、C3‑1‑CAR‑T、C3‑2‑CAR‑T、
C4‑CAR‑T细胞对Loucy、PEER、Jurkat、Molt‑4细胞系的IFN‑γ的浓度结果如图8所示,结果
显示,C3‑1‑CAR‑T、C3‑2‑CAR‑T、C4‑CAR‑T细胞针对TCRγδ阳性淋巴瘤细胞系Loucy、PEER的
IFN‑γ的浓度均较高,而针对TCRγδ阴性淋巴瘤细胞系Jurkat、Molt‑4的IFN‑γ的浓度均
较低,进一步说明其可以杀伤γδT细胞淋巴白血病细胞,其变化趋势与上述体外杀瘤检测
结果一致。
实施例进行变化、修改、替换和变型。