一种检测蛋白纯度的方法

摘要

本发明提供了一种蛋白纯度的检测方法，采用体积排阻‑高效液相色谱法进行检测，以磷酸盐缓冲液为流动相可用于蛋白类生物制品中二聚体杂质的含量测定。本发明的蛋白纯度检测方法可以很好的将二聚体蛋白与单体蛋白分离开来，具有快速、简便、检测限低，灵敏度高等优点，适于产业应用。

权利要求

1.一种检测蛋白及其二聚体的方法，采用体积排阻‑高效液相色谱法进行检测，检测方法的色谱条件中流动相为磷酸盐缓冲液；其中，所述磷酸盐缓冲液为包含150mM PB和100mM NaCl的水溶液，所述蛋白选自抗体或融合蛋白，所述抗体包含SEQ ID NO：2所示的轻链序列和SEQ ID NO：3所示的重链序列；所述融合蛋白包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述流动相的pH为6.5‑7.0；色谱柱为TSK‑GEL G3000 SWXL型凝胶排阻色谱柱。

2.根据权利要求1所述的检测蛋白及其二聚体的方法，其特征在于，所述色谱条件中，流动相的pH为7.0。

3.根据权利要求1所述的检测蛋白及其二聚体的方法，其特征在于，所述色谱条件中，检测波长为220nm。

4.根据权利要求1所述的检测蛋白及其二聚体的方法，其特征在于，所述色谱条件中，流动相流速为0.5mL/min。

5.根据权利要求1所述的检测蛋白及其二聚体的方法，其特征在于，所述色谱条件中，柱温为20‑30℃。

6.根据权利要求5所述的检测蛋白及其二聚体的方法，其特征在于，所述色谱条件中，柱温为25℃。

7.一种检测蛋白及其二聚体的方法，包含以下步骤：

1)流动相配置：称取磷酸二氢钠适量溶解于超纯水中得磷酸二氢钠溶液，称取磷酸氢二钠适量溶解于超纯水中得磷酸氢二钠溶液；取适量磷酸二氢钠溶液和磷酸氢二钠溶液混匀，再加入NaCl，溶解后用酸碱调节剂调pH值至6.5‑7.0，微孔滤膜过滤，即得；其中，所述酸碱调节剂选自氢氧化钠、盐酸；

2)供试品溶液配置：取待测蛋白样品适量，加入缓冲液，混匀，即得；

3)色谱检测：采用高效液相色谱法，凝胶体积排阻色谱柱，使用步骤1)中配置的流动相溶液，柱温25℃，流速为0.5ml/min，波长220nm，将步骤2)制备的供试品注入高效液相色谱仪，进行检测；所述色谱柱为TSK‑GEL G3000 SWXL型凝胶排阻色谱柱；所述所述蛋白选自抗体或融合蛋白，所述抗体包含SEQ ID NO：2所示的轻链序列和SEQ ID NO：3所示的重链序列；所述融合蛋白包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

说明书

一种检测蛋白纯度的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种检测蛋白纯度的方法。

背景技术

[0002] 随着生物技术与制药工业的迅猛发展，越来越多的蛋白和多肽类药物被研发并应用于临床。抗体和融合蛋白都是常见的蛋白类药物，这些药物蛋白大多由CHO细胞表达，糖基化程度高，在细胞培养和纯化生产工艺流程中会聚集产生多聚体，另外，蛋白类药物保存条件、自身稳定性对多聚体的产生也有着不同程度的影响。蛋白聚集对于蛋白药物的安全性和有效性有着极大的影响，二聚体蛋白质可能由于较大的分子量二影响其穿膜特性，导致生物利用度降低，抗体蛋白的聚集还可能产生免疫源性，给药后将给患者带来潜在风险，因此蛋白纯度检测成为蛋白质药物质量控制的重要指标之一。

[0003] 目前检测蛋白药物纯度有两种常用的方法，一种是非还原蛋白质电泳，另一种是体积排阻色谱法(SEC)。非还原蛋白质电泳需要在变性条件下操作，可能会影响多聚体成分的含量，而SEC是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法，其检测条件比较温和，不会对蛋白质的天然形态产生大的影响。因此，SEC方法更适应产业上进行产品的质量控制。但目前公开的体积排阻色谱方法用于检测蛋白中二聚体杂质时，常出现分离度差或无法分离二聚体杂质的问题，且某些方法稳定性较差，检测灵敏度较低，不适于低浓度二聚体杂质的分离检测。

[0004] 为了进一步保障蛋白药物的质量安全，有必要建立一种快速、简便、灵敏、稳定的体积排阻色谱检测方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的之一是提供一种快速、简便、灵敏度高、稳定性好的检测方法，用于二聚体蛋白杂质的分离检测。本发明提供如下技术方案：

[0006] 一种检测蛋白纯度的方法，采用体积排阻‑高效液相色谱法进行检测，所述检测方法的色谱条件中流动相为磷酸盐缓冲液；其中，所述磷酸盐缓冲液为包含150mM PB和100mM NaCl的水溶液；所述蛋白选自抗体或融合蛋白，优选的，所述抗体包含SEQ ID NO：2所示的轻链序列和SEQ ID NO：3所示的重链序列；所述融合蛋白包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

[0007] 本发明所述检测蛋白纯度方法的色谱条件中，流动相的pH在6.5‑7.0均能实现较好的检测效果，优选为7.0。

[0008] 进一步，本发明检测方法的色谱条件中，检测波长优选为220nm，色谱柱优选为TSK‑GEL G3000 SWXL型凝胶排阻色谱柱，流动相流速优选为0.5mL/min，柱温为20‑30℃，优选25℃。

[0009] 本发明进一步提供一种检测蛋白纯度的方法，包含以下步骤：

[0010] 1)流动相配置：称取磷酸二氢钠适量溶解于超纯水中得磷酸二氢钠溶液，称取磷酸氢二钠适量溶解于超纯水中得磷酸氢二钠溶液；取适量磷酸二氢钠溶液和磷酸氢二钠溶液混匀，再加入NaCl，溶解后用酸碱调节剂调pH值至6.5‑7.0，微孔滤膜过滤，即得；其中，所述酸碱调节剂选自氢氧化钠、盐酸；

[0011] 2)供试品溶液配置：取待测蛋白样品适量，加入缓冲液，混匀，即得；

[0012] 3)色谱检测：采用高效液相色谱法，凝胶体积排阻色谱柱，使用步骤1)中配置的流动相溶液，柱温25℃，流速为0.5mL/min，波长220nm，将步骤2)制备的供试品注入高效液相色谱仪，进行检测。

[0013] 本发明人在长期的实验研究中发现，色谱检测条件对于体积排阻‑高效液相色谱法(SEC‑HPLC)检测蛋白中二聚体的效果有显著影响，以下是部分实验内容。

[0014] 1、实验材料

[0015] 本发明所用实验材料如下：

[0016] 磷酸氢二钠(十二水)购自成都市科龙化工试剂厂

[0017] 磷酸二氢钠(二水)购自成都市科龙化工试剂厂

[0018] 无水磷酸氢二钠购自成都市科龙化工试剂厂

[0019] 氯化钠购自成都市科龙化工试剂厂

[0020] 无水硫酸钠购自成都市科龙化工试剂厂

[0021] 氢氧化钠购自成都市科龙化工试剂厂

[0022] Arg(精氨酸)购自上海源聚生物科技有限公司

[0023] 异丙醇(色谱纯)购自美国Honeywell Burdick&Jackson公司

[0024] 乙醇(色谱纯)购自美国FISHER SCIENTIFIC公司

[0025] 盐酸(色谱纯)购自成都科隆化学品有限公司

[0026] 20*PBS缓冲盐溶液购自生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech，使用是用蒸馏水稀释成需要的倍数)

[0027] Agilent 1260高效液相色谱仪

[0028] TSK G3000凝胶色谱柱(TSK‑GEL G3000 SWXL，7.8×300mm，5μm)

[0029] 2、色谱条件

[0030] 使用安捷伦高效液相色谱仪1260，色谱柱：TSK G3000凝胶色谱柱(TSK‑GEL G3000 SWXL，7.8×300mm，5μm)，流动相：150mM(mM表示mmol/L)PB+100mM NaCl，柱温：25℃，流速：0.5mL/min，波长：220nm，进样量：10ul，洗脱时间：30min。

[0031] 3、流动相配制

[0032] 本发明中PB指磷酸缓冲液，即将磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶于水中配置而成的混合溶液，其配置方法为本领域常规技术。一种例举的配置方法如下：

[0033] 1)根据不同的浓度需求，预先分别配置相应浓度的磷酸二氢钠溶液和磷酸氢二钠溶液

[0034] 2)根据不同的pH需求，选择磷酸二氢钠溶液和磷酸氢二钠溶液的用量，若pH仍有微小差异，则用酸碱调节剂，如NaOH或HCl，调节pH至所需的范围。

[0035] 本发明人考察的部分流动相及其配置方法如下：

[0036] 流动相1：150mM PB+100mM NaCl

[0037] 配置方法如下：称取磷酸二氢钠(二水)23.401g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液A。称取磷酸氢二钠(十二水)53.721g或无水磷酸氢二钠21.294g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液B。量取溶液A 585mL，溶液B 915mL于烧杯中，再加入NaCl 
8.775g，溶解后用氢氧化钠调pH值至7.0，用0.22μm滤膜过滤，即得。

[0038] 流动相2：100mM磷酸氢二钠(十二水)+100mM NaCl

[0039] 配置方法如下：称取磷酸氢二钠(十二水)35.8g，氯化钠8.8g于800mL超纯水中，溶解后用盐酸调pH值至6.7，并定容至1L，0.22μm滤膜过滤，即得。

[0040] 流动相3：1％异丙醇+200mM PB

[0041] 称取磷酸二氢钠(二水)15.6g溶解于180mL超纯水中，并定容至200mL，为溶液A。称取磷酸氢二钠(十二水)75.2g溶解于380mL超纯水中，并定容至420mL，为溶液B。将溶液A和B混合加入15.5mL异丙醇于914.5mL超纯水中，调pH值至7.0，0.22μm滤膜过滤，即得。

[0042] 流动相4：20mM PB+100mM NaCl

[0043] 称取磷酸二氢钠(二水)3.12g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液A。称取磷酸氢二钠(十二水)7.163g或无水磷酸氢二钠2.839g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液B。量取溶液A 585mL，溶液B 915mL于烧杯中，再加入NaCl 8.775g，溶解后用氢氧化钠调pH值至7.0，用0.22μm滤膜过滤，即得。

[0044] 流动相5：20mM磷酸氢二钠(十二水)+150mM NaCL+200mM Arg

[0045] 称取磷酸氢二钠(十二水)7.16g，氯化钠8.8g，Arg 42.2g于800mL超纯水中，溶解后用盐酸调pH值至7.2，并定容至1L，0.22μm滤膜过滤，即得。

[0046] 流动相6：150mM PB+300mM NaCl

[0047] 配置方法如下：称取磷酸二氢钠(二水)23.401g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液A。称取磷酸氢二钠(十二水)53.721g或无水磷酸氢二钠21.294g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液B。量取溶液A 585mL，溶液B 915mL于烧杯中，再加入NaCl 
26.325g，溶解后用氢氧化钠调pH值至7.0，用0.22μm滤膜过滤，即得。

[0048] 流动相7：100mM PB+300mM NaCl

[0049] 配置方法如下：称取磷酸二氢钠(二水)15.601g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液A。称取磷酸氢二钠(十二水)35.814g或无水磷酸氢二钠14.196g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液B。量取溶液A 585mL，溶液B 915mL于烧杯中，再加入NaCl 
26.325g，溶解后用氢氧化钠调pH值至7.0，用0.22μm滤膜过滤，即得。

[0050] 流动相8：100mM PB+100mM NaCl

[0051] 配置方法如下：称取磷酸二氢钠(二水)15.601g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液A。称取磷酸氢二钠(十二水)35.814g或无水磷酸氢二钠14.196g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液B。量取溶液A 585mL，溶液B 915mL于烧杯中，再加入NaCl 
8.775g，溶解后用氢氧化钠调pH值至7.0，用0.22μm滤膜过滤，即得。

[0052] 流动相9：50mM PB+100mM NaCl

[0053] 配置方法如下：称取磷酸二氢钠(二水)7.800g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液A。称取磷酸氢二钠(十二水)17.907g或无水磷酸氢二钠7.098g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液B。量取溶液A 585mL，溶液B 915mL于烧杯中，再加入NaCl 
8.775g，溶解后用氢氧化钠调pH值至7.0，用0.22μm滤膜过滤，即得。

[0054] 流动相10：50mM PB+200mM NaCl

[0055] 配置方法如下：称取磷酸二氢钠(二水)7.800g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液A。称取磷酸氢二钠(十二水)17.907g或无水磷酸氢二钠7.098g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液B。量取溶液A 585mL，溶液B 915mL于烧杯中，再加入NaCl 
17.550g，溶解后用氢氧化钠调pH值至7.0，用0.22μm滤膜过滤，即得。

[0056] 流动相11：250mM PB+50mM NaCl

[0057] 配置方法如下：称取磷酸二氢钠(二水)39.000g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液A。称取磷酸氢二钠(十二水)89.535g或无水磷酸氢二钠35.490g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L，为溶液B。量取溶液A 585mL，溶液B 915mL于烧杯中，再加入NaCl 
4.387g，溶解后用氢氧化钠调pH值至7.0，用0.22μm滤膜过滤，即得。

[0058] 4、供试品制备

[0059] 取蛋白A或蛋白B适量，加入1*PBS缓冲盐溶液，配置0.1mg/mL的供试品溶液，即可。

[0060] 其中，蛋白A为包含SEQ ID NO：2所示轻链序列和SEQ ID NO：3所示重链序列的抗体；蛋白B为包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的融合蛋白。

[0061] 5、实验结果

[0062] 在其他实验条件相同，仅流动相组成不同的情况下，对相同批次的蛋白样品进行检测，采用面积归一法计算样品中二聚体杂质的含量，采用下述计算公式计算相同批次样品中二聚体含量的变异系数(CV/％)。

[0063] CV＝(标准偏差SD/平均值Mean)*100％

[0064] 同时，根据《中华人民共和国药典(2015年版)》第4部通则0514“分子排阻色谱法”中的有关规定，在采用分子排阻色潽法检测生物大分子时，二聚体的分离度(R)计算公式为： H表示二聚体峰高，h表示二聚体与单体之间的谷高，且R不得低于2.0。

[0065] 不同流动相条件下分离二聚体效果如下表1所示：

[0066] 表1不同流动相条件下蛋白二聚体分离效果

[0067]

[0068]

[0069] 根据上表结果可知，采用不同流动相进行分离检测时会出现分离度不达标、单体样品峰拖尾、基线波动较大、二聚体含量结果不稳定(CV％较大)、检测限较高等问题，而采用流动相1进行蛋白分离检测时，可以很好的将二聚体蛋白与单体蛋白分离开来，且基线平稳，二聚体含量稳定，方法检测限较低，灵敏度较好。

附图说明

[0070] 图1为对比例一中蛋白B的色谱检测图谱

[0071] 图2为对比例二中蛋白A的色谱检测图谱

[0072] 图3为对比例二中蛋白B的色谱检测图谱

[0073] 图4为对比例三中蛋白B的色谱检测图谱

[0074] 图5为实施例一中蛋白A的色谱检测图谱

[0075] 图6为实施例二中蛋白B的色谱检测图谱

[0076] 其中，1为二聚体蛋白色谱峰，2为单体蛋白样品色谱峰，3为蛋白片段色谱峰。

具体实施方式

[0077] 对比例一

[0078] 1、流动相配制

[0079] 溶液A：50mM NaH2PO4：称取磷酸二氢钠(二水)7.9g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L。

[0080] 溶液B：50mM Na2HPO4：称取磷酸氢二钠(十二水)17.9g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L。

[0081] 量取溶液A 510mL，溶液B 490mL于烧杯中，再加入NaCl 17.55g，溶解后用氢氧化钠调pH值至6.8，用0.22μm滤膜过滤，即得。

[0082] 2、供试品制备

[0083] 分别取蛋白A和蛋白B适量，加入1*PBS缓冲盐溶液，配置成需要的浓度，即可。

[0084] 其中，蛋白A为包含SEQ ID NO：2所示轻链序列和SEQ ID NO：3所示重链序列的抗体；蛋白B为包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的融合蛋白。

[0085] 3、色谱条件

[0086] 使用安捷伦高效液相色谱仪1260，TSKgel G3000SWXL型(300mm×7.8mm)凝胶排阻色谱柱，以0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6.8)‑0.3mol/L氯化钠溶液为流动相，流速为1mL/min，DAD检测器，检测波长为220nm。

[0087] 4、实验结果

[0088] 表2对比例一方法检测蛋白二聚体结果

[0089]

[0090] 从上表数据可知，对比例一的方法用于蛋白A或蛋白B中二聚体检测时，蛋白B中二聚体分离度不达标，无法进行准确的定性和定量，不适合用于产业上进行产品的质量控制。

[0091] 对比例二

[0092] 1、流动相配制

[0093] 0.02mol/L磷酸二氢钠：称取磷酸二氢钠(二水)3.1g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L。

[0094] 0.15mol/LNaCl：称取氯化钠8.8g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L。

[0095] 95％乙醇溶液：量取乙醇190mL，加入超纯水10mL，混匀即可。

[0096] 量取0.02mol/L磷酸二氢钠900mL、0.15mol/LNaCl 900mL，95％乙醇溶液200mL，混匀，0.22μm滤膜过滤，即得。

[0097] 2、供试品制备

[0098] 分别取蛋白A和蛋白B适量，加入1*PBS缓冲盐溶液，配置成需要的浓度，即可。

[0099] 其中，蛋白A为包含SEQ ID NO：2所示轻链序列和SEQ ID NO：3所示重链序列的抗体；蛋白B为包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的融合蛋白。

[0100] 3、色谱条件

[0101] 使用安捷伦高效液相色谱仪1260，采用TSK G3000凝胶色谱柱(TSK‑GEL G3000 SWXL，7.8×300mm，5μm)，0.02mol/L磷酸二氢钠溶液‑0.15mol/L氯化钠溶液‑95％乙醇(45∶45∶10)为流动相，流速0.6mL/min，检测波长222nm，进样量：20ul。

[0102] 4、实验结果

[0103] 表3对比例二方法检测蛋白二聚体结果

[0104]

[0105] 分别对同一批次两种不同浓度的蛋白A和蛋白B进行检测，结果均未有效分离出蛋白样品中的二聚体杂质(参见附图2、3)，说明该方法不适用于产品的质量控制。

[0106] 对比例三

[0107] 1、流动相配制

[0108] 溶液A：100mM NaH2PO4：称取磷酸二氢钠(二水)15.6g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L。

[0109] 溶液B：100mM Na2HPO4：称取磷酸氢二钠(十二水)35.8g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L。

[0110] 量取溶液A 390mL，溶液B 610mL于烧杯中，再加入Na2SO414.2g，溶解后用氢氧化钠调pH值至7.0，用0.22μm滤膜过滤，即得。

[0111] 2、供试品制备

[0112] 分别取蛋白A和蛋白B适量，加入1*PBS缓冲盐溶液，配置成需要的浓度，即可。

[0113] 其中，蛋白A为包含SEQ ID NO：2所示轻链序列和SEQ ID NO：3所示重链序列的抗体；蛋白B为包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的融合蛋白。

[0114] 3、色谱条件

[0115] 使用安捷伦高效液相色谱仪1260，TSK G3000凝胶色谱柱(TSK‑GEL G3000 SWXL，7.8×300mm，5μm)，柱温：25℃，流速：0.6mL/min，波长：214nm，进样量：20ul。

[0116] 4、实验结果

[0117] 表4对比例三方法检测蛋白二聚体结果

[0118]

[0119] 根据上表结果可知，该方法用于蛋白A中二聚体检测时，方法稳定性相对于本发明较差，且检测限提高一个数量级，不利于低浓度二聚体杂质的检出，将该方法用于蛋白B中二聚体检测时，无法有效分离出样品中的二聚体杂质(参见附图4)，可见该方法不适于产品的质量控制。

[0120] 实施例一

[0121] 1、流动相配制

[0122] 溶液A：称取磷酸二氢钠(二水)23.4g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L。

[0123] 溶液B：称取磷酸氢二钠(十二水)53.7g溶解于800mL超纯水中，并定容至1L。

[0124] 量取溶液A 585mL，溶液B 915mL于烧杯中，再加入NaCl 8.8g，溶解后用氢氧化钠调pH值至7.0，用0.22μm滤膜过滤，即得。

[0125] 2、供试品制备

[0126] 取蛋白A适量，以1*PBS缓冲液为溶剂，采用逐级稀释法配置得到浓度为0.1mg/mL的

[0127] 供试品溶液。

[0128] 3、色谱条件

[0129] 使用安捷伦高效液相色谱仪1260，色谱柱：TSK G3000凝胶色谱柱(TSK‑GEL G3000 SWXL，7.8×300mm，5μm)，流动相：150mM PB+100mM NaCl，柱温：25℃，流速：0.5mL/min，波长：220nm，进样量：10ul，洗脱时间：30min

[0130] 4、实验结果

[0131] 采用面积归一法计算样品中二聚体杂质的含量，采用下述计算公式计算相同批次样品中二聚体含量的变异系数(CV/％)。

[0132] CV＝(标准偏差SD/平均值Mean)*100％

[0133] 同时，根据《中华人民共和国药典(2015年版)》第4部通则0514“分子排阻色谱法”中的有关规定，在采用分子排阻色潽法检测生物大分子时，二聚体的分离度(R)计算公式为： H表示二聚体峰高，h表示二聚体与单体之间的谷高，且R不得低于2.0。

[0134] 表5实施例一方法检测蛋白二聚体结果

[0135] 蛋白 蛋白浓度/mg.mL‑1 二聚体含量CV(n＝3)/％ 二聚体分离度R 二聚体检测限/mgA 0.1 0 5.2 0.0004mg

[0136] 本发明方法用于蛋白A中二聚体杂质检测，样品分离度好，精密度高，准确性好，适于产业上对低浓度二聚体杂质的分离检测(参见附图5)。

[0137] 实施例二

[0138] 1、流动相配制

[0139] 同实施例一

[0140] 2、供试品制备

[0141] 取蛋白B适量，以PBS缓冲液为溶剂，采用逐级稀释法配置得到浓度为0.1mg/mL的供

[0142] 试品溶液。

[0143] 3、色谱条件

[0144] 使用安捷伦高效液相色谱仪1260，色谱柱：TSK G3000凝胶色谱柱(TSK‑GEL G3000 SWXL，7.8×300mm，5μm)，流动相：150mM PB+100mM NaCl，柱温：25℃，流速：0.5mL/min，波长：220nm，进样量：10ul，洗脱时间：30min

[0145] 4、实验结果

[0146] 采用面积归一法计算样品中二聚体杂质的含量，采用下述计算公式计算相同批次样品中二聚体含量的变异系数(CV/％)。

[0147] CV＝(标准偏差SD/平均值Mean)*100％

[0148] 同时，根据《中华人民共和国药典(2015年版)》第4部通则0514“分子排阻色谱法”中的有关规定，在采用分子排阻色潽法检测生物大分子时，二聚体的分离度(R)计算公式为： H表示二聚体峰高，h表示二聚体与单体之间的谷高，且R不得低于2.0。

[0149] 表6实施例二方法检测蛋白二聚体结果

[0150] 蛋白 蛋白浓度/mg.mL‑1 二聚体含量CV(n＝3)/％ 二聚体分离度R 二聚体检测限/mgB 0.1 0 2.2 0.0003mg

[0151] 本发明方法用于蛋白B中二聚体杂质检测，样品分离度好，精密度高，准确性好，适于产业上对低浓度二聚体杂质的分离检测(参见附图6)。