一种基于生物膜干涉技术的沙门氏菌快速检测方法转让专利
申请号 : CN201910908072.9
文献号 : CN110632301B
文献日 : 2021-03-12
发明人 : 张晓光 , 藏程琳 , 孙春燕 , 张鸣镝 , 刘佰潼 , 刘凯 , 刘泽同 , 刘志伟
申请人 : 吉林大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种基于生物膜干涉技术的沙门氏菌快速检测方法,其特征在于:包括传感器活化、抗体固定化、封闭、样品检测及结果判断,其具体步骤如下:步骤一、传感器活化:将第二代氨基偶联传感器末端浸入纯水中预湿至少10分钟后,浸入15‑25mM 1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和8‑12mM N‑羟基琥珀酰亚胺混合活化试剂中活化150‑450秒;
步骤二、抗体固定化:将活化后的第二代氨基偶联传感器浸入用pH 4‑6的醋酸‑醋酸钠缓冲溶液稀释的浓度为12.5‑100μg/mL的抗体溶液中固定化180‑900秒;
步骤三、封闭:抗体固定化后,将第二代氨基偶联传感器依次浸入0.8‑1.5M乙醇胺盐酸盐溶液和0.8‑1.5%牛血清白蛋白溶液中封闭150‑450秒;
步骤四、样品检测及结果判断:将已封闭的第二代氨基偶联传感器浸入含0.01‑0.03%吐温‑20的磷酸盐缓冲溶液中平衡60‑180秒,而后浸入待测样品中进行沙门氏菌的检测,检测过程中实时读取结合信号,对于定性分析,当结合信号大于等于有效信号值0.0075nm时即可判定样品中含有沙门氏菌;对于定量分析,将结合时间为60秒、120秒、180秒、300秒时的结合信号y分别代入到下述菌浓度和结合信号间的数学公式(1)、(2)、(3)、(4):ln(41349.7y+277.0)^0.98499C60=10 (1)ln(11293.1y+160.5)^1.11054C120=10 (2)ln(16331.9y+179.7)^1.04064C180=10 (3)ln(13112.1y+146.1)^1.04585C300=10 (4)求解所得C即为样品中沙门氏菌的具体浓度,其中C60、C120、C180和C300分别代表结合时间为60秒、120秒、180秒和300秒时求得的菌浓度,结合时间为60秒、120秒、180秒、300秒时所
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对应的沙门氏菌的最低检出限分别是1.9×10CFU/mL、1.3×10 CFU/mL、8.8×10CFU/mL和5
5.6×10CFU/mL。
说明书 :
一种基于生物膜干涉技术的沙门氏菌快速检测方法
技术领域
背景技术
食品及相关制品而引起食物中毒。据国内外相关统计,由 沙门氏菌引起的食物中毒占细菌
性食物中毒的42.6%‑60%。沙门氏菌除能引起 食物中毒外,还可引起严重的消化道传染
病。据欧洲食品安全局估计,欧盟每 年因沙门氏菌污染造成的经济损失高达30亿欧元。
现有应用较广泛的快速检测方法有基于抗原抗体反应的免疫 学检测技术(如ELISA)和以
PCR为代表的分子生物学检测技术,与传统方法 相比,缩短了检测时间,且有较高的灵敏度
和特异性;但仍有不足,如易受污 染而导致假阳性结果(PCR),对试剂的选择性高、准确性
不够(ELISA),检测 时间仍较长等。开发更加快速、准确的沙门氏菌检测方法是迫切需要
的。
许多学者将其应用于抗体筛选、抗体‑抗原/病毒亲和力测定、蛋白‑ 蛋白/DNA/RNA/纳米颗
粒亲和力测定以及抗体和其他蛋白的定量测定等领域, 取得了可喜的科研成果。其所展示
出的技术优势,诸如快速、高效、高准确性、 简单易用,已得到了国内外众多专家学者的一
致高度认可。
发明内容
亚胺混合活化试剂中活化150‑450秒;
检测,检测过程中实时读取结合信号,对于定性分析,当结合信 号大于等于有效信号值
0.0075nm时即可判定样品中含有沙门氏菌;对于定量分 析,将结合时间为60秒、120秒、180
秒、300秒时的结合信号y分别代入到下 述菌浓度和结合信号间的数学公式(1)、(2)、(3)、
(4):
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时所对应的沙门氏菌的最低检出限分别是 1.9×10 CFU/mL、1.3×10 CFU/mL、8.8×
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10CFU/mL和5.6×10CFU/mL。
可以做到样品的随到随检。根据样品中所含目标菌浓度的不 同,单纯的样品检测环节只需
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要数十秒到几分钟的时间。例如当实际样品中的 目标菌浓度在8.8×10 CFU/mL时,仅仅需
要60秒即可判断出样品中有目标菌 的存在。如果菌浓度更高的话这个时间会更短。本发明
所述方法可实时获取检 测信号,所以可根据实际需要随时读取检测信号进行分析以判断
是否有必要继 续实施检测过程,如果检测信号已达要求便可终止检测从而可以节省检测
时间。 本发明所述方法可应用于粗样品的检测,检测前样品无需经过离心和脱气。本 发明
所述方法配合可商购的基于BLI技术的设备和系统,可实现多个样品(例 如96个样品)的同
时批量检测。
附图说明
具体实施方式
议的条件。
行试验,具体步骤如下:
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溶液将沙门氏菌菌悬液浓度调整至2.2×10CFU/mL、 4.4×10 CFU/mL、8.8×10CFU/mL,将
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斯氏李斯特菌、金黄色葡萄球菌、单增 李斯特菌的菌悬液浓度调整为1.0×10 CFU/mL,待
检。
盐酸盐和200mM N‑羟基琥珀酰亚胺各取100μl加入到1800μl水 中配制而成)、抗体溶液(50
μg/ml于pH为5的10mM的醋酸‑醋酸钠缓冲溶液 中)、浓度为1M的乙醇胺盐酸盐(pH=8.5)、
1%牛血清白蛋白、含0.02%吐温 ‑20的磷酸盐缓冲溶液以及待检样品。
盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺混合活化试剂(300秒)、抗体溶液(600秒)、乙醇胺盐酸盐(300
秒)、1%牛血清白蛋白(300秒)、含吐温20的 磷酸盐缓冲溶液(120秒)、样品(300秒),系统
运行过程中可实时观察到各步 骤的相关情况。其中传感器预湿(即浸入纯水中10分钟)也
可在运行系统之前 提前完成。
效信号值,说明该方法有很好的特异性。
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2.2×10 CFU/mL、4.4×10CFU/mL、8.8×10CFU/mL,得到 所需的待测样品。往96孔板中加
样及用生物分子相互作用仪进行样品检测同实 施例1的(2)和(3)。检测到的结合信号值代
入到菌浓度和结合信号间的数学 公式计算可得回收到的菌浓度。表3为不同结合时间下目
标菌的回收率试验结 果,从表中可以看出回收率平均值基本都在96%以上,说明该方法用
于实际样 品检测也有很高的准确率。另外,通过比较不同结合时间下菌的回收率可以看
出随着结合时间的延长,菌的回收率也随之变大,更加接近于100%,说明结合 时间的延长
可以在一定程度上使得检测结果更加准确。
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为2.2×10CFU/mL、4.4×10CFU/mL、8.8×10CFU/mL, 得到所需的待测样品。往96孔板中
加样及用生物分子相互作用仪进行样品检测 同实施例1的(2)和(3)。检测到的结合信号值
代入到菌浓度和结合信号间的 数学公式计算可得回收到的菌浓度。表4为不同结合时间下
目标菌的回收率试 验结果,从表中可以看出回收率平均值基本都在95%以上,进一步说明
该方法 用于实际样品检测也有很高的准确率。另外,通过比较不同结合时间下菌的回 收
率可以看出随着结合时间的延长,菌的回收率也更加接近于100%,说明结合 时间的延长
可以在一定程度上使得检测结果更加准确。