一种双链DNA结合荧光染料及其制备与应用

摘要

本发明公开了一种双链DNA结合荧光染料，该染料包含有式ⅰ所示结构或其立体异构体。本发明还公开了上述染料的制备方法及用途。本发明通过叔胺连接两个荧光团，且荧光团易于π‑π堆积错位，降低两个分子结合前的荧光强度，获得更强的扩增信号，从而提高了双链DNA结合荧光染料的灵敏性和稳定性，降低了其细胞毒性和对PCR的抑制性。

权利要求

1.双链DNA结合荧光染料，其特征在于，该荧光染料的分子结构为式ⅱ所示结构或其立体异构体：其中，X为卤素。

2.根据权利要求1所述的双链DNA结合荧光染料，其特征在于，所述X为Br或I。

3.根据权利要求1所述的双链DNA结合荧光染料，其特征在于，所述立体异构体具有式(ⅲ)或式(ⅳ)所示的结构：其中，X为卤素。

4.权利要求1或2所述双链DNA结合荧光染料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)2-甲基苯并噻唑与1,2-二碘乙烷反应获得中间体I：

2)中间体I与甲胺反应获得中间体Ⅱ：

3)中间体Ⅱ与对二甲氨基苯甲醛反应获得式Ⅲ结构的双链DNA结合荧光染料：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)，2-甲基苯并噻唑在60℃下缓慢滴加到1,2-二碘乙烷的乙醇溶液中，滴加完毕后，在回流温度下反应90min，然后移除溶剂，在丙酮中结晶得到中间体I。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)采用封管反应法，以正丁醇为溶剂，反应温度为135℃，所述甲胺为甲胺的甲醇溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)的反应体系中还添加有1.5当量的缚酸剂。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)的反应采用乙酸和哌啶为催化剂，乙酸和哌啶的体积比为1:1～1:4。

9.权利要求1至3任一项所述双链DNA结合荧光染料的用途，其特征在于，用于制备成核酸的实时定量PCR检测的试剂。

说明书

一种双链DNA结合荧光染料及其制备与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及核酸染料领域，特别是涉及一种新型的双链DNA结合荧光染料。

背景技术

[0002] 双链DNA(dsDNA)结合荧光染料中最具代表性的是分子溴化乙锭，其早已用于琼脂糖凝胶电泳中的核酸染色。

[0003] 双链DNA结合荧光染料同样应用于检测核酸的实时扩增，例如PCR。对应的扩增产物可以通过DNA结合荧光染料予以识别，当该染料和双链核酸相互作用后，再用适宜的波长激发，可以发射相应的荧光信号。在PCR反应过程中，待测样品中只要存在双链的DNA，染料就可以选择性的结合，同时可以检测到荧光信号。当双链DNA解离时，信号会迅速降低。这种信号的衰减同样适合于荧光强度对温度-时间曲线的监测。

[0004] 双链DNA结合荧光染料还可用于实时PCR的检测。此时，最经常使用的荧光染料是SYBRGreen I。SYBRGreen I因为其高效低毒得到广泛的应用，但是由于其本身不能用于普通的PCR缓冲液，需要添加DMSO、DBA等额外试剂；同时，虽然可以通过增加MgCl2的浓度降低其PCR抑制效应，但是浓度依赖的抑制效果依然存在，因此SYBRGreen I在多重PCR应用中受限。研究发现，当进行双重PCR扩增时，只能检测到一个产物的溶解曲线，但是电泳分析却明确显示含有两个产物。因此，尽管SYBRGreen I应用范围较广，但仍存在可用浓度范围小、序列结合偏差性大等缺点。

[0005] 此外，现有的多种核酸染料本身具有较高的毒性，这主要是由于染料分子可以轻易地穿透细胞膜，从而和细胞内的核酸DNA结合，导致基因突变，具有一定的致癌性。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种双链DNA结合荧光染料，它灵敏性和稳定性好，细胞毒性低，对PCR的抑制性小。

[0007] 为解决上述技术问题，本发明的双链DNA结合荧光染料，其分子结构为式ⅱ所示结构或其立体异构体：

[0008]

[0009] 其中，X为卤素，例如Br或I。

[0010] 所述式ⅱ的立体异构体主要为ZE异构：

[0011]

[0012] 本发明要解决的技术问题之二是提供上述双链DNA结合荧光染料的制备方法。该方法主要包括以下步骤：

[0013] 1)2-甲基苯并噻唑与1,2-二碘乙烷反应获得中间体I：

[0014]

[0015] 2)中间体I与甲胺反应获得中间体Ⅱ：

[0016]

[0017] 3)中间体Ⅱ与对二甲氨基苯甲醛反应获得式Ⅲ结构的双链DNA结合荧光染料：

[0018]

[0019] 上述步骤1)中的原料1,2-二碘乙烷也可以选用其他邻二卤代乙烷替代，例如1,2-二溴乙烷。

[0020] 上述步骤2)优选采用封管反应法，反应体系中可以添加缚酸剂，所述缚酸剂可以选用二异丙基乙胺，添加量优选为1.5当量。

[0021] 上述步骤3)的反应优选采用乙酸和哌啶的混合液作为催化体系，乙酸和哌啶的体积比优选为1:1～1:4。

[0022] 本发明要解决的技术问题之三是提供上述双链DNA结合荧光染料的用途，该双链DNA结合荧光染料可用于核酸的实时定量PCR检测。

[0023] 本发明的双链DNA结合荧光染料，通过叔胺连接两个荧光团，且荧光团中的N,N'-二甲基苯易于形成强烈的π-π堆积，从而形成类分子簇的结构，导致该染料本身的荧光强度降低；当该染料和核酸结合以后，由于苯并噻唑和N,N'-二甲基苯的双键连接臂易于受到核酸结构的限制而固定，导致整个荧光团结构的刚性化，便于形成共轭，从而可以获得更强的扩增信号，提高双链DNA结合荧光染料的灵敏性和稳定性，同时降低其细胞毒性和对PCR的抑制性。另外，本发明的双链DNA结合荧光染料可以直接用于普通的PCR缓冲液，不需要添加DMSO、DBA等额外试剂。

附图说明

[0024] 图1为本发明实施例1的中间体Ⅱ的核磁共振谱图；

[0025] 图2为本发明实施例1的最终产物(式Ⅲ化合物)的核磁共振谱图；

[0026] 图3～图6为本发明实施例1制备的式Ⅲ化合物用于实时荧光定量PCR的扩增曲线结果图；

[0027] 图7为使用对比试剂SYBR的实时荧光定量PCR扩增曲线结果图；

[0028] 图8～图11为本发明实施例1制备的式Ⅲ化合物用于PCR定量的标准曲线结果图；

[0029] 图12为使用对比试剂SYBR的PCR定量的标准曲线结果图。

[0030] 图13为对照品EB用于琼脂糖凝胶电泳结果图；

[0031] 图14为对照品GelRed用于琼脂糖凝胶电泳结果图；

[0032] 图15为本发明实施例1制备的式Ⅲ化合物用于琼脂糖凝胶电泳结果图；

[0033] 图16为对照品SYBR Safe细胞毒性安全性能测试图；

[0034] 图17为本发明实施例1制备的式Ⅲ化合物细胞毒性安全性能测试图。

具体实施方式

[0035] 为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

[0036] 实施例1双链DNA结合荧光染料的制备

[0037] 本实施例的双链DNA结合荧光染料的制备方法如下：

[0038] 1)将原料2-甲基苯并噻唑(0.30g，2.0mmol，1eq)缓慢滴加到1,2-二碘乙烷(2.85g，10.1mmol，5eq)的乙醇溶液中，温度控制在60℃。30min左右滴加完毕后，将温度调至回流温度，并持续90min。反应完成后，移除溶剂，并在丙酮中结晶得到目标产物中间体I：

[0039]

[0040] 2)分别将中间体I(1.0mmol，1eq)、甲胺(0.48mmol，0.48eq)的甲醇溶液和二异丙基乙胺(2.5eq)并液，加入10mL的正丁醇做溶剂，反应采用封管，加热温度为135℃，制备并液相分离得到中间体Ⅱ：

[0041]

[0042] 所得中间体Ⅱ的核磁共振谱图如图1所示。

[0043] 3)由中间体Ⅱ(0.5mmol，1.0eq)、4-N,N'-二甲氨基苯甲醛(0.75mmol，1.5eq)和催化量的乙酸:哌啶(v/v)混合液(0.8mL)一次溶于25mL的乙醇中。混合溶液回流反应4h后，真空移除溶液，制备并液相分离、纯化得到最终产物(Ⅲ)：

[0044]

[0045] 其中，催化剂体系乙酸:哌啶(v/v)＝1:1～1:4。

[0046] 该最终产物(即式Ⅲ结构的双链DNA结合荧光染料)的核磁共振谱图如图2所示。

[0047] 实施例2实时荧光定量PCR扩增

[0048] 针对目的基因GAPDH，以Promega Control DNA为模板，以实施例1制备的式Ⅲ化合物为荧光染料，使用ABI 7500荧光定量PCR仪，进行实时荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR扩增的引物序列分别如下：

[0049] 上游引物：CTGCCAGCCTAGCGTTGAC(SEQ ID NO:1)

[0050] 下游引物：CCAATCCTCCCGGTGACAT(SEQ ID NO:2)

[0051] 20μL PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，2.5mM dNTP 1.6μL，25mM MgCl21.6μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，ROX II 0.2μL，5U/μL rTap酶(TAKARA)0.125μL，模板DNA(Promega Control DNA)1.0μL(分别含80、40、20、10、5ng DNA)，式Ⅲ结构的荧光染料1.0μL(终浓度分别为0.375nM、0.75nM、1.5nM和3nM)，加水补齐至最终体积20.0μL。

[0052] PCR反应条件为：95℃预变性30s；95℃扩增5s，60℃34s，共40个循环。

[0053] 对比试剂20μL PCR反应体系为： Premix Ex TaqTM II缓冲液10μL，ROX II 0.2μL，模板DNA(Promega Control DNA)1.0μL(含20ng DNA)，加水补齐至最终体积20.0μL。PCR反应条件同上。

[0054] 使用式Ⅲ结构的荧光染料的PCR扩增曲线结果如图3-6所示。使用对比试剂SYBR的PCR扩增曲线结果如图7所示。使用式Ⅲ结构的荧光染料的PCR定量的标准曲线结果如图8～11所示。使用对比试剂SYBR的PCR定量的标准曲线结果如图12所示。由图3～6和图8～11可以证实，本发明实施例1制备的式Ⅲ化合物可以用作荧光染料，在较大的浓度范围内，均能应用于核酸的实时扩增检测，通过荧光强度的变化实时监测荧光定量PCR反应，实现基因的相对定量分析。

[0055] 实施例3染色效果对比实验

[0056] 将上述实施例1制备的双链DNA结合荧光染料(终浓度为0.6μM)与EB溴化乙锭(终浓度为5μM)和1×Gelred商业化核酸染料分别用DL2000 Marker进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图13-15所示，其中，图13为EB染料，图14为Gelred染料，图15为实施例1制备的双链DNA结合荧光染料，1-4条带对应的DL2000 Marker上样量依次为：200、100、50和25ng。

[0057] 由图13-15可以看到，本发明实施例1制备的双链DNA结合荧光染料，相比Gelred和EB染料，不仅可以获得与Gelred和EB染料相当的染色效果，而且根据同样条件下获得的凝胶电泳测试结果可知，与Gelred染料相比，使用本发明实施例1制备的双链DNA结合荧光染料染色后的核酸，在凝胶电泳中不存在拖尾现象，对不同大小的DNA片段的区分更为明显。

[0058] 实施例4细胞毒性实验

[0059] 将Hela细胞在37℃下分别在1×本发明实施例1制备的双链DNA结合荧光染料和1×SYBR Safe内培育30分钟。所得样品在荧光显微镜下拍照，曝光时间均为400ms。实施例1制备的双链DNA结合荧光染料选用CY3滤光片，SYBR Safe选用FITC滤光片。SYBR Safe和实施例1制备的双链DNA结合荧光染料的细胞毒性安全性能测试结果分别如图16和图17所示。由图16可以清晰看到，SYBR Safe可以很快穿透细胞膜并将核酸部分染色，但是由图17所示可以证实，本发明实施例1制备的双链DNA结合荧光染料，因为不能穿透细胞膜，所以几乎看不到任何被染色的物质，可见本发明实施例1制备的双链DNA结合荧光染料，相比SYBR Safe核酸染料，对细胞具有更高的安全性。