一种高灵敏和双选择性的CTC检测SPR传感器及其制备方法

摘要

本发明公开了一种检测CTC的SPR生物传感系统，包括SPR生物传感器、细胞膜功能化的纳米颗粒和叶酸修饰的纳米颗粒，SPR生物传感器包括表面修饰有JUP抗体的免疫芯片，细胞膜功能化的纳米颗粒含有JUP蛋白和叶酸受体，细胞膜功能化的纳米颗粒通过抗原‑抗体的相互作用与免疫芯片结合，叶酸修饰的纳米颗粒通过叶酸‑叶酸受体的相互作用与细胞膜功能化的纳米颗粒结合。本发明利用细胞膜功能化的金纳米颗粒与叶酸修饰的金纳米颗粒实现双选择性的结合CTC，改善了单一的抗原抗体特异性识别所出现的假阳性问题，检测成本低，操作方便。

权利要求

1.一种检测CTC的SPR生物传感系统，其特征在于，包括SPR生物传感器、细胞膜功能化的纳米颗粒和叶酸修饰的纳米颗粒，其中，

所述SPR生物传感器包括表面修饰有JUP抗体的免疫芯片，

所述细胞膜功能化的纳米颗粒含有JUP蛋白和叶酸受体，

所述细胞膜功能化的纳米颗粒通过抗原-抗体的相互作用与所述免疫芯片结合，所述叶酸修饰的纳米颗粒通过叶酸-叶酸受体的相互作用与所述细胞膜功能化的纳米颗粒结合。

2.如权利要求1所述的SPR生物传感系统，其中，所述纳米颗粒为金纳米颗粒、磁纳米颗粒或纳米量子点。

3.如权利要求1所述的SPR生物传感系统，其中，所述细胞膜功能化的纳米颗粒的粒径为40-65nm，所述叶酸修饰的纳米颗粒的粒径为15-30nm。

4.如权利要求1所述的SPR生物传感系统，其中，利用该系统的测定方法包括如下步骤：在表面修饰有JUP抗体的免疫芯片上加入80-100μL 10～105细胞/mL的细胞膜功能化的纳米颗粒，和100-120μL 5-8μM的叶酸修饰的纳米颗粒，以30-45min作为孵育时间，在室温条件下使用SPR仪进行CTC的检测。

5.如权利要求4所述的SPR生物传感系统，其中，所述表面修饰有JUP抗体的免疫芯片按下列方法制备：(1)将芯片浸没在蛋白连接剂中反应8-12小时，反应结束后将芯片置于甲醇溶液中洗涤1小时，洗涤之后用超纯水轻轻清洗并用氮气吹干芯片表面的水分，(2)将附着有蛋白连接剂的芯片安装到SPR仪器上，而后，将100μL的0.905μg/mL JUP抗体添加到所述芯片表面上，孵育2小时后，用缓冲液洗涤所述芯片表面以洗脱未连接的JUP抗体，为了避免所述芯片表面上的非特异性吸附，将所述芯片与0.01mg/mL的BSA溶液反应半小时，最终得到表面修饰有JUP抗体的免疫芯片。

6.如权利要求4所述的SPR生物传感系统，其中，所述细胞膜功能化的纳米颗粒按以下方法制备：(a)获得细胞膜碎片：将消化好的癌细胞或全血以1000rpm的转速离心5分钟，将得到的沉淀复溶在等体积的PBS缓冲液中，然后使用超声波清洁仪器以42kw的频率将溶液超声处理5分钟，超声处理后，将溶液以700g离心10分钟，得到上清液，将所述上清液复溶于等体积的PBS缓冲液中，然后以14,000g离心30分钟，所得的上清液即是所需的细胞膜碎片，(b)将步骤(a)中获得的上清液与预先配制的纳米颗粒溶液混合，两者溶液的体积比为

1：1，然后在高压挤出机上依次通过400nm、200nm和100nm的聚碳酸酯膜，最终得到细胞膜功能化的纳米颗粒。

7.如权利要求6所述的SPR生物传感系统，其中，所述纳米颗粒为金纳米颗粒、磁纳米颗粒或纳米量子点。

8.如权利要求6所述的SPR生物传感系统，其中，所述细胞膜功能化的纳米颗粒的粒径为40-65nm。

9.如权利要求4所述的SPR生物传感系统，其中，所述叶酸修饰的纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：(i)通过使用0.1M Na2HPO4制备叶酸溶液：加入50mM NaOH以将pH调节至7，并加入0.1M Na2HPO4直至溶液澄清，产生浓度为约1mM的叶酸溶液,(ii)通过使用1mM新合成的叶酸溶液进行纳米颗粒的功能化：将1mM叶酸溶液加入到

5mL预先合成的纳米颗粒溶液中以获得溶解在5mL纳米颗粒溶液中的12μM的叶酸溶液，并在黑暗中搅拌20分钟，以12,000g离心20分钟后，获得酒红色沉淀，并将其复溶在等体积的PBS缓冲液中，最终得到叶酸修饰的纳米颗粒。

10.如权利要求9所述的SPR生物传感系统，其中，所述纳米颗粒为金纳米颗粒、磁纳米颗粒或纳米量子点，所述叶酸修饰的纳米颗粒的粒径为15-30nm。

说明书

一种高灵敏和双选择性的CTC检测SPR传感器及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及循环肿瘤细胞检测领域，尤其涉及一种基于细胞膜功能化的金纳米的SPR传感器及其制备方法。

背景技术

[0002] 循环肿瘤细胞(CTC)是从肿瘤病变释放到血液系统中的一类细胞，对转移性癌症的扩散起着关键作用。CTC可以反映肿瘤转移进展的风险，并且可以通过检测血液中的CTC来促进精准治疗。因此，CTC的检测对于癌症是非常重要的。目前，主要根据其生物学或物理性质对CTC进行富集和检测，如细胞表面特定的蛋白质、细胞大小和细胞的带电性质。常用的CTC的检测方法包括免疫磁珠法和微流体技术。此外，由Veridex发明的CellSearch是FDA和CFDA唯一批准用于CTC检测的商业产品。CellSearch测定的原理是用抗体包被的磁珠富集过表达上皮细胞粘附分子(EpCAM)的细胞，并通过外部磁场的分离检测全血样品中的细胞。然而，免疫磁珠法或微流体技术都是基于EpCAM的CTC测定方法，但其未能检测低表达EpCAM的癌症。另外，这些方法通常需要很长的预处理时间、昂贵的仪器和较高的成本，这妨碍了它们的临床应用。由于先前测定的限制，需要开发简单、快速且灵敏的测定方法来检测CTC。

[0003] 表面等离子共振技术(SPR)是一种灵敏检测芯片上配位体与目标生物分子相互作用的领先技术，其应用SPR原理检测生物传感芯片上配位体与分析物之间的相互作用情况，广泛应用于各个领域。光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会形成消逝波进入到光疏介质中，而在介质(假设为金属介质)中又存在一定的等离子波。当两波相遇时可能会发生共振。当消逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大部分能量被表面等离子波吸收，使反射光的能量急剧减少。从反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此时对应的入射光波长为共振波长，对应的入射角θ为SPR角。电子吸收光能量，从而使反射光强在一定角度时大大减弱，其中是反射光完全消失的角就是SPR角。SPR角随芯片表面折射率变化而变化，而折射率的变化又与金表面结合的分子质量成正比。因此可以通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取生物分子之间相互作用的特异信号。该技术检测过程方便快捷，灵敏度高，应用范围非常广泛，且可进行实时动态检测,这种方法成为生物分子相互作用研究中的既定工具，并且它被用于快速和灵敏地检测化学和生物分析物。

[0004] 近年来，越来越多的研究集中于纳米粒子在癌症中的应用，尤其是对于癌细胞的检测。金纳米粒子(AuNPs)具有表面积大，制备工艺简单，结构稳定，生物相容性好，表面功能化简单等优点，被广泛应用于各种生物应用，如药物输送、成像、催化和生物传感器等。目前，与AuNPs结合的常见分子主要包括DNA，RNA，蛋白质和药物。由于其广泛的来源、较低的成本、长的循环时间和良好的生物相容性，细胞膜包被这一方法已经受到相当大的关注。用于提取膜的细胞主要包括红细胞、血小板和癌细胞。癌细胞可以提供靶点并增加纳米粒子对癌细胞膜功能化的AuNPs(M-AuNPs)的摄取率。超声处理可以将整个细胞膜破碎成片，并将细胞膜表面上的特异性标志蛋白分散到每个膜碎片上。这种现象增加了检测靶标的数量，从而放大了信号。此外，包封在细胞膜片段中的AuNPs可以对信号有放大作用。因此，M-AuNPs可以应用于灵敏检测CTC。

[0005] 斑珠蛋白(JUP)，又称为γ-连环蛋白，是桥粒的重要组成部分，其主要功能是细胞粘附。KolligsFT的研究已经表明，正常细胞中人为过表达JUP会促进了CTC的迁移，从而导致肿瘤转移。因此，癌细胞表面过表达的JUP已被用作CTC灵敏检测中的标志蛋白。

[0006] 因此，本领域的技术人员致力于开发一种高灵敏、高特异性的CTC检测M-AuNPs的SPR传感器。

发明内容

[0007] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提高检测CTC灵敏度和特异性，以及改善在检测CTC过程中由单一的抗原抗体特异性识别所出现的假阳性问题。

[0008] 为实现上述目的，本发明提供了一种检测CTC的SPR生物传感系统，其特征在于，包括SPR生物传感器、细胞膜功能化的纳米颗粒和叶酸修饰的纳米颗粒，其中，SPR生物传感器包括表面修饰有JUP抗体的免疫芯片，细胞膜功能化的纳米颗粒含有JUP蛋白和叶酸受体，细胞膜功能化的纳米颗粒通过抗原-抗体的相互作用与免疫芯片结合，叶酸修饰的纳米颗粒通过叶酸-叶酸受体的相互作用与细胞膜功能化的纳米颗粒结合。

[0009] 进一步的，纳米颗粒为金纳米颗粒、磁纳米颗粒或纳米量子点。优选为金纳米颗粒。

[0010] 进一步的，细胞膜功能化的纳米颗粒的粒径为40-65nm，叶酸修饰的纳米颗粒的粒径为15-30nm。

[0011] 本发明CTC检测SPR传感方法，在表面修饰有JUP抗体的免疫芯片上加入80-100μL10～105细胞/mL的细胞膜功能化的纳米颗粒，同时，加入100-120μL 5-8μM的叶酸修饰的纳米颗粒，以30-45min作为孵育时间，在室温条件下使用SPR仪进行CTC的检测。进一步的线性方程为：y＝-62.2+292x，线性相关系数为0.9722，检测限为1个细胞/mL。

[0012] 进一步的，表面修饰有JUP抗体的免疫芯片按下列方法制备：

[0013] (1)将芯片浸没在蛋白连接剂中反应过夜，反应结束后将芯片置于甲醇溶液中洗涤一小时，洗涤之后用超纯水轻轻清洗并用氮气吹干芯片表面的水分，

[0014] (2)将附着有蛋白连接剂的芯片安装到SPR仪器上，而后，将100μL的0.905μg/mLJUP抗体添加到芯片表面上，孵育2小时后，用缓冲液洗涤芯片表面以洗脱未连接的JUP抗体，为了避免芯片表面上的非特异性吸附，将芯片与0.01mg/mL的BSA溶液反应半小时，最终得到表面修饰有JUP抗体的免疫芯片。

[0015] 进一步的，细胞膜功能化的纳米颗粒按以下方法制备：

[0016] (a)获得细胞膜碎片：将消化好的癌细胞或全血以1000rpm的转速离心5分钟，将得到的沉淀复溶在等体积的PBS缓冲液中，然后使用超声波清洁仪器以42kw的频率将溶液超声处理5分钟，超声处理后，将溶液以700g离心10分钟，得到上清液，将上清液复溶于等体积的PBS缓冲液中，然后以14,000g离心30分钟，所得的上清液即是所需的细胞膜碎片，[0017] (b)将步骤(a)中获得的上清液与预先配制的纳米颗粒溶液混合，两者溶液的体积比为1：1，然后在高压挤出机上依次通过400nm、200nm和100nm的聚碳酸酯膜，最终得到细胞膜功能化的纳米颗粒。

[0018] 进一步的，纳米颗粒为金纳米颗粒、磁纳米颗粒或纳米量子点。

[0019] 进一步的，细胞膜功能化的纳米颗粒的粒径为40-65nm。

[0020] 进一步的，叶酸修饰的纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：

[0021] (i)通过使用0.1M Na2HPO4制备叶酸溶液：加入50mM NaOH以将pH调节至7，并加入0.1M Na2HPO4直至溶液澄清，产生浓度为约1mM的叶酸溶液,

[0022] (ii)通过使用1mM新合成的叶酸溶液进行纳米颗粒的功能化：将1mM叶酸溶液加入到5mL预先合成的纳米颗粒溶液中以获得溶解在5mL纳米颗粒溶液中的12μM的叶酸溶液，并在黑暗中搅拌20分钟，以12,000g离心20分钟后，获得酒红色沉淀，并将其复溶在等体积的PBS缓冲液中，最终得到叶酸修饰的纳米颗粒。

[0023] 进一步的，纳米颗粒为金纳米颗粒、磁纳米颗粒或纳米量子点，叶酸修饰的纳米颗粒的粒径为15-30nm。

[0024] 技术效果

[0025] 与现有技术相比，本发明使用灵敏的SPR技术能够检测极微量的目标物CTC，使用到的SPR具有极低的检测限，能检测低至1个细胞，该方法利用细胞膜碎片、细胞膜内包裹的金纳米颗粒与叶酸修饰的金纳米颗粒三重手段来实现灵敏检测CTC，达到信号放大作用，从而导致SPR角度的显著增大。

[0026] 本发明利用细胞膜功能化的金纳米颗粒与叶酸修饰的金纳米颗粒实现双选择性的结合CTC，改善了单一的抗原抗体特异性识别所出现的假阳性问题，检测成本低，操作方便。

[0027] 本方法操作简便，成本低廉并具有高特异性与灵敏度。

[0028] 以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

[0029] 图1是本发明的M-AuNPs的TEM图；

[0030] 图2是本发明的AuNPs，M-AuNPs和FA-AuNPs的紫外光谱图；

[0031] 图3是本发明的AuNPs，M-AuNPs和FA-AuNPs的粒径图；

[0032] 图4是本发明的AuNPs，M-AuNPs和FA-AuNPs的Zeta电位图；

[0033] 图5是本发明的不同细胞浓度与SPR角变化间的线性相关关系图。

具体实施方式

[0034] 以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

[0035] 本发明中细胞膜包裹的金纳米颗粒可以换成其他纳米粒子，包括磁纳米颗粒、纳米量子点，以实现不同的检测目的。

[0036] 本发明的原理为：通过用JUP过表达掺加人乳腺癌细胞系MCF-7来模拟人工CTC样品。Prolinker是含有-SH的杯芳烃衍生物，Prolinker可以通过金-巯键与芯片表面结合，Prolinker的杯芳烃空腔可以用来将JUP抗体锚定到芯片表面。通过将细胞膜碎片与AuNPs挤压得到细胞膜包裹的金纳米颗粒(M-AuNPs)。在存在癌细胞的情况下，细胞膜表面过表达的JUP蛋白和叶酸受体可以被涂覆到AuNPs上。M-AuNPs特异性地与JUP抗体和叶酸功能化的AuNPs(FA-AuNPs)相互作用。由于芯片上存在JUP抗体，M-AuNPs上含有JUP，通过抗原抗体的特异性相互作用，使M-AuNPs能够与芯片表面结合，SPR芯片上的折射率会发生改变，利用SPR的角度变化来灵敏检测CTC。因此，这种基于M-AuNPs的策略可以通过双重识别和多重信号放大手段来实现，以实现对CTC的有效和灵敏的检测。将癌细胞膜包裹的纳米粒子作为SPR信号放大的手段，这种方法为实现CTC的灵敏检测提供了一种新平台。

[0037] 利用M-AuNPs与FA-AuNPs特异性检测CTC的SPR测定方法如下：

[0038] (a)M-AuNPs的合成步骤为：为了获得细胞膜碎片，将消化好的癌细胞或全血以1000rpm的转速离心5分钟，将得到的沉淀复溶在等体积的PBS缓冲液中，然后使用超声波清洁仪器以42kw的频率将溶液超声处理5分钟。超声处理后，将溶液以700g离心10分钟。将上清液复溶于等体积的PBS缓冲液中，然后以14,000g离心30分钟，所得的上清液即是所需的细胞膜碎片。将获得的细胞膜碎片与预先配制的AuNPs混合，然后在高压挤出机上依次通过
400nm、200nm和100nm的聚碳酸酯膜，得到细胞膜包裹的金纳米颗粒(M-AuNPs)。对照组为AuNPs。结果如图1-4所示，通过动态光散射(DLS)，Zeta电位和透射电子显微镜(TEM)表征所得到的M-AuNPs。可以发现，金纳米颗粒在细胞膜功能化前后的粒径、电位、紫外吸收都发生了改变，证明细胞膜的成功修饰。

[0039] (b)叶酸修饰的金纳米颗粒的合成步骤为：叶酸修饰的金纳米颗粒的合成步骤与参考文献相同。首先，通过使用0.1M Na2HPO4制备叶酸(FA)溶液，加入50mM NaOH以将pH调节至7，并加入0.1M Na2HPO4直至溶液澄清，产生浓度为约1mM的FA溶液。其次，通过使用1mM新合成的FA溶液进行AuNPs的功能化。将1mM FA溶液加入到5mL预先合成的AuNPs中以获得溶解在5mL AuNPs中的12μM的FA溶液，并在黑暗中搅拌20分钟。在12,000g下离心20分钟后，获得酒红色沉淀，并将其复溶在等体积的PBS缓冲液中。如图2-4所示，FA-AuNPs的紫外吸收峰值、粒径及电位相较于AuNPs都发生了改变，证明FA-AuNPs的成功合成。其中，参考文献为：Zhao,S.S.,Bichelberger,M.A.,Colin,D.Y.,Robitaille,R.,Pelletier,J.N.,&Masson,J.F.(2012).Monitoring methotrexate in clinical samples from cancer patients during chemotherapy with a LSPR-based competitive sensor.Analyst,137(20),
4742-4750.

[0040] (c)SPR检测CTC：所用的SPR芯片为市场上购买，芯片类型为autolabSPRchip。首先，配置0.1mM的Prolinker溶液，将芯片置于Prolinker溶液中反应过夜，反应结束后将芯片置于甲醇溶液中洗涤一小时，洗涤之后用超纯水轻轻清洗并用氮气吹干芯片表面的水分。之后，将附着有Prolinker的芯片安装到SPR仪器上。而后，将100μL的0.905μg/mL JUP抗体添加到附着有Prolinker的芯片表面上。孵育2小时后，用缓冲液洗涤芯片表面以洗脱未连接的抗体。为了避免芯片表面上的非特异性吸附，将芯片与0.01mg/mL的BSA溶液反应半5
小时。然后，加入100μL 10 细胞/mL的M-AuNPs。由于细胞膜表面含有JUP蛋白，可以被芯片表面的JUP抗体特异性识别，从而将细胞膜结合到芯片表面。同时，由于癌细胞膜表面过表达FA受体，加入100μL 6μM的FA-AuNPs，FA与FA受体特异性识别，将FA-AuNPs结合到芯片表面，对信号进一步放大。

[0041] 其中，采用的CTC细胞浓度分别为：105细胞/mL，104细胞/mL，103细胞/mL，102细胞/mL，101细胞/mL

[0042] 测试条件：使用SPR仪，以30min作为孵育时间，在室温条件下进行不同浓度的CTC下的SPR测定。如图2所示，随着CTC浓度的增大，造成的SPR角的变化也越大，并且细胞浓度与SPR角变化间呈现出较好的线性相关关系。线性方程为：y＝-62.2+292x，线性相关系数为0.9722，检测限为1个细胞/mL，符合检测要求。

[0043] 上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，都属于本发明的保护范围。