一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法转让专利
申请号 : CN201910903450.4
文献号 : CN110663548B
文献日 : 2021-05-04
发明人 : 叶秀仙 , 陈艺荃 , 方能炎 , 林兵 , 吴建设
申请人 : 福建省农业科学院作物研究所
摘要 :
权利要求 :
1.一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,其特征在于:该方法包括如下操作步骤:
(1)外植体的选择与消毒:选择健康母株为外植体取材对象,切取带有成熟孢子的叶片,冲洗干净,将叶片切割成片块,放入装有无菌水的超声波清洗器震荡清洗30~40min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸巾吸干水分,用利刀刮下孢子,备用;
(2)孢子萌发:取步骤(1)的孢子,接种到孢子萌发培养基中进行无菌萌发,培养10~
15d,孢子由褐色逐渐转绿,并膨胀生长,产生类似兰花原球茎的绿色球状体GGB,培养28~
35d,孢子萌发,且不更换培养基继续培养30~40d,GGB大量增殖,增殖系数达5.0~5.5;
(3)GGB分化培养:将步骤(2)获得GGB,转入GGB分化培养基进行芽分化培养,培养50~
60d,获得丛芽团;
(4)生根培养:将步骤(3)获得的丛芽切割成单芽,并接种于生根培养基上进行培养,培养70~75d即获得完整植株;
(5)试管苗移栽:移栽前,将步骤(4)获得的瓶苗进行炼苗至适应栽培环境,炼苗完成后洗苗,洗净根部粘连的培养基,之后将苗置于杀菌剂溶液浸泡消毒5~6min,取出晾干,然后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于22~28℃的温室层架上进行常规栽培管理即可;
其中,孢子萌发培养基的组分为:花宝1号1.5~2.0g/L、KNO30.95g/L、(NH4)2SO40.85g/L、KH2PO40.25mg/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2~0.4g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 mg/L、VB18.0~10.0mg/L、VB53.0~5.0mg/L、VB61.0 mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇150~180mg/L、TDZ 0.3~0.5mg/L、NAA0.1~0.2mg/L、活性炭0.5~0.8g/L、白糖
30.0~35.0g/L、凝固剂5.6~6.0g/L;
GGB分化培养基的组分为:花宝1号1.2~1.5g/L、KNO30.95g/L、(NH4)2SO40.85 g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、MnSO4· H2O 16.9mg/L、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、H3BO36.2 mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/L、CoCl2·
6H2O 0.025mg/L、CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2· EDTA37.3mg/L、VB15.0~8.0mg/L、VB52.0~3.0mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇180~200mg/L、6-BA0.2~0.3mg/L、KT 0.05~0.1mg/L、NAA0.2~0.3mg/L、IBA0.3~0.5mg/L、马铃薯粉1.5~
3.0g/L、水解乳蛋白0.5~0.8g/L、白糖30.0~35.0g/L、凝固剂6.0~7.2g/L;
生根培养基的组分为:花宝1号1.0~1.2g/L、KNO30.65g/L、(NH4)2SO4 0.6g/L、KH2PO40.1g/L、MgSO4·7H2O 0.25mg/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 mg/L、VB12.0~3.0mg/L、VB51.0~2.0mg/L、VB66.0~8.0mg/L、甘氨酸2.0~
4.0mg/L、肌醇110~130mg/L、NAA 0.3~0.5mg/L、白糖20.0~25.0g/L、活性炭0.3~0.5g/L、香蕉粉3.0~4.0g/L、凝固剂7.2~7.6g/L。
2.根据权利要求1所述一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,其特征在于:所述步骤(1)中,超声波清洗器使用前需放置在超净工作台上,先经紫外灯消毒30~60min,然后再加入无菌水;无菌水与无菌容器的灭菌操作均具体为:将无菌水或无菌容器置于121℃下灭菌30~40min即可。
3.根据权利要求1所述一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,其特征在于:所述孢子萌发、分化及生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物,且琼脂粉与卡拉胶质量比3:1。
4.根据权利要求1所述一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,其特征在于:所述萌发、分化及生根培养基的pH值均为5.8~6.0;
且孢子萌发与分化培养、生根培养的培养温度均为25±2℃,孢子萌发与分化培养,接种后弱光培养7~10d,即为培养室自然散射光培养,之后转入光培养,光强为1000~
1500lx,光照10h/d,生根培养的光强为1800~2000lx,光照12h/d。
5.根据权利要求1所述一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,其特征在于:所述步骤(5)中,炼苗是在遮光率为70~80%、温度为22~28℃的温室中进行,且闭口7~10d、半敞口3~5d、全敞口2~3d。
说明书 :
一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育
苗方法
【技术领域】
【背景技术】
泰国也有分布。该种已列入国家二级保护植物。其株型奇特,姿态优美,是观赏蕨中姿态最
为奇特的一类蕨类植物。其叶有二型,分为基部盾形叶和孢子叶,基部盾形叶又叫不育叶或
营养叶,呈圆形、椭圆形或扇形,以覆瓦状贴生于根状茎上;孢子叶又叫可育叶或正常叶,呈
直立或下垂状,形状多为多回分叉,分枝宛如梅花鹿角,嫩叶呈灰绿色,成熟叶则转为深绿
色,是鹿角蕨的主要观赏部位,孢子囊散生于孢子叶主裂片第一次分叉的凹缺处以下,初时
绿色,后变黄色。鹿角蕨常作为室内垂吊或壁挂的观赏植物,在欧美的公园、植物园、商店、
居室、窗台等地方的装饰与布置十分流行,具有抗逆性强,观赏期长等的优势,是国际园艺
界著名的观叶植物,亦是室内立体绿化的好材料,雅致而充满异国风情,深受人们喜爱,应
用前景广阔。
繁殖,从而近年愈来愈受到从业人员的重视。
鹿角蕨组织培养的研究[J].生物学杂志,2004, 21(5):22-24]。2000年王承义等报道细胞
分裂素、蔗糖对鹿角蕨芽分化的影响,认为6-BA适宜不定芽分化,30g/L用糖量为最优。[王
承义,王颖. 鹿角蕨的组织培养[J].中国林副特产,2000,3(54):23-24]。申请号为
CN201510087218.X、名称为“一种鹿角蕨组培快繁的方法”的中国专利中,公开了以鹿角蕨
细嫩孢子叶为外植体,经过外植体消毒、GGB诱导、增殖、分化、生根等过程建立了鹿角蕨离
体组培快繁方法。
题。而鹿角蕨的孢子数量巨大,且孢子附着在叶背,暴露于空气中,如何采取有效消毒方法,
避免孢子因被消毒剂杀伤致成活率低下而影响萌发,另外如何创造萌发条件促进大量萌
发,并使其快速成苗,发育成健壮组培苗,已成为鹿角蕨能否规模化生产的关键。由鉴于此,
研究或优化,以期得到一种操作过程相对便捷、萌发率高、培养效率与移栽成活率均较为理
想的鹿角蕨种苗的组织培养快速繁殖方法,是从业人员所迫切希望的。
【发明内容】
培养效率与移栽成活率。
洗器震荡清洗30~40min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸巾吸干水分,
用利刀刮下孢子,备用;
28~35d,萌发率达100%,且不更换培养基继续培养30~40d,GGB可大量增殖,增殖系数达
5.0~5.5;
率100.0%;
~6min,取出晾干,然后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于22~28℃的温室层架上进行常
规栽培管理即可;
7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 mg/L、VB18.0~10.0 mg/L、VB53.0~5.0mg/L、VB61.0 mg/L、
甘氨酸2.0mg/L、肌醇150~180mg/L、 TDZ 0.3~0.5mg/L、NAA0.1~0.2mg/L、活性炭0.5~
0.8g/L、白糖30.0~35.0g/L、凝固剂5.6~6.0g/L;
ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、H3BO36.2 mg/L、 KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/L、CoCl2·
6H2O 0.025mg/L、 CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2· EDTA37.3mg/
L、 VB15.0~8.0mg/L、VB52.0~3.0mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇 180~200mg/L、
6-BA0.2~0.3mg/L、KT 0.05~0.1mg/L、NAA0.2~0.3mg/L、 IBA0.3~0.5mg/L、马铃薯粉
1.5~3.0g/L、水解乳蛋白0.5~0.8g/L、白糖 30.0~35.0g/L、凝固剂6.0~7.2g/L;
EDTA37.3 mg/L、VB12.0~3.0mg/L、VB51.0~2.0 mg/L、VB66.0~8.0mg/L、甘氨酸2.0~
4.0mg/L、肌醇110~130mg/L、NAA 0.3~0.5mg/L、白糖20.0~25.0g/L、活性炭0.3~0.5g/
L、香蕉粉3.0~4.0g/L、凝固剂7.2~7.6g/L。
水或无菌容器置于121℃下灭菌30~40min即可。
10d,即为培养室自然散射光培养,之后转入光培养,光强为1000~1500lx,光照10h/d,生根
培养的光强为1800~2000lx,光照12h/d。
发率高,GGB增殖率高、成苗时间短,即繁殖效率高,进而提高了整个种苗培养的效率;
法克服了现有技术中鹿角蕨种苗培养操作过程相对较为繁复、效率低、组培苗抗性差,移栽
成活率低的缺陷。
【具体实施方式】
洗器震荡清洗30~40min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸巾吸干水分,
用利刀刮下孢子,备用。
28~35d,萌发率达100%,且不更换培养基继续培养30~40d,GGB可大量增殖,增殖系数达
5.0~5.5。
率100.0%;
~6min,取出晾干,然后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于22~28℃的温室层架上进行常
规栽培管理即可。
7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 mg/L、VB18.0~10.0 mg/L、VB53.0~5.0mg/L、VB61.0 mg/L、
甘氨酸2.0mg/L、肌醇150~180mg/L、 TDZ 0.3~0.5mg/L、NAA0.1~0.2mg/L、活性炭0.5~
0.8g/L、白糖30~35g/L、凝固剂5.6~6.0g/L;
ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、H3BO36.2 mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/L、CoCl2·
6H2O 0.025mg/L、 CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2· EDTA37.3mg/
L、 VB15.0~8.0mg/L、VB52.0~3.0mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇180~200mg/L、
6-BA0.2~0.3mg/L、KT 0.05~0.1mg/L、NAA0.2~0.3mg/L、 IBA0.3~0.5mg/L、马铃薯粉
1.5~3.0g/L、水解乳蛋白0.5~0.8g/L、白糖 30.0~35.0g/L、凝固剂6.0~7.2g/L;
EDTA37.3 mg/L、VB12.0~3.0mg/L、VB51.0~2.0 mg/L、VB66.0~8.0mg/L、甘氨酸2.0~
4.0mg/L、肌醇110~130mg/L、NAA 0.3~0.5mg/L、白糖20.0~25.0g/L、活性炭0.3~0.5g/
L、香蕉粉3.0~4.0g/L、凝固剂7.2~7.6g/L。
pH值均为5.8~6.0;且孢子萌发与分化培养、生根培养的培养温度均为(25±2)℃,孢子萌
发与分化培养,接种后弱光培养7~10d,即为培养室自然散射光培养,之后转入光培养,光
强为 1000~1500lx,光照10h/d,生根培养的光强为1800~2000lx,光照12h/d。
度分别为1400g/cm2、1500g/cm2;白糖为市售质量等级一级的袋装白砂糖。
菌水的超声波清洗器震荡清洗30min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸
巾吸干水分,用利刀刮下孢子,备用。
达100.0%),随后GGB大量增殖,接种30d,瓶底长满密密麻麻的GGB团块,增殖系数达5.0;孢
子萌发培养基的组分为:花宝1号1.5g/L、KNO30.95g/L、(NH4)2SO40.85g/L、KH2PO40.25mg/L、
MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、
VB18.0 mg/L、VB53.0 mg/L、VB61.0 mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇150mg/L、TDZ 0.3mg/L、
NAA0.1 mg/L、活性炭0.5g/L、白糖30.0g/L、凝固剂5.6g/L。
2SO40.85 g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、MnSO4· H2O
16.9mg/L、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、 H3BO36.2 mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/
L、CoCl2· 6H2O 0.025mg/L、CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2·
EDTA 37.3mg/L、VB15.0mg/L、VB52.0mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇180mg/L、6-
BA0.2 mg/L、KT 0.05mg/L、NAA0.2mg/L、IBA 0.3mg/L、马铃薯粉1.5g/L、水解乳蛋白0.5g/
L、白糖30.0g/L、凝固剂6.0g/L。
壮);生根培养基的组分为:花宝1号1.0g/L、KNO3 0.65g/L、(NH4)2SO40.6 g/L、KH2PO40.1g/
L、MgSO4·7H2O 0.25mg/L、 CaCl2·2H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3
mg/L、VB12.0 mg/L、VB51.0mg/L、VB66.0 mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇110mg/L、NAA0.3 mg/L、
白糖20.0g/L、活性炭0.3g/L、香蕉粉3.0g/L、凝固剂7.2g/L。
浸泡消毒5min,取出晾干后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于温室层架上进行常规栽培
管理,2个月移栽成活率达98.0%。
水的超声波清洗器震荡清洗35min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸巾
吸干水分,用利刀刮下孢子,备用。
达100.0%),随后GGB大量增殖,接种35d,瓶底长满密密麻麻的GGB团块,增殖系数达5.2;孢
子萌发培养基的组分为:花宝1号1.8g/L、KNO30.95g/L、(NH4)2SO40.85g/L、KH2PO40.25mg/L、
MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.3g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、
VB19.0 mg/L、VB54.0mg/L、VB61.0 mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇160mg/L、TDZ 0.4mg/L、
NAA0.2 mg/L、活性炭0.6g/L、白糖33.0g/L、凝固剂5.8g/L。
2SO40.85 g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、MnSO4· H2O
16.9mg/L、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、 H3BO36.2 mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O0.25 mg/
L、CoCl2· 6H2O 0.025mg/L、CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2·
EDTA 37.3mg/L、VB16.0mg/L、VB52.5mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇190mg/L、6-
BA0.3 mg/L、KT 0.1mg/L、NAA0.3 mg/L、IBA 0.4mg/L、马铃薯粉2.0g/L、水解乳蛋白0.6g/
L、白糖33.0g/L、凝固剂6.6g/L。
壮);生根培养基的组分为:花宝1号1.1g/L、KNO3 0.65g/L、(NH4)2SO40.6 g/L、KH2PO40.1g/
L、MgSO4·7H2O 0.25mg/L、 CaCl2·2H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3
mg/L、VB12.5 mg/L、VB51.5 mg/L、VB67.0 mg/L、甘氨酸3.0mg/L、肌醇120mg/L、NAA 0.4mg/
L、白糖23.0g/L、活性炭0.4g/L、香蕉粉3.5g/L、凝固剂7.4g/L。
浸泡消毒6min,取出晾干后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于温室层架上进行常规栽培
管理,2个月移栽成活率达98.5%。
菌水的超声波清洗器震荡清洗40min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸
巾吸干水分,用利刀刮下孢子,备用。
达100.0%),随后GGB大量增殖,接种40d,瓶底长满密密麻麻的GGB团块,增殖系数达5.5;孢
子萌发培养基的组分为:花宝1号2.0g/L、KNO30.95g/L、(NH4)2SO40.85g/L、KH2PO40.25mg/L、
MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.4g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、
VB110.0 mg/L、VB55.0 mg/L、VB61.0 mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇180mg/L、TDZ 0.5mg/L、
NAA0.2 mg/L、活性炭0.8g/L、白糖35.0g/L、凝固剂6.0g/L。
L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、MnSO4· H2O 16.9mg/L、
ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、H3BO36.2 mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/L、CoCl2·
6H2O 0.025mg/L、 CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2· EDTA37.3mg/
L、 VB15.0~8.0mg/L、VB53.0mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇 180~200mg/L、6-
BA0.3 mg/L、KT 0.1mg/L、NAA0.3 mg/L、IBA0.5 mg/L、马铃薯粉3.0g/L、水解乳蛋白0.8g/
L、白糖35.0g/L、凝固剂7.2g/L。
壮);生根培养基的组分为:花宝1号1.2g/L、KNO3 0.65g/L、(NH4)2SO40.6 g/L、KH2PO40.1g/
L、MgSO4·7H2O 0.25mg/L、 CaCl2·2H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3
mg/L、VB13.0 mg/L、VB52.0 mg/L、VB68.0 mg/L、甘氨酸4.0mg/L、肌醇130mg/L、NAA 0.5mg/
L、白糖25.0g/L、活性炭0.5g/L、香蕉粉4.0g/L、凝固剂7.6g/L。
浸泡消毒6min,取出晾干后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于温室层架上进行常规栽培
管理,2个月移栽成活率达99.0%。
且孢子萌发率高,GGB增殖率高、成苗时间短,即繁殖效率高,进而提高了整个种苗培养的效
率;
法克服了现有技术中鹿角蕨种苗培养操作过程相对较为繁复、效率低、组培苗抗性差,移栽
成活率低的缺陷。
领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化,都应当涵盖在本发明的
权利要求所保护的范围内。