一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法转让专利

申请号 : CN201910903450.4

文献号 : CN110663548B

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法律信息:

相似专利:

发明人 : 叶秀仙陈艺荃方能炎林兵吴建设

申请人 : 福建省农业科学院作物研究所

摘要 :

本发明提供一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,是以鹿角蕨带有成熟孢子的叶片为外植体取材对象,设计各培养阶段专用培养基配方,通过孢子‑GGB‑芽达到快速繁殖目的,包括以下步骤:外植体的选择和消毒、孢子萌发、GGB分化培养、生根培养及试管苗移栽。采用本发明方法仅需178d至210d就能获得鹿角蕨种苗;本发明孢子萌发与GGB增殖同步进行,简化了培养环节、降低了培养成本,且孢子萌发率高,GGB增殖率高、成苗时间短,即繁殖效率高,进而提高了整个种苗培养的效率;另外,本发明培养的试管苗健壮、根系发达,且通过驯化炼苗,其环境适应能力较强,从而提高了种苗移栽成活率,从而实现鹿角蕨种苗快速繁育的目的。

权利要求 :

1.一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,其特征在于:该方法包括如下操作步骤:

(1)外植体的选择与消毒:选择健康母株为外植体取材对象,切取带有成熟孢子的叶片,冲洗干净,将叶片切割成片块,放入装有无菌水的超声波清洗器震荡清洗30~40min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸巾吸干水分,用利刀刮下孢子,备用;

(2)孢子萌发:取步骤(1)的孢子,接种到孢子萌发培养基中进行无菌萌发,培养10~

15d,孢子由褐色逐渐转绿,并膨胀生长,产生类似兰花原球茎的绿色球状体GGB,培养28~

35d,孢子萌发,且不更换培养基继续培养30~40d,GGB大量增殖,增殖系数达5.0~5.5;

(3)GGB分化培养:将步骤(2)获得GGB,转入GGB分化培养基进行芽分化培养,培养50~

60d,获得丛芽团;

(4)生根培养:将步骤(3)获得的丛芽切割成单芽,并接种于生根培养基上进行培养,培养70~75d即获得完整植株;

(5)试管苗移栽:移栽前,将步骤(4)获得的瓶苗进行炼苗至适应栽培环境,炼苗完成后洗苗,洗净根部粘连的培养基,之后将苗置于杀菌剂溶液浸泡消毒5~6min,取出晾干,然后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于22~28℃的温室层架上进行常规栽培管理即可;

其中,孢子萌发培养基的组分为:花宝1号1.5~2.0g/L、KNO30.95g/L、(NH4)2SO40.85g/L、KH2PO40.25mg/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2~0.4g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 mg/L、VB18.0~10.0mg/L、VB53.0~5.0mg/L、VB61.0 mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇150~180mg/L、TDZ 0.3~0.5mg/L、NAA0.1~0.2mg/L、活性炭0.5~0.8g/L、白糖

30.0~35.0g/L、凝固剂5.6~6.0g/L;

GGB分化培养基的组分为:花宝1号1.2~1.5g/L、KNO30.95g/L、(NH4)2SO40.85 g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、MnSO4· H2O 16.9mg/L、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、H3BO36.2 mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/L、CoCl2· 

6H2O 0.025mg/L、CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2· EDTA37.3mg/L、VB15.0~8.0mg/L、VB52.0~3.0mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇180~200mg/L、6-BA0.2~0.3mg/L、KT 0.05~0.1mg/L、NAA0.2~0.3mg/L、IBA0.3~0.5mg/L、马铃薯粉1.5~

3.0g/L、水解乳蛋白0.5~0.8g/L、白糖30.0~35.0g/L、凝固剂6.0~7.2g/L;

生根培养基的组分为:花宝1号1.0~1.2g/L、KNO30.65g/L、(NH4)2SO4 0.6g/L、KH2PO40.1g/L、MgSO4·7H2O 0.25mg/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 mg/L、VB12.0~3.0mg/L、VB51.0~2.0mg/L、VB66.0~8.0mg/L、甘氨酸2.0~

4.0mg/L、肌醇110~130mg/L、NAA 0.3~0.5mg/L、白糖20.0~25.0g/L、活性炭0.3~0.5g/L、香蕉粉3.0~4.0g/L、凝固剂7.2~7.6g/L。

2.根据权利要求1所述一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,其特征在于:所述步骤(1)中,超声波清洗器使用前需放置在超净工作台上,先经紫外灯消毒30~60min,然后再加入无菌水;无菌水与无菌容器的灭菌操作均具体为:将无菌水或无菌容器置于121℃下灭菌30~40min即可。

3.根据权利要求1所述一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,其特征在于:所述孢子萌发、分化及生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物,且琼脂粉与卡拉胶质量比3:1。

4.根据权利要求1所述一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,其特征在于:所述萌发、分化及生根培养基的pH值均为5.8~6.0;

且孢子萌发与分化培养、生根培养的培养温度均为25±2℃,孢子萌发与分化培养,接种后弱光培养7~10d,即为培养室自然散射光培养,之后转入光培养,光强为1000~

1500lx,光照10h/d,生根培养的光强为1800~2000lx,光照12h/d。

5.根据权利要求1所述一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,其特征在于:所述步骤(5)中,炼苗是在遮光率为70~80%、温度为22~28℃的温室中进行,且闭口7~10d、半敞口3~5d、全敞口2~3d。

说明书 :

一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育

苗方法

【技术领域】

[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域,具体涉及一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法。
【背景技术】
[0002] 鹿角蕨(Platycerium wallichii Hook.)为鹿角蕨科鹿角蕨属多年生常绿草本植物,原产于中国云南西南部盈江县那邦坝,海拔210-950米山地雨林中,缅甸、印度东北部、
泰国也有分布。该种已列入国家二级保护植物。其株型奇特,姿态优美,是观赏蕨中姿态最
为奇特的一类蕨类植物。其叶有二型,分为基部盾形叶和孢子叶,基部盾形叶又叫不育叶或
营养叶,呈圆形、椭圆形或扇形,以覆瓦状贴生于根状茎上;孢子叶又叫可育叶或正常叶,呈
直立或下垂状,形状多为多回分叉,分枝宛如梅花鹿角,嫩叶呈灰绿色,成熟叶则转为深绿
色,是鹿角蕨的主要观赏部位,孢子囊散生于孢子叶主裂片第一次分叉的凹缺处以下,初时
绿色,后变黄色。鹿角蕨常作为室内垂吊或壁挂的观赏植物,在欧美的公园、植物园、商店、
居室、窗台等地方的装饰与布置十分流行,具有抗逆性强,观赏期长等的优势,是国际园艺
界著名的观叶植物,亦是室内立体绿化的好材料,雅致而充满异国风情,深受人们喜爱,应
用前景广阔。
[0003] 鹿角蕨主要的繁殖方法以分株繁殖和孢子繁殖为主,但分株繁殖系数小,孢子自然萌发率低,极大限制了鹿角蕨的应用。利用植物组织培养技术可以实现鹿角蕨种苗快速
繁殖,从而近年愈来愈受到从业人员的重视。
[0004] 2004年黄执缨曾报道二歧鹿角蕨以幼嫩真叶为外植体,先诱导形成绿色球状体(GGB),后经GGB增殖与芽分化,再经生根培养、炼苗和移栽可获得大量种苗。[黄执缨.二歧
鹿角蕨组织培养的研究[J].生物学杂志,2004, 21(5):22-24]。2000年王承义等报道细胞
分裂素、蔗糖对鹿角蕨芽分化的影响,认为6-BA适宜不定芽分化,30g/L用糖量为最优。[王
承义,王颖.  鹿角蕨的组织培养[J].中国林副特产,2000,3(54):23-24]。申请号为 
CN201510087218.X、名称为“一种鹿角蕨组培快繁的方法”的中国专利中,公开了以鹿角蕨
细嫩孢子叶为外植体,经过外植体消毒、GGB诱导、增殖、分化、生根等过程建立了鹿角蕨离
体组培快繁方法。
[0005] 以上文献虽然报道了鹿角蕨的组织培养技术,但仅限于以幼嫩真叶为外植体,存在繁殖效率低(GGB诱导率50%)、种苗繁殖周期长(8个月以上)、生根率低(94%以下)等问
题。而鹿角蕨的孢子数量巨大,且孢子附着在叶背,暴露于空气中,如何采取有效消毒方法,
避免孢子因被消毒剂杀伤致成活率低下而影响萌发,另外如何创造萌发条件促进大量萌
发,并使其快速成苗,发育成健壮组培苗,已成为鹿角蕨能否规模化生产的关键。由鉴于此,
研究或优化,以期得到一种操作过程相对便捷、萌发率高、培养效率与移栽成活率均较为理
想的鹿角蕨种苗的组织培养快速繁殖方法,是从业人员所迫切希望的。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,不仅培养环节简化即操作过程相对便捷,而且大大提高了萌发率、
培养效率与移栽成活率。
[0007] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的:一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,该方法包括如下操作步骤:
[0008] (1)外植体的选择与消毒:选择健康母株为外植体取材对象,切取带有成熟孢子的叶片,用自来水冲洗干净,将叶片切割成大小5.0×2.0cm片块,放入装有无菌水的超声波清
洗器震荡清洗30~40min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸巾吸干水分,
用利刀刮下孢子,备用;
[0009] (2)孢子萌发:取步骤(1)的孢子,接种到孢子萌发培养基中进行无菌萌发,培养10~15d,孢子由褐色逐渐转绿,并膨胀生长,产生类似兰花原球茎的绿色球状体(GGB),培养
28~35d,萌发率达100%,且不更换培养基继续培养30~40d,GGB可大量增殖,增殖系数达
5.0~5.5;
[0010] (3)GGB分化培养:将步骤(2)获得GGB,转入GGB分化培养基进行芽分化培养,培养50~60d,获得大小为1.8~2.5cm的丛芽团;
[0011] (4)生根培养:将步骤(3)获得的丛芽切割成单芽,并接种于生根培养基上进行培养,培养70~75d即获得株高5.5~6.5cm、根长2.0~3.0cm、根数3~4条的完整植株,且生根
率100.0%;
[0012] (5)试管苗移栽:移栽前,将步骤(4)获得的瓶苗进行炼苗至适应栽培环境,炼苗完成后用自来水洗苗,洗净根部粘连的培养基,之后将苗置于 1.0g/L杀菌剂溶液浸泡消毒5
~6min,取出晾干,然后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于22~28℃的温室层架上进行常
规栽培管理即可;
[0013] 其中,孢子萌发培养基的组分为:花宝1号1.5~2.0g/L、KNO30.95g/L、 (NH4)2SO40.85g/L、KH2PO40.25mg/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2~0.4g/L、FeSO4·
7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 mg/L、VB18.0~10.0 mg/L、VB53.0~5.0mg/L、VB61.0 mg/L、
甘氨酸2.0mg/L、肌醇150~180mg/L、 TDZ 0.3~0.5mg/L、NAA0.1~0.2mg/L、活性炭0.5~
0.8g/L、白糖30.0~35.0g/L、凝固剂5.6~6.0g/L;
[0014] GGB分化培养基的组分为:花宝1号1.2~1.5g/L、KNO30.95g/L、 (NH4)2SO40.85 g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、MnSO4· H2O 16.9mg/L、
ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、H3BO36.2 mg/L、 KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/L、CoCl2· 
6H2O 0.025mg/L、 CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2· EDTA37.3mg/
L、 VB15.0~8.0mg/L、VB52.0~3.0mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇 180~200mg/L、
6-BA0.2~0.3mg/L、KT 0.05~0.1mg/L、NAA0.2~0.3mg/L、 IBA0.3~0.5mg/L、马铃薯粉
1.5~3.0g/L、水解乳蛋白0.5~0.8g/L、白糖 30.0~35.0g/L、凝固剂6.0~7.2g/L;
[0015] 生根培养基的组分为:花宝1号1.0~1.2g/L、KNO30.65g/L、(NH4)2SO4 0.6g/L、KH2PO40.1g/L、MgSO4·7H2O 0.25mg/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、 FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·
EDTA37.3 mg/L、VB12.0~3.0mg/L、VB51.0~2.0 mg/L、VB66.0~8.0mg/L、甘氨酸2.0~
4.0mg/L、肌醇110~130mg/L、NAA 0.3~0.5mg/L、白糖20.0~25.0g/L、活性炭0.3~0.5g/
L、香蕉粉3.0~4.0g/L、凝固剂7.2~7.6g/L。
[0016] 进一步地,所述步骤(1)中,超声波清洗器使用前需放置在超净工作台上,先经紫外灯消毒30~60min,然后再加入无菌水。无菌水与无菌容器的灭菌操作均具体为:将无菌
水或无菌容器置于121℃下灭菌30~40min即可。
[0017] 进一步地,所述萌发、分化及生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物,且琼脂粉与卡拉胶质量比3:1。
[0018] 进一步地,所述孢子萌发、分化及生根培养基的pH值均为5.8~6.0;且孢子萌发与分化培养、生根培养的培养温度均为(25±2)℃,孢子萌发与分化培养,接种后弱光培养7~
10d,即为培养室自然散射光培养,之后转入光培养,光强为1000~1500lx,光照10h/d,生根
培养的光强为1800~2000lx,光照12h/d。
[0019] 进一步地,所述步骤(5)中,炼苗是在遮光率为70~80%、温度为22 ~28℃的温室中进行,且闭口7~10d、半敞口3~5d、全敞口2~3d。
[0020] 本发明的有益效果在于:
[0021] 采用本发明方法,仅需178d至210d就能获得鹿角蕨种苗;且本发明中孢子萌发培养基能够使得孢子萌发与GGB增殖同步进行,简化了培养环节、降低了培养成本,且孢子萌
发率高,GGB增殖率高、成苗时间短,即繁殖效率高,进而提高了整个种苗培养的效率;
[0022] 另外,利用本发明培养的试管苗健壮、根系发达,且通过驯化炼苗,其环境适应能力较强,从而提高了种苗移栽成活率,2个月移栽成活率达98.5%以上;换而言之,本发明方
法克服了现有技术中鹿角蕨种苗培养操作过程相对较为繁复、效率低、组培苗抗性差,移栽
成活率低的缺陷。
【具体实施方式】
[0023] 本发明涉及一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法,该方法包括如下具体操作步骤:
[0024] (1)外植体的选择与消毒:选择健康母株为外植体取材对象,切取带有成熟孢子的叶片,用自来水冲洗干净,将叶片切割成大小5.0×2.0cm片块,放入装有无菌水的超声波清
洗器震荡清洗30~40min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸巾吸干水分,
用利刀刮下孢子,备用。
[0025] (2)孢子萌发:取步骤(1)的孢子,接种到孢子萌发培养基中进行无菌萌发,培养10~15d,孢子由褐色逐渐转绿,并膨胀生长,产生类似兰花原球茎的绿色球状体(GGB),培养
28~35d,萌发率达100%,且不更换培养基继续培养30~40d,GGB可大量增殖,增殖系数达
5.0~5.5。
[0026] (3)GGB分化培养:将步骤(2)获得GGB,转入GGB分化培养基进行芽分化培养,培养50~60d,获得大小为1.8~2.5cm的丛芽团。
[0027] (4)生根培养:将步骤(3)获得的丛芽切割成单芽,并接种于生根培养基上进行培养,培养70~75d即获得株高5.5~6.5cm、根长2.0~3.0cm、根数3~4条的完整植株,且生根
率100.0%;
[0028] (5)试管苗移栽:移栽前,将步骤(4)获得的瓶苗进行炼苗至适应栽培环境,炼苗完成后用自来水洗苗,洗净根部粘连的培养基,之后将苗置于 1.0g/L杀菌剂溶液浸泡消毒5
~6min,取出晾干,然后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于22~28℃的温室层架上进行常
规栽培管理即可。
[0029] 其中,孢子萌发培养基的组分为:花宝1号1.5~2.0g/L、KNO30.95g/L、 (NH4)2SO40.85g/L、KH2PO40.25mg/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2~0.4g/L、FeSO4·
7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 mg/L、VB18.0~10.0 mg/L、VB53.0~5.0mg/L、VB61.0 mg/L、
甘氨酸2.0mg/L、肌醇150~180mg/L、 TDZ 0.3~0.5mg/L、NAA0.1~0.2mg/L、活性炭0.5~
0.8g/L、白糖30~35g/L、凝固剂5.6~6.0g/L;
[0030] GGB分化培养基的组分为:花宝1号1.2~1.5g/L、KNO30.95g/L、 (NH4)2SO40.85 g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、MnSO4· H2O 16.9mg/L、
ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、H3BO36.2 mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/L、CoCl2· 
6H2O 0.025mg/L、 CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2· EDTA37.3mg/
L、 VB15.0~8.0mg/L、VB52.0~3.0mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇180~200mg/L、
6-BA0.2~0.3mg/L、KT 0.05~0.1mg/L、NAA0.2~0.3mg/L、 IBA0.3~0.5mg/L、马铃薯粉
1.5~3.0g/L、水解乳蛋白0.5~0.8g/L、白糖 30.0~35.0g/L、凝固剂6.0~7.2g/L;
[0031] 生根培养基的组分为:花宝1号1.0~1.2g/L、KNO30.65g/L、(NH4)2SO4 0.6g/L、KH2PO40.1g/L、MgSO4·7H2O 0.25mg/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、 FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·
EDTA37.3 mg/L、VB12.0~3.0mg/L、VB51.0~2.0 mg/L、VB66.0~8.0mg/L、甘氨酸2.0~
4.0mg/L、肌醇110~130mg/L、NAA 0.3~0.5mg/L、白糖20.0~25.0g/L、活性炭0.3~0.5g/
L、香蕉粉3.0~4.0g/L、凝固剂7.2~7.6g/L。
[0032] 在本发明具体实施例中,孢子萌发、分化及生根培养基的凝固剂均可采用琼脂粉与卡拉胶的混合物,且琼脂粉与卡拉胶质量比3:1,成本较低。孢子萌发、分化及生根培养基
pH值均为5.8~6.0;且孢子萌发与分化培养、生根培养的培养温度均为(25±2)℃,孢子萌
发与分化培养,接种后弱光培养7~10d,即为培养室自然散射光培养,之后转入光培养,光
强为 1000~1500lx,光照10h/d,生根培养的光强为1800~2000lx,光照12h/d。
[0033] 另外,需要说明的是,在无特殊说明的情况下,本发明中的百分数均为质量百分数。且本发明中,花宝1号产地美国,其N、P、K质量比为7:6: 19;琼脂粉、卡拉胶产地日本,强
度分别为1400g/cm2、1500g/cm2;白糖为市售质量等级一级的袋装白砂糖。
[0034] 为了对本发明方法进行进一步的阐述说明,申请人给出了如下几个实施例,且这些实施例仅是示例性的,并不用于限制本发明的保护范围。
[0035] 实施例一
[0036] 外植体的选择与消毒:选择二歧鹿角蕨健康母株为外植体取材对象,切取带有成熟孢子的叶片,先用自来水冲洗干净,然后将叶片切割成大小5.0×2.0cm片块,放入装有无
菌水的超声波清洗器震荡清洗30min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸
巾吸干水分,用利刀刮下孢子,备用。
[0037] 孢子萌发:用镊子夹取孢子并均匀撒播于孢子萌发培养基表面进行培养;孢子播种培养10d,开始由褐色逐渐转绿,并膨胀生长,接种28d萌发成绿色球状体(GGB)(萌发率高
达100.0%),随后GGB大量增殖,接种30d,瓶底长满密密麻麻的GGB团块,增殖系数达5.0;孢
子萌发培养基的组分为:花宝1号1.5g/L、KNO30.95g/L、(NH4)2SO40.85g/L、KH2PO40.25mg/L、 
MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、
VB18.0 mg/L、VB53.0 mg/L、VB61.0 mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇150mg/L、TDZ 0.3mg/L、
NAA0.1 mg/L、活性炭0.5g/L、白糖30.0g/L、凝固剂5.6g/L。
[0038] GGB分化培养:将GGB转入分化培养基进行芽分化培养,培养周期 50d,可获得大小为1.8~2.0cm的丛芽团;分化培养基的组分为:花宝1号 1.2g/L、KNO30.95g/L、(NH4)
2SO40.85 g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、MnSO4· H2O 
16.9mg/L、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、 H3BO36.2 mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/
L、CoCl2· 6H2O 0.025mg/L、CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2· 
EDTA 37.3mg/L、VB15.0mg/L、VB52.0mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇180mg/L、6-
BA0.2 mg/L、KT 0.05mg/L、NAA0.2mg/L、IBA 0.3mg/L、马铃薯粉1.5g/L、水解乳蛋白0.5g/
L、白糖30.0g/L、凝固剂6.0g/L。
[0039] 生根培养:将获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养,培养70d即获得株高5.5~6.0cm、根长2.0~2.5cm、根数3~4条的完整植株即种苗(生根率达100.0%,且种苗健
壮);生根培养基的组分为:花宝1号1.0g/L、KNO3 0.65g/L、(NH4)2SO40.6 g/L、KH2PO40.1g/
L、MgSO4·7H2O 0.25mg/L、 CaCl2·2H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 
mg/L、VB12.0 mg/L、VB51.0mg/L、VB66.0 mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇110mg/L、NAA0.3 mg/L、
白糖20.0g/L、活性炭0.3g/L、香蕉粉3.0g/L、凝固剂7.2g/L。
[0040] 试管苗移栽:移栽前,将生根培养后获得的苗进行炼苗至适应栽培环境,炼苗完成后用自来水洗苗,洗净苗根部粘连的培养基,之后将苗置于浓度为 1.0g/L的多菌灵溶液中
浸泡消毒5min,取出晾干后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于温室层架上进行常规栽培
管理,2个月移栽成活率达98.0%。
[0041] 实施例二
[0042] 外植体的选择与消毒:选择鹿角蕨健康母株为外植体取材对象,切取带有成熟孢子的叶片,先用自来水冲洗干净,然后将叶片切割成大小5.0×2.0cm 片块,放入装有无菌
水的超声波清洗器震荡清洗35min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸巾
吸干水分,用利刀刮下孢子,备用。
[0043] 孢子萌发:用镊子夹取孢子并均匀撒播于孢子萌发培养基表面进行培养;孢子播种培养12d,开始由褐色逐渐转绿,并膨胀生长,接种30d萌发成绿色球状体(GGB)(萌发率高
达100.0%),随后GGB大量增殖,接种35d,瓶底长满密密麻麻的GGB团块,增殖系数达5.2;孢
子萌发培养基的组分为:花宝1号1.8g/L、KNO30.95g/L、(NH4)2SO40.85g/L、KH2PO40.25mg/L、 
MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.3g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、
VB19.0 mg/L、VB54.0mg/L、VB61.0 mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇160mg/L、TDZ 0.4mg/L、
NAA0.2 mg/L、活性炭0.6g/L、白糖33.0g/L、凝固剂5.8g/L。
[0044] GGB分化培养:将GGB转入分化培养基进行芽分化培养,培养周期 55d,可获得大小为1.8~2.2cm的丛芽团;分化培养基的组分为:花宝1号 1.3g/L、KNO30.95g/L、(NH4)
2SO40.85 g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、MnSO4· H2O 
16.9mg/L、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、 H3BO36.2 mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O0.25 mg/
L、CoCl2· 6H2O 0.025mg/L、CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2· 
EDTA 37.3mg/L、VB16.0mg/L、VB52.5mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇190mg/L、6-
BA0.3 mg/L、KT 0.1mg/L、NAA0.3 mg/L、IBA 0.4mg/L、马铃薯粉2.0g/L、水解乳蛋白0.6g/
L、白糖33.0g/L、凝固剂6.6g/L。
[0045] 生根培养:将获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养,培养72d即获得株高5.8~6.3cm、根长2.5~3.0cm、根数3~4条的完整植株即种苗(生根率达100.0%,且种苗健
壮);生根培养基的组分为:花宝1号1.1g/L、KNO3 0.65g/L、(NH4)2SO40.6 g/L、KH2PO40.1g/
L、MgSO4·7H2O 0.25mg/L、 CaCl2·2H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 
mg/L、VB12.5 mg/L、VB51.5 mg/L、VB67.0 mg/L、甘氨酸3.0mg/L、肌醇120mg/L、NAA 0.4mg/
L、白糖23.0g/L、活性炭0.4g/L、香蕉粉3.5g/L、凝固剂7.4g/L。
[0046] 试管苗移栽:移栽前,将生根培养后获得的苗进行炼苗至适应栽培环境,炼苗完成后用自来水洗苗,洗净苗根部粘连的培养基,之后将苗置于浓度为 1.0g/L的百菌清溶液中
浸泡消毒6min,取出晾干后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于温室层架上进行常规栽培
管理,2个月移栽成活率达98.5%。
[0047] 实施例三
[0048] 外植体的选择与消毒:选择二歧鹿角蕨健康母株为外植体取材对象,切取带有成熟孢子的叶片,先用自来水冲洗干净,然后将叶片切割成大小5.0×2.0cm片块,放入装有无
菌水的超声波清洗器震荡清洗40min,取出放入无菌容器中,在超净工作台上,再用无菌纸
巾吸干水分,用利刀刮下孢子,备用。
[0049] 孢子萌发:用镊子夹取孢子并均匀撒播于孢子萌发培养基表面进行培养;孢子播种培养15d,开始由褐色逐渐转绿,并膨胀生长,接种35d萌发成绿色球状体(GGB)(萌发率高
达100.0%),随后GGB大量增殖,接种40d,瓶底长满密密麻麻的GGB团块,增殖系数达5.5;孢
子萌发培养基的组分为:花宝1号2.0g/L、KNO30.95g/L、(NH4)2SO40.85g/L、KH2PO40.25mg/L、 
MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.4g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、
VB110.0 mg/L、VB55.0 mg/L、VB61.0 mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇180mg/L、TDZ 0.5mg/L、
NAA0.2 mg/L、活性炭0.8g/L、白糖35.0g/L、凝固剂6.0g/L。
[0050] GGB分化培养:将GGB转入分化培养基进行芽分化培养,培养60d,可获得大小为2.2~2.5cm的丛芽团;分化培养基的组分为:花宝1号1.5g/L、 KNO30.95g/L、(NH4)2SO40.85 g/
L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、MnSO4· H2O 16.9mg/L、
ZnSO4· 7H2O 8.6mg/L、H3BO36.2 mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/L、CoCl2· 
6H2O 0.025mg/L、 CuSO4· 5H2O 0.025mg/L、FeSO4· 7H2O 27.8mg/L、Na2· EDTA37.3mg/
L、 VB15.0~8.0mg/L、VB53.0mg/L、VB61.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇 180~200mg/L、6-
BA0.3 mg/L、KT 0.1mg/L、NAA0.3 mg/L、IBA0.5 mg/L、马铃薯粉3.0g/L、水解乳蛋白0.8g/
L、白糖35.0g/L、凝固剂7.2g/L。
[0051] 生根培养:将获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养,培养75d即获得株高6.0~6.5cm、根长2.0~3.0cm、根数3~4条的完整植株即种苗(生根率达100.0%,且种苗健
壮);生根培养基的组分为:花宝1号1.2g/L、KNO3 0.65g/L、(NH4)2SO40.6 g/L、KH2PO40.1g/
L、MgSO4·7H2O 0.25mg/L、 CaCl2·2H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 
mg/L、VB13.0 mg/L、VB52.0 mg/L、VB68.0 mg/L、甘氨酸4.0mg/L、肌醇130mg/L、NAA 0.5mg/
L、白糖25.0g/L、活性炭0.5g/L、香蕉粉4.0g/L、凝固剂7.6g/L。
[0052] 试管苗移栽:移栽前,将生根培养后获得的苗进行炼苗至适应栽培环境,炼苗完成后用自来水洗苗,洗净苗根部粘连的培养基,之后将苗置于浓度为 1.0g/L的多菌灵溶液中
浸泡消毒6min,取出晾干后植入装有泥炭土的穴盘中,之后置于温室层架上进行常规栽培
管理,2个月移栽成活率达99.0%。
[0053] 综上可知,采用本发明方法,仅需178d至210d就能获得鹿角蕨种苗;且本发明中孢子萌发培养基能够使得孢子萌发与GGB增殖同步进行,简化了培养环节、降低了培养成本,
且孢子萌发率高,GGB增殖率高、成苗时间短,即繁殖效率高,进而提高了整个种苗培养的效
率;
[0054] 另外,利用本发明培养的试管苗健壮、根系发达,且通过驯化炼苗,其环境适应能力较强,从而提高了种苗移栽成活率,2个月移栽成活率达98.5%以上;换而言之,本发明方
法克服了现有技术中鹿角蕨种苗培养操作过程相对较为繁复、效率低、组培苗抗性差,移栽
成活率低的缺陷。
[0055] 虽然以上描述了本发明的具体实施方式,但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解,我们所描述的具体的实施例只是说明性的,而不是用于对本发明的范围的限定,熟悉本
领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化,都应当涵盖在本发明的
权利要求所保护的范围内。