一种负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束及其制备方法转让专利
申请号 : CN201911064781.X
文献号 : CN110664753B
文献日 : 2021-07-02
发明人 : 陈忠平 , 龙朦朦 , 翁凌燕 , 陆敏 , 朱俐 , 陈秋萍
申请人 : 南通大学
摘要 :
本发明公开了一种负载抗癌药物的骨靶向低氧响应纳米胶束及其制备方法，本发明制备方法包括：通过聚乙二醇与低氧响应基团(4,4‑偶氮二苯胺)的共聚反应，得羧基聚乙二醇偶氮苯；通过羧基聚乙二醇偶氮苯与N‑苄氧羰基‑L‑赖氨酸‑N‑羧酸酐的开环聚合反应，得表面具有苄氧羰基的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物，脱去苄氧羰基后，得聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物；通过聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物与骨靶向基团(阿伦膦酸)的共聚反应，得骨靶向低氧响应聚合物；通过透析法合成负载抗癌药物的骨靶向低氧响应纳米胶束。本发明制备方法制备的纳米胶束结构稳定、不易分解、对骨组织有靶向作用，还可以起到低氧控释药物的效果。
权利要求 :
1.一种负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将聚乙二醇溶于二氯甲烷中，再加入4,4‑偶氮二苯胺，常温避光搅拌反应24h，使用冰乙醚沉淀，得到式(Ⅰ)所示的羧基聚乙二醇偶氮苯：其中，n为聚合度，14≤n≤70；
2)将步骤1)得到的羧基聚乙二醇偶氮苯溶于四氢呋喃，加入N‑苄氧羰基‑L‑赖氨酸‑N‑羧酸酐，常温避光搅拌下反应72h，得到如式(Ⅱ)所示的表面具有苄氧羰基的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物：
其中，n为聚合度，14≤n≤70，m为聚合度，9≤m≤39；
3)将步骤2)得到的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物溶于三氟乙酸中，加入溴化氢醋酸溶液，0℃搅拌反应1h脱去苄氧羰基，再溶 入二氯甲烷中，加入三乙胺中和酸，得到式(Ⅲ)所示的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物：其中，n为聚合度，14≤n≤70，m为聚合度，9≤m≤39；
4)将步骤3)得到的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺，常温搅拌后加入阿伦膦酸，搅拌反应2h，得到式(Ⅳ)所示的骨靶向低氧响应聚合物：其中，n为聚合度，14≤n≤70，m为聚合度，9≤m≤39；
5)将步骤4)得到的骨靶向低氧响应聚合物和抗癌药物溶于N,N‑二甲基甲酰胺，在磁力搅拌下，滴加水，搅拌1.5h后得混合溶液，将所述混合溶液转移至透析袋中，纯水透析24h，‑
50℃冻干后得到负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的聚乙二醇的相对分子质量为1000～5000。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述聚乙二醇与4,4‑偶氮二苯胺的摩尔比为1：1.3。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述羧基聚乙二醇偶氮苯与N‑苄氧羰基‑L‑赖氨酸‑N‑羧酸酐的摩尔比为1:16。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物与1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺和阿伦膦酸的摩尔比为1:3:3.6:5。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述抗癌药物与所述骨靶向低氧响应聚合物的质量比为1:4～10，所述抗癌药物为阿霉素、多西他赛和喜树碱中的一种。
7.根据权利要求1所述一种制备方法，其特征在于，步骤5)中所述透析袋的截留分子量为3000。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以g/L计，步骤5)中所述骨靶向低氧响应聚合物与水的质量体积比为2:1。
9.根据权利要求1～8任意一项所述制备方法制备得到的负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束。
10.根据权利要求9所述的负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束，其特征在于，所述负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束的水合粒径为200nm。
说明书 :
一种负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及纳米药剂技术领域，尤其是一种负载抗癌药物的骨靶向低氧响应纳米胶束及其制备方法。
背景技术
[0002] 骨骼是癌症细胞除去肺和肝第三个最优选的转移部位，并且一些癌症显示出显着的嗜骨性。由于骨转移通常具有多个结节，因此难以通过局部化放射治疗或手术切除完全
消除它们。对于化疗来说，因为骨骼血流量低，所以给药后不会在骨骼部位产生足够的药物
浓度，大剂量使用下治疗效果差，毒副作用强。
消除它们。对于化疗来说，因为骨骼血流量低，所以给药后不会在骨骼部位产生足够的药物
浓度，大剂量使用下治疗效果差，毒副作用强。
[0003] 通过纳米载体给药是治疗肿瘤的重要手段之一，纳米载体不会改变所负载药物的物理和化学性质，还可以在病灶区域持续释放药物，使药物维持在一定的浓度。但非骨靶向
负载药物的纳米载体虽然能治疗实体瘤，却与传统药物一样对骨转移瘤效果甚微。低氧是
骨转移瘤微环境的基本特征之一，正常组织的氧浓度一般在30mmHg左右，而骨骼部位的肿
瘤组织的氧浓度较低，有的甚至接近于0，这是很多骨转移瘤治疗失败的主要原因。因此，亟
待设计并制备出一种具有骨靶向功能和低氧响应功能的纳米药物载体用于低氧骨转移瘤
的治疗。
负载药物的纳米载体虽然能治疗实体瘤，却与传统药物一样对骨转移瘤效果甚微。低氧是
骨转移瘤微环境的基本特征之一，正常组织的氧浓度一般在30mmHg左右，而骨骼部位的肿
瘤组织的氧浓度较低，有的甚至接近于0，这是很多骨转移瘤治疗失败的主要原因。因此，亟
待设计并制备出一种具有骨靶向功能和低氧响应功能的纳米药物载体用于低氧骨转移瘤
的治疗。
发明内容
[0004] 本发明目的在于提供一种负载抗癌药物的骨靶向低氧响应纳米胶束及其制备方法，制备的纳米胶束结构稳定、不易分解、对骨组织有靶向作用，还可以起到低氧控释药物
的效果。
的效果。
[0005] 为解决以上问题，本发明提供了一种负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
[0006] 1)将聚乙二醇溶于二氯甲烷中，再加入4,4‑偶氮二苯胺，常温避光搅拌反应24h，使用冰乙醚沉淀产物，得到式(Ⅰ)所示的羧基聚乙二醇偶氮苯：
[0007]
[0008] 其中，n为聚合度，14≤n≤70；
[0009] 2)将步骤1)得到的羧基聚乙二醇偶氮苯溶于四氢呋喃，加入N‑苄氧羰基‑L‑赖氨酸‑N‑羧酸酐，常温避光搅拌下反应72h，得到如式(Ⅱ)所示的表面具有苄氧羰基的聚乙二
醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物：
醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物：
[0010]
[0011] 其中，n为聚合度，14≤n≤70，m为聚合度，9≤m≤39；
[0012] 3)将步骤2)得到的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物溶于三氟乙酸中，加入溴化氢醋酸溶液，0℃搅拌反应1h脱去苄氧羰基，再融入二氯甲烷中，加入三乙胺中和酸，得到式
(Ⅲ)所示的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物：
(Ⅲ)所示的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物：
[0013]
[0014]
[0015] 其中，n为聚合度，14≤n≤70，m为聚合度，9≤m≤39；
[0016] 4)将步骤3)得到的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺，常温搅拌后加入阿伦膦酸，
搅拌反应2h，得到式(Ⅳ)所示的骨靶向低氧响应聚合物；
搅拌反应2h，得到式(Ⅳ)所示的骨靶向低氧响应聚合物；
[0017]
[0018] 其中，n为聚合度，14≤n≤70，m为聚合度，9≤m≤39；
[0019] 5)将步骤4)得到的骨靶向低氧响应聚合物和抗癌药物溶于N,N‑二甲基甲酰胺，在磁力搅拌下，滴加水，搅拌1.5h后得混合溶液，将所述混合溶液转移至透析袋中，纯水透析
24h，‑50℃冻干后得到负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束。
24h，‑50℃冻干后得到负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束。
[0020] 优选的，步骤1)中所述的聚乙二醇的相对分子质量为1000～5000。
[0021] 优选的，步骤1)中所述聚乙二醇与4,4‑偶氮二苯胺的摩尔比为1：1.3。
[0022] 优选的，步骤2)中所述羧基聚乙二醇偶氮苯与N‑苄氧羰基‑L‑赖氨酸‑N‑羧酸酐的摩尔比为1：16。
[0023] 优选的，步骤4)中所述的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物与1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺和阿伦膦酸的摩尔比为1：3：3.6：5。
[0024] 优选的，步骤5)中所述抗癌药物与所述骨靶向低氧响应聚合物的质量比为1：4～10，所述抗癌药物为阿霉素、多西他赛和喜树碱中的一种。
[0025] 优选的，步骤5)中所述透析袋的截留分子量为3000。
[0026] 优选的，以g/L计，步骤5)中所述骨靶向低氧响应聚合物与水的质量体积比为2：1。
[0027] 本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束。
[0028] 优选的，所述负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束的水合粒径为200nm。
[0029] 本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0030] 1、本发明的纳米胶束结构稳定，在正常生理条件体内不易分解，所负载的抗癌药物不易泄露，极大降低了对人体正常器官和组织的毒副作用。并且疏水性的抗癌药物，例如
阿霉素、多西他赛和喜树碱等，都能被负载在该纳米胶束中。
阿霉素、多西他赛和喜树碱等，都能被负载在该纳米胶束中。
[0031] 2、本发明的纳米胶束含有骨靶向基团阿伦膦酸，其能与骨质中的主要无机成分羟基磷灰石结合，从而对骨组织有靶向效果；同时还含有低氧响应基团偶氮苯，在肿瘤的低氧
条件下，其能响应低氧环境，偶氮键发生还原，从而使得整个纳米胶束体系发生破坏，将负
载的抗癌药物释放出来，起到低氧控释的效果。
条件下，其能响应低氧环境，偶氮键发生还原，从而使得整个纳米胶束体系发生破坏，将负
载的抗癌药物释放出来，起到低氧控释的效果。
[0032] 3、本发明的纳米胶束表面是亲水的聚乙二醇，其能避免被内皮网状系统捕获，有效延长纳米胶束的血液循环时间，使纳米胶束有充足的时间通过EPR效应在肿瘤部位滞留
富集。
富集。
[0033] 4、本发明的纳米胶束表面带正电荷，使得纳米胶束在体内更易于进入肿瘤细胞，在肿瘤细胞中释放抗癌药物，抑制肿瘤细胞生长。
[0034] 5、本发明的纳米胶束制备方法简单，易于放大生产，有较高的包封率(高达90％)和载药率(高达22％)。
附图说明
[0035] 图1为实施例1‑1提供的骨靶向低氧响应聚合物(ALN‑PEG‑AZO‑PLL)的核磁共振氢谱图；
[0036] 图2为4,4‑偶氮二苯胺(AZO)、实施例2‑1提供的空载的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLLNPs)、实施例2‑2提供的空载的普通纳米胶束(mPEG‑PLL NPs)和实施例
2‑3提供的空载的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL NPs)的体外低氧响应性‑紫外吸收特征峰
的变化；图2中，A图为AZO在200～700nm范围内的紫外吸收峰，B图为不含AZO的mPEG‑PLL
NPs在200～700nm范围内的紫外吸收峰，C图为ALN‑PEG‑PLL NPs在200～700nm范围内的紫
外吸收峰，D图为ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs在200～700nm范围内的紫外吸收峰。
2‑3提供的空载的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL NPs)的体外低氧响应性‑紫外吸收特征峰
的变化；图2中，A图为AZO在200～700nm范围内的紫外吸收峰，B图为不含AZO的mPEG‑PLL
NPs在200～700nm范围内的紫外吸收峰，C图为ALN‑PEG‑PLL NPs在200～700nm范围内的紫
外吸收峰，D图为ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs在200～700nm范围内的紫外吸收峰。
[0037] 图3为实施例2‑1提供的空载的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs)在还原前和还原后的透射电镜图；
[0038] 图4为实施例4‑1提供的负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEF‑AZO‑PLL‑DOX NPs)和实施例4‑4提供的负载阿霉素的普通纳米胶束(mPEG‑PLL‑DOX NPs)的骨靶
向作用比较图；其中，A图为实施例4‑1提供的负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑
PEF‑AZO‑PLL‑DOX NPs)和实施例4‑4提供的负载阿霉素的普通纳米胶束(mPEG‑PLL‑DOX
NPs)与HA结合的效果对比图；B图为ALN‑PEF‑AZO‑PLL‑DOX NPs和mPEG‑PLL‑DOX NPs在不同
时间点与HA的结合量曲线图。
向作用比较图；其中，A图为实施例4‑1提供的负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑
PEF‑AZO‑PLL‑DOX NPs)和实施例4‑4提供的负载阿霉素的普通纳米胶束(mPEG‑PLL‑DOX
NPs)与HA结合的效果对比图；B图为ALN‑PEF‑AZO‑PLL‑DOX NPs和mPEG‑PLL‑DOX NPs在不同
时间点与HA的结合量曲线图。
[0039] 图5为实施例4‑1提供的负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs)、实施例4‑4提供的负载阿霉素的普通纳米胶束(mPEG‑PLL‑DOX NPs)和实施
例4‑5提供的负载阿霉素的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs)在低氧和常氧条件下
的阿霉素释放曲线；
例4‑5提供的负载阿霉素的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs)在低氧和常氧条件下
的阿霉素释放曲线；
[0040] 图6为实施例4‑1提供的负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs)在低氧和常氧条件下的细胞内阿霉素的释放行为观察结果；图6中，A图为
MDA‑MB‑321细胞的DOX释放行为观察结果，B图为RM‑1细胞的DOX释放行为观察结果；
MDA‑MB‑321细胞的DOX释放行为观察结果，B图为RM‑1细胞的DOX释放行为观察结果；
[0041] 图7为实施例8提供的负载荧光染料Cy5.5的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs)、普通纳米胶束(mPEG‑PLL‑Cy5.5NPs)和骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑
PLL‑Cy5.5NPs)对荷瘤小鼠的近红外活体成像结果；图7中，A图为三种负载荧光染料Cy5.5
的纳米胶束对荷瘤小鼠的近红外活体成像得到的荧光图片；B图三种负载荧光染料Cy5.5的
纳米胶束在不同时间点肿瘤部位与正常组织部位的荧光比值；C图为24小时后处死小鼠取
出其心肝脾肺肾以及转移骨和正常骨(健康骨)所拍摄近红外成像荧光图片；
PLL‑Cy5.5NPs)对荷瘤小鼠的近红外活体成像结果；图7中，A图为三种负载荧光染料Cy5.5
的纳米胶束对荷瘤小鼠的近红外活体成像得到的荧光图片；B图三种负载荧光染料Cy5.5的
纳米胶束在不同时间点肿瘤部位与正常组织部位的荧光比值；C图为24小时后处死小鼠取
出其心肝脾肺肾以及转移骨和正常骨(健康骨)所拍摄近红外成像荧光图片；
[0042] 图8为实施例4‑1提供的的负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs)、实施例4‑4提供的负载阿霉素的普通纳米胶束(mPEG‑PLL‑DOX NPs)、实施例
4‑5提供的负载阿霉素的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs)、PBS和阿霉素(DOX)分别
对荷瘤小鼠治疗效果结果；图8中，A图为不同造模天数，各组老鼠4分钟内抬脚次数比较结
果，B图为不同造模天数，各组老鼠4分钟内抬脚时间比较结果，C图为不同造模天数，各组老
鼠疼痛行为评分比较结果，D图为不同造模天数，各组老鼠体重比较结果，E图为不同造模天
数，各组老鼠生存率比较结果；
4‑5提供的负载阿霉素的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs)、PBS和阿霉素(DOX)分别
对荷瘤小鼠治疗效果结果；图8中，A图为不同造模天数，各组老鼠4分钟内抬脚次数比较结
果，B图为不同造模天数，各组老鼠4分钟内抬脚时间比较结果，C图为不同造模天数，各组老
鼠疼痛行为评分比较结果，D图为不同造模天数，各组老鼠体重比较结果，E图为不同造模天
数，各组老鼠生存率比较结果；
[0043] 图9为实施例4‑1提供的负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs)、实施例4‑4提供的负载阿霉素的普通纳米胶束(mPEG‑PLL‑DOX NPs)、实施例
4‑5提供的负载阿霉素的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs)、PBS和DOX分别对荷瘤小
鼠进行治疗后，荷瘤股骨的Micro‑CT结果图；图9中，A图为由Micro‑CT所拍的荷瘤小鼠股骨
的冠状面和矢状面，B图为对股骨前端的Micro‑CT3D重建图，C图为不同给药组小鼠的骨密
度数比较图，D图为不同给药组小鼠的骨小梁数比较图；
4‑5提供的负载阿霉素的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs)、PBS和DOX分别对荷瘤小
鼠进行治疗后，荷瘤股骨的Micro‑CT结果图；图9中，A图为由Micro‑CT所拍的荷瘤小鼠股骨
的冠状面和矢状面，B图为对股骨前端的Micro‑CT3D重建图，C图为不同给药组小鼠的骨密
度数比较图，D图为不同给药组小鼠的骨小梁数比较图；
[0044] 图10为本发明制备的负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束的结构示意图，其中‑N＝N‑偶氮类化合物代表4,4‑偶氮二苯胺。
具体实施方式
[0045] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求
的限制。
的限制。
[0046] 本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
[0047] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种负载抗癌药物骨靶向低氧响应纳米胶束及其制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限
制。
制。
[0048] 实施例1‑1
[0049] 骨靶向低氧响应聚合物的制备：
[0050] (1)将50mg(1当量)聚乙二醇(HOOC‑PEG‑NHS，MW＝1000)溶于5mL二氯甲烷中，加入6.8mg(1.3当量)的4,4‑偶氮二苯胺(AZO)，常温避光搅拌反应24h后使用20mL冰乙醚沉淀产
物，得到羧基聚乙二醇偶氮苯(HOOC‑PEG‑AZO)；
物，得到羧基聚乙二醇偶氮苯(HOOC‑PEG‑AZO)；
[0051] (2)将50mg(1当量)HOOC‑PEG‑AZO溶于四氢呋喃(THF)，加入124mg(16当量)N‑苄氧羰基‑L‑赖氨酸‑N‑羧酸酐(zLL‑NCA)常温避光搅拌下反应72h，得到表面具有苄氧羰基的聚
乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物(HOOC‑PEG‑AZO‑PBLL)；
乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物(HOOC‑PEG‑AZO‑PBLL)；
[0052] (3)将150mg(1当量)HOOC‑PEG‑AZO‑PBLL溶于5mL三氟乙酸(TFA)中，加入1mL 33％溴化氢醋酸溶液(HBr/ACOH)，0℃搅拌反应1h脱去苄氧羰基，再融入二氯甲烷中，加入1mL三
乙胺中和酸，得到聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物(HOOC‑PEG‑AZO‑PLL)；
乙胺中和酸，得到聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚物(HOOC‑PEG‑AZO‑PLL)；
[0053] (4)将150mg(1当量)HOOC‑PEG‑AZO‑PLL溶入5mL的N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)中，加入22mg(3当量)的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺(EDC)和16mg(3.6当量)的N‑羟基
琥珀酰亚胺(NHS)，常温搅拌反应1h后，加入61mg(5当量)的阿伦膦酸(ALN)，搅拌反应24h，
得到骨靶向低氧响应聚合物(ALN‑PEG‑AZO‑PLL)。
琥珀酰亚胺(NHS)，常温搅拌反应1h后，加入61mg(5当量)的阿伦膦酸(ALN)，搅拌反应24h，
得到骨靶向低氧响应聚合物(ALN‑PEG‑AZO‑PLL)。
[0054] 使用核磁共振氢谱(1H NMR)检测ALN‑PEG‑AZO‑PLL的结构，其核磁共振氢谱图如图1所示。
[0055] 实施例1‑2
[0056] 骨靶向低氧响应聚合物的制备：
[0057] 将50mg(1当量)聚乙二醇(HOOC‑PEG‑NHS，MW＝2000)溶于5mL二氯甲烷中，加入6.8mg(1.3当量)的4,4‑偶氮二苯胺(AZO)，常温避光搅拌反应24h后使用20mL冰乙醚沉淀产
物，得到羧基聚乙二醇偶氮苯(HOOC‑PEG‑AZO)；其余步骤同实施例1‑1。
物，得到羧基聚乙二醇偶氮苯(HOOC‑PEG‑AZO)；其余步骤同实施例1‑1。
[0058] 实施例1‑3
[0059] 骨靶向低氧响应聚合物的制备：
[0060] 将50mg(1当量)聚乙二醇(HOOC‑PEG‑NHS，MW＝5000)溶于5mL二氯甲烷中，加入6.8mg(1.3当量)的4,4‑偶氮二苯胺(AZO)，常温避光搅拌反应24h后使用20mL冰乙醚沉淀产
物，得到羧基聚乙二醇偶氮苯(HOOC‑PEG‑AZO)；其余步骤同实施例1‑1。
物，得到羧基聚乙二醇偶氮苯(HOOC‑PEG‑AZO)；其余步骤同实施例1‑1。
[0061] 实施例2‑1
[0062] 空载的骨靶向低氧响应纳米胶束的制备：
[0063] 取20mg实施例1‑2得到的ALN‑PEG‑AZO‑PLL溶于4mL的DMF，充分溶解后，在磁力搅拌下，滴加10mL水，继续搅拌1.5h后，将混合溶液移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透析24h，‑
50℃冻干得到空载的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs)。
50℃冻干得到空载的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs)。
[0064] 实施例2‑2
[0065] 空载的普通纳米胶束的制备：
[0066] 依照文献[Lim C,Sim T,HoangNH,Oh KT.A stable nanoplatform for antitumor activity using PEG‑PLL‑PLA triblock co‑polyelectrolyte[J].Colloid
Surface B.2017,153:10‑8]中的方法制备得到带甲基修饰的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚
物(mPEG‑PLL)。
Surface B.2017,153:10‑8]中的方法制备得到带甲基修饰的聚乙二醇‑聚赖氨酸嵌段共聚
物(mPEG‑PLL)。
[0067] 取20mg的mPEG‑PLL溶于4mL的DMF，充分溶解后，在磁力搅拌下，滴加10mL水，继续搅拌1.5h后，将混合溶液移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透析24h，‑50℃冻干得到空载的纳
米胶束(mPEG‑PLL NPs)。
米胶束(mPEG‑PLL NPs)。
[0068] 实施例2‑3
[0069] 空载的骨靶向纳米胶束的制备：
[0070] 将50mg HOOC‑PEG‑NH2溶入5mL THF中，加入123mg zLL‑NCA，常温搅拌反应72h后，旋蒸浓缩，加入过量冰乙醚沉淀，8000r/min旋转速度离心，所得产物用二氯甲烷溶解，旋蒸
蒸干得到HOOC‑PEG‑PBLL；然后将HOOC‑PEG‑PBLL溶于5mL TFA中，加入1mL 33％HBr/AcOH，0
℃度搅拌反应1h脱去苄氧羰基，再融入二氯甲烷中，加入1mL三乙胺中和酸得到HOOC‑PEG‑
PLL；取150mg HOOC‑PEG‑PLL溶入5mL的DMF中，加入22mg的EDC(3当量)和16mg(3.6当量)的
NHS，常温搅拌反应1h后，加入61mg(5当量)的ALN，搅拌反应24h，得到骨靶向低氧响应聚合
物(ALN‑PEG‑PLL)。
蒸干得到HOOC‑PEG‑PBLL；然后将HOOC‑PEG‑PBLL溶于5mL TFA中，加入1mL 33％HBr/AcOH，0
℃度搅拌反应1h脱去苄氧羰基，再融入二氯甲烷中，加入1mL三乙胺中和酸得到HOOC‑PEG‑
PLL；取150mg HOOC‑PEG‑PLL溶入5mL的DMF中，加入22mg的EDC(3当量)和16mg(3.6当量)的
NHS，常温搅拌反应1h后，加入61mg(5当量)的ALN，搅拌反应24h，得到骨靶向低氧响应聚合
物(ALN‑PEG‑PLL)。
[0071] 取20mg ALN‑PEG‑PLL溶于4mL的DMF，充分溶解后，在磁力搅拌下，滴加10mL水，继续搅拌1.5h后，将混合溶液移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透析24h，‑50℃冻干得到空载的
骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL NPs)。
骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL NPs)。
[0072] 实施例3
[0073] 空载的骨靶向低氧响应纳米胶束的体外低氧响应性考察：
[0074] AZO在388nm处有强的紫外吸收峰，因此通过紫外分光光度计(UV‑2450，SHIMADZU，Japan)检测纳米胶束在体外低氧条件下加入还原酶后AZO还原情况，具体为：分别利用4,4‑
偶氮二苯胺(AZO)、实施例2‑1提供的空载的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL
NPs)、实施例2‑2提供的空载的普通纳米胶束(mPEG‑PLL NPs)和实施例2‑3提供的空载的骨
靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL NPs)配制浓度为1mg/mL的AZO溶液、ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs溶
液、mPEG‑PLL NPs溶液和ALN‑PEG‑PLL NPs溶液；将以上四种溶液分别分成两组，每组2mL，
一组加入化学还原剂2mg连代亚硫酸钠(Na2S2O4)，另一组加入20μL肝微粒体和2mg NADH(烟
酰胺腺嘌呤二核苷酸)，并放入低氧环境下12h(这样可模仿体内低氧条件下还原酶体系)，
然后用紫外分光光度计(UV‑2450，SHIMADZU，Japan)分别测试每组溶液在200～700nm范围
内的紫外吸收峰。测试结果如图2所示，可以发现，AZO在388nm左右有强吸收峰，当加入
Na2S2O4或者肝微粒体和NADH后，388处的强吸收峰降低，这说明AZO被还原了生成胺类，因此
紫外吸收峰降低或消失。同样效果发生在ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs中(图2D)，而在不含AZO的
mPEG‑PLL NPs(图2B)和ALN‑PEG‑PLL NPs(图2C)在388nm处没有吸收峰，说明没有AZO的存
在，加入Na2S2O4或者肝微粒体和NADH后在388nm处也没有明显变化。说明空载的骨靶向低氧
响应纳米胶束ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs因为含有AZO，因此在体外具有低氧响应性。
偶氮二苯胺(AZO)、实施例2‑1提供的空载的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL
NPs)、实施例2‑2提供的空载的普通纳米胶束(mPEG‑PLL NPs)和实施例2‑3提供的空载的骨
靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL NPs)配制浓度为1mg/mL的AZO溶液、ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs溶
液、mPEG‑PLL NPs溶液和ALN‑PEG‑PLL NPs溶液；将以上四种溶液分别分成两组，每组2mL，
一组加入化学还原剂2mg连代亚硫酸钠(Na2S2O4)，另一组加入20μL肝微粒体和2mg NADH(烟
酰胺腺嘌呤二核苷酸)，并放入低氧环境下12h(这样可模仿体内低氧条件下还原酶体系)，
然后用紫外分光光度计(UV‑2450，SHIMADZU，Japan)分别测试每组溶液在200～700nm范围
内的紫外吸收峰。测试结果如图2所示，可以发现，AZO在388nm左右有强吸收峰，当加入
Na2S2O4或者肝微粒体和NADH后，388处的强吸收峰降低，这说明AZO被还原了生成胺类，因此
紫外吸收峰降低或消失。同样效果发生在ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs中(图2D)，而在不含AZO的
mPEG‑PLL NPs(图2B)和ALN‑PEG‑PLL NPs(图2C)在388nm处没有吸收峰，说明没有AZO的存
在，加入Na2S2O4或者肝微粒体和NADH后在388nm处也没有明显变化。说明空载的骨靶向低氧
响应纳米胶束ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs因为含有AZO，因此在体外具有低氧响应性。
[0075] 将在加入化学还原剂连带亚硫酸钠(Na2S2O4)前后的空载的骨靶向低氧响应纳米胶束溶液分别滴在铜网上，用滤纸吸去多余液体，滴上1％磷钨酸溶液染色，染色1～2min
后，用清水滴洗3次，用滤纸吸去多余液体，晾干后即可用透射电镜(TEM,JEM‑1230,Japan)
观察ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs纳米胶束还原后的形态，空载的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑
PEG‑AZO‑PLL NPs)在还原前和还原后的透射电镜图如图3所示。由于ALN‑PEG‑AZO‑PLL中含
有AZO，因此其形成的纳米胶束在加入化学还原剂的条件下，AZO被还原从而导致整个纳米
胶束体系破坏。根据图3可以发现，ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs在被还原之前有均匀的球形外观，
粒径在200nm左右，还原之后整个纳米粒子发生裂解，进一步说明ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs在
体外具有低氧响应性。
后，用清水滴洗3次，用滤纸吸去多余液体，晾干后即可用透射电镜(TEM,JEM‑1230,Japan)
观察ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs纳米胶束还原后的形态，空载的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑
PEG‑AZO‑PLL NPs)在还原前和还原后的透射电镜图如图3所示。由于ALN‑PEG‑AZO‑PLL中含
有AZO，因此其形成的纳米胶束在加入化学还原剂的条件下，AZO被还原从而导致整个纳米
胶束体系破坏。根据图3可以发现，ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs在被还原之前有均匀的球形外观，
粒径在200nm左右，还原之后整个纳米粒子发生裂解，进一步说明ALN‑PEG‑AZO‑PLL NPs在
体外具有低氧响应性。
[0076] 实施例4‑1
[0077] 负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束的制备：
[0078] 取20mg实施例1‑2得到的ALN‑PEG‑AZO‑PLL溶于4mL的DMF中，加4mg阿霉素(DOX)，在磁力搅拌下滴加10mL水，接着搅拌1.5h，将混合溶液移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透析
24h，冻干后得到负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEF‑AZO‑PLL‑DOX NPs)，
HPLC测得ALN‑PEF‑AZO‑PLL‑DOXNPs包封率为90.5±0.29(％)、载药率为22.3±0.23％，采
用粒径电位测试仪器测得水合粒径为200nm。
24h，冻干后得到负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束(ALN‑PEF‑AZO‑PLL‑DOX NPs)，
HPLC测得ALN‑PEF‑AZO‑PLL‑DOXNPs包封率为90.5±0.29(％)、载药率为22.3±0.23％，采
用粒径电位测试仪器测得水合粒径为200nm。
[0079] 实施例4‑2
[0080] 负载多西他赛的骨靶向低氧响应纳米胶束的制备：
[0081] 取20mg实施例1‑2得到的ALN‑PEG‑AZO‑PLL溶于4mL的DMF中，加5mg多西他赛，在剧烈磁力搅拌下滴加10mL水，接着搅拌1.5h，将混合溶液移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透析
24h，冻干后得到负载多西他赛的骨靶向低氧响应纳米胶束。
24h，冻干后得到负载多西他赛的骨靶向低氧响应纳米胶束。
[0082] 实施例4‑3
[0083] 负载喜树碱的骨靶向低氧响应纳米胶束的制备：
[0084] 取20mg实施例1‑2得到的ALN‑PEG‑AZO‑PLL溶于4mL的DMF中，加2mg喜树碱，在剧烈磁力搅拌下滴加10mL水，接着搅拌1.5h，将混合溶液移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透析
24h，冻干后得到负载喜树碱的骨靶向低氧响应纳米胶束。
24h，冻干后得到负载喜树碱的骨靶向低氧响应纳米胶束。
[0085] 实施例4‑4
[0086] 负载阿霉素的普通纳米胶束的制备：
[0087] 取20mg实施例2‑2得到的mPEG‑PLL溶于4mL的DMF中，加4mg阿霉素，在剧烈磁力搅拌下滴加10mL水，接着搅拌1.5h，将混合溶液移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透析24h，冻干
后得到负载阿霉素的普通纳米胶束(mPEG‑PLL‑DOX NPs)。
后得到负载阿霉素的普通纳米胶束(mPEG‑PLL‑DOX NPs)。
[0088] 实施例4‑5
[0089] 负载阿霉素的骨靶向纳米胶束的制备：
[0090] 取20mg实施例2‑3得到的ALN‑PEG‑PLL溶于4mL的DMF中，加4mg阿霉素，在剧烈磁力搅拌下滴加10mL水，接着搅拌1.5h，将混合溶液移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透析24h，冻
干后得到负载抗癌药物的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs)。
干后得到负载抗癌药物的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs)。
[0091] 实施例5
[0092] 负载阿霉素(DOX)的骨靶向低氧响应纳米胶束在体外与羟基磷灰石(HA)的结合能力考察：
[0093] ALN能与骨质中的主要无机成分羟基磷灰石(HA)结合，因此在体外通过利用实施例4‑1得到的负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs和实施例
4‑4得到的负载阿霉素的普通纳米胶束mPEG‑PLL‑DOX NPs与HA混合来考察ALN的骨靶向效
果，具体如图4所示。将ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs和mPEG‑PLL‑DOX NPs分别用纯水稀释1倍
后各取5mL，分别加入5mg的HA并给予磁力搅拌，在第30min，1h，2h，3h，4h分别取出200μL混
合溶液离心，取上清液用甲醇破膜测DOX的含量，即可测得未与HA结合的ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑
DOX NPs或mPEG‑PLL‑DOX NPs的含量，进而换算出与每克HA结合的ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX
NPs或mPEG‑PLL‑DOX NPs含量。
4‑4得到的负载阿霉素的普通纳米胶束mPEG‑PLL‑DOX NPs与HA混合来考察ALN的骨靶向效
果，具体如图4所示。将ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs和mPEG‑PLL‑DOX NPs分别用纯水稀释1倍
后各取5mL，分别加入5mg的HA并给予磁力搅拌，在第30min，1h，2h，3h，4h分别取出200μL混
合溶液离心，取上清液用甲醇破膜测DOX的含量，即可测得未与HA结合的ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑
DOX NPs或mPEG‑PLL‑DOX NPs的含量，进而换算出与每克HA结合的ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX
NPs或mPEG‑PLL‑DOX NPs含量。
[0094] 由于HA不溶于水且载有DOX的纳米胶束不澄清，因此可以在mPEG‑PLL‑DOX NPs和ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs溶液中加入HA，通过观察溶液是否澄清来判断NPs是否与HA结
合，一旦结合，将发生沉淀，溶液变澄清。根据图4A可以发现ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs溶液
与不溶于水的HA混合12h后，其溶液变得澄清(图4A右)，表明ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs与
HA发生结合沉淀在离心管底，而在同样的条件下，不含ALN的mPEG‑PLL‑DOX NPs溶液依然不
澄清(图4A左)，表明其未和HA结合。通过测量不同时间点两种载药纳米胶束与HA的结合量，
如图4B所示，图4B表明ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOXNPs与HA的确有强结合，在4h内每克HA结合了
大约60mg的ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs，是与mPEG‑PLL‑DOX NPs结合量的3倍多，表明含有
ALN的载药纳米胶束能与HA发生强结合，从而起到骨靶向的作用。
合，一旦结合，将发生沉淀，溶液变澄清。根据图4A可以发现ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs溶液
与不溶于水的HA混合12h后，其溶液变得澄清(图4A右)，表明ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs与
HA发生结合沉淀在离心管底，而在同样的条件下，不含ALN的mPEG‑PLL‑DOX NPs溶液依然不
澄清(图4A左)，表明其未和HA结合。通过测量不同时间点两种载药纳米胶束与HA的结合量，
如图4B所示，图4B表明ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOXNPs与HA的确有强结合，在4h内每克HA结合了
大约60mg的ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs，是与mPEG‑PLL‑DOX NPs结合量的3倍多，表明含有
ALN的载药纳米胶束能与HA发生强结合，从而起到骨靶向的作用。
[0095] 实施例6
[0096] mPEG‑PLL‑DOXNPs、ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs和ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs分别在常氧和低氧条件下的体外释放曲线测定：
[0097] 利用实施例4‑1得到的负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs、实施例4‑4得到的负载阿霉素的普通纳米胶束mPEG‑PLL‑DOX NPs和实施例4‑5得
到的负载阿霉素的骨靶向纳米胶束ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs分别配制浓度为200μg/mL的ALN‑
PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs溶液、mPEG‑PLL‑DOX NPs溶液和ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs溶液，并各取
10mL分别加入20mg NADH和100μL肝微粒体，将混合溶液转移至透析袋(MW＝3000)中，将透
析袋放入30mL的PBS溶液中，在低氧条件(37℃，5％CO2，1％O2)下透析。在透析时间为0.5h，
1h，2h，4h，6h，12h和24h时，每个时间节点取出0.5mL的PBS透析液，以8000r/s的速度离心，
取上清液使用HPLC测DOX的含量，计算出DOX释放的累积百分数。同时设置常氧条件(37℃，
5％CO2，20％O2)为对照组。每次取出0.5mL的PBS透析液的同时，补充同样体积的新鲜PBS溶
液，使得整个体系的体积保持不变。DOX释放曲线图如图5所示，根据图5可以发现，在低氧
下，加入肝微粒体和NADH后，含有AZO的ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs的药物释放量明显高于
常氧下的药物释放量(低氧：74％，常氧：24％)，表明低氧下AZO被还原，整个载药纳米粒遭
到破坏从而释放出所负载的DOX。然而不含有AZO的mPEG‑PLL‑DOX NPs和ALN‑PEG‑PLL‑DOX
NPs，不论常氧还是低氧，DOX的累积释放并没有明显变化。
到的负载阿霉素的骨靶向纳米胶束ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs分别配制浓度为200μg/mL的ALN‑
PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs溶液、mPEG‑PLL‑DOX NPs溶液和ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs溶液，并各取
10mL分别加入20mg NADH和100μL肝微粒体，将混合溶液转移至透析袋(MW＝3000)中，将透
析袋放入30mL的PBS溶液中，在低氧条件(37℃，5％CO2，1％O2)下透析。在透析时间为0.5h，
1h，2h，4h，6h，12h和24h时，每个时间节点取出0.5mL的PBS透析液，以8000r/s的速度离心，
取上清液使用HPLC测DOX的含量，计算出DOX释放的累积百分数。同时设置常氧条件(37℃，
5％CO2，20％O2)为对照组。每次取出0.5mL的PBS透析液的同时，补充同样体积的新鲜PBS溶
液，使得整个体系的体积保持不变。DOX释放曲线图如图5所示，根据图5可以发现，在低氧
下，加入肝微粒体和NADH后，含有AZO的ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs的药物释放量明显高于
常氧下的药物释放量(低氧：74％，常氧：24％)，表明低氧下AZO被还原，整个载药纳米粒遭
到破坏从而释放出所负载的DOX。然而不含有AZO的mPEG‑PLL‑DOX NPs和ALN‑PEG‑PLL‑DOX
NPs，不论常氧还是低氧，DOX的累积释放并没有明显变化。
[0098] 实施例7
[0099] 负载阿霉素的骨靶向低氧响应纳米胶束ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs在低氧和常氧细胞内的药物释放行为观察：
[0100] 根据前人的研究，在一层细胞表面加盖一个盖玻片，可以制造出从玻片边缘到玻片中心逐渐降低的氧浓度，所以通过在种有一层细胞的玻底小皿上加盖盖玻片来制造不同
氧气梯度，细胞与载药的纳米胶束共孵育后，使用激光共聚焦显微镜(TCS SP8，Leica)观察
玻片中心直至边缘的DOX荧光强度。在玻底小皿( Surface treated,JET BIOFIL,
Canada)中种入MDA‑MB‑231细胞和RM‑1细胞，每个皿有20000个细胞，培养24h后吸去皿内液
体，用PBS轻轻的洗三次，然后加入2mL溶有ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs的完培，药物溶度为
10μg/mL，同时在玻底上加盖盖玻片，放入细胞培养箱中培养3h后用激光共聚焦显微镜观
察。观察结果如图6所示，图6中A为MDA‑MB‑321细胞的DOX释放行为观察结果，B为RM‑1细胞
的DOX释放行为观察结果。在MDA‑MB‑321细胞(图6A)和RM‑1细胞(图6B)上加盖盖玻片后，中
心的DOX荧光强度比边缘要强很多，说明玻片中心的细胞中药物释放的更多，表明ALN‑PEG‑
AZO‑PLL‑DOX NPs的药物释放是低氧依赖性的，进一步表明其具有低氧响应性。
氧气梯度，细胞与载药的纳米胶束共孵育后，使用激光共聚焦显微镜(TCS SP8，Leica)观察
玻片中心直至边缘的DOX荧光强度。在玻底小皿( Surface treated,JET BIOFIL,
Canada)中种入MDA‑MB‑231细胞和RM‑1细胞，每个皿有20000个细胞，培养24h后吸去皿内液
体，用PBS轻轻的洗三次，然后加入2mL溶有ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs的完培，药物溶度为
10μg/mL，同时在玻底上加盖盖玻片，放入细胞培养箱中培养3h后用激光共聚焦显微镜观
察。观察结果如图6所示，图6中A为MDA‑MB‑321细胞的DOX释放行为观察结果，B为RM‑1细胞
的DOX释放行为观察结果。在MDA‑MB‑321细胞(图6A)和RM‑1细胞(图6B)上加盖盖玻片后，中
心的DOX荧光强度比边缘要强很多，说明玻片中心的细胞中药物释放的更多，表明ALN‑PEG‑
AZO‑PLL‑DOX NPs的药物释放是低氧依赖性的，进一步表明其具有低氧响应性。
[0101] 实施例8
[0102] 考察骨靶向低氧响应纳米胶束在C57BL/6荷瘤小鼠体内的骨靶向作用：
[0103] 取20mg实施例1‑2得到的骨靶向低氧响应聚合物ALN‑PEG‑AZO‑PLL溶于4mL DMF中，加4mg荧光染料Cy5.5在剧烈磁力搅拌下滴加10mL水，接着搅拌1.5h，将混合溶液移至透
析袋(MW＝3000)中，纯水透析24h，冻干后得到负载荧光染料Cy5.5的骨靶向低氧响应纳米
胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs)。
析袋(MW＝3000)中，纯水透析24h，冻干后得到负载荧光染料Cy5.5的骨靶向低氧响应纳米
胶束(ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs)。
[0104] 取20mg实施例2‑2得到的mPEG‑PLL溶入到溶于4mL DMF中，加4mg荧光染料Cy5.5在剧烈磁力搅拌下滴加10mL水，接着搅拌1.5h，将混合溶液移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透
析24h，冻干后得到负载荧光染料Cy5.5的纳米胶束(mPEG‑PLL‑Cy5.5NPs)。
析24h，冻干后得到负载荧光染料Cy5.5的纳米胶束(mPEG‑PLL‑Cy5.5NPs)。
[0105] 取20mg实施例2‑3得到的ALN‑PEG‑PLL溶入到溶于4mL DMF中，加4mg荧光染料Cy5.5在剧烈磁力搅拌下滴加10mL水，接着搅拌1.5h，将混合溶液移至透析袋(MW＝3000)
中，纯水透析24h，冻干后得到负载荧光染料Cy5.5的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL‑
Cy5.5NPs)。
中，纯水透析24h，冻干后得到负载荧光染料Cy5.5的骨靶向纳米胶束(ALN‑PEG‑PLL‑
Cy5.5NPs)。
[0106] 使用C57BL/6小鼠进行骨转移瘤模型的建造：使用水合氯醛麻醉C57BL/6小鼠后，小心暴露右腿的股骨，用29gauge针头从股骨端向股骨内打孔，然后注入20μL以上5×
107cells/mL的细胞悬液，用骨蜡封住针孔后缝合。给予造模后的小鼠足够的粮食和水，造
模第10天，随机分为3组，每组3只，各组小鼠分别腹腔注射水合氯醛麻醉，然后在尾静脉分
别注射mPEG‑PLL‑Cy5.5NPs、ALN‑PEG‑PLL‑Cy5.5NPs或ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs，静脉注
射后第0h，第0.5h，1h，2h，4h，6h，12h和24h分别用小动物活体成像仪(Lumina II,Caliper
Life Sciences)采集荧光图片，如图7中A图所示。然后，使用IVIS成像软件分析图7中A图所
示的荧光图片的荧光强度，然后比较不同组别不同时间点肿瘤部位与正常组织部位的荧光
比值，结果如图7中B图所示。第24h采集完照片后，将小鼠安乐死，取出各组小鼠的心、肝、
脾、肺、肾、正常骨和骨转移骨，并进行成像，成像图片如图7中C图所示。图像采集参数如下：
Exposure time＝auto,PixelWidth＝1cm,Pixel Height＝1cm,Binning Factor＝8,
fNumber＝2,Field ofView(FOV)＝10cm。
107cells/mL的细胞悬液，用骨蜡封住针孔后缝合。给予造模后的小鼠足够的粮食和水，造
模第10天，随机分为3组，每组3只，各组小鼠分别腹腔注射水合氯醛麻醉，然后在尾静脉分
别注射mPEG‑PLL‑Cy5.5NPs、ALN‑PEG‑PLL‑Cy5.5NPs或ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs，静脉注
射后第0h，第0.5h，1h，2h，4h，6h，12h和24h分别用小动物活体成像仪(Lumina II,Caliper
Life Sciences)采集荧光图片，如图7中A图所示。然后，使用IVIS成像软件分析图7中A图所
示的荧光图片的荧光强度，然后比较不同组别不同时间点肿瘤部位与正常组织部位的荧光
比值，结果如图7中B图所示。第24h采集完照片后，将小鼠安乐死，取出各组小鼠的心、肝、
脾、肺、肾、正常骨和骨转移骨，并进行成像，成像图片如图7中C图所示。图像采集参数如下：
Exposure time＝auto,PixelWidth＝1cm,Pixel Height＝1cm,Binning Factor＝8,
fNumber＝2,Field ofView(FOV)＝10cm。
[0107] 根据图7中A图，0h时所示右侧圈为小鼠右腿患有骨转移瘤的股骨，左侧圈为小鼠左腿正常股骨，由于纳米粒子的EPR效应，mPEG‑PLL‑Cy5.5NPs少量地到达骨肿瘤中，随着时
间的延长，骨肿瘤中的mPEG‑PLL‑Cy5.5NPs被代谢掉；由于ALN的骨靶向作用，ALN‑PEG‑PLL‑
Cy5.5NPs会比mPEG‑PLL‑Cy5.5NPs更多聚集到骨肿瘤中，但由于没有很好的控释效果，所以
到24h时大多也被代谢掉；ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs不仅有ALN的骨靶向效果，同时还有
AZO的低氧响应效果，因此，其能大量的聚集到骨肿瘤中，在骨肿瘤的低氧环境中，AZO被还
原，Cy5.5从ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs中释放出来，因此在骨肿瘤部位的荧光强度更高，
并且到24h时骨肿瘤中仍然存在Cy5.5(图7A)。到24h后将不同组的小鼠处死，取出其重要器
官(心、肝、脾、肺和肾)以及转移骨和正常骨进行近红外成像也得出同样的结果，与其他两
组相比，尾静脉注射ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs后在患有骨转移瘤的右腿中荧光是最强的
(图7C)，进一步说明由于ALN的骨靶向作用以及AZO低氧控释作用，其能更多的富集在骨肿
瘤部位。通过使用IVIS成像软件分析左右腿画圈部位的荧光强度，来比较不同组别不同时
间点肿瘤部位与正常组织部位的荧光比值，不同时间点中ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs的比
值是最大的(图7B)。
间的延长，骨肿瘤中的mPEG‑PLL‑Cy5.5NPs被代谢掉；由于ALN的骨靶向作用，ALN‑PEG‑PLL‑
Cy5.5NPs会比mPEG‑PLL‑Cy5.5NPs更多聚集到骨肿瘤中，但由于没有很好的控释效果，所以
到24h时大多也被代谢掉；ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs不仅有ALN的骨靶向效果，同时还有
AZO的低氧响应效果，因此，其能大量的聚集到骨肿瘤中，在骨肿瘤的低氧环境中，AZO被还
原，Cy5.5从ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs中释放出来，因此在骨肿瘤部位的荧光强度更高，
并且到24h时骨肿瘤中仍然存在Cy5.5(图7A)。到24h后将不同组的小鼠处死，取出其重要器
官(心、肝、脾、肺和肾)以及转移骨和正常骨进行近红外成像也得出同样的结果，与其他两
组相比，尾静脉注射ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs后在患有骨转移瘤的右腿中荧光是最强的
(图7C)，进一步说明由于ALN的骨靶向作用以及AZO低氧控释作用，其能更多的富集在骨肿
瘤部位。通过使用IVIS成像软件分析左右腿画圈部位的荧光强度，来比较不同组别不同时
间点肿瘤部位与正常组织部位的荧光比值，不同时间点中ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑Cy5.5NPs的比
值是最大的(图7B)。
[0108] 实施例9
[0109] 利用实施例4‑1、4‑4和4‑5得到的ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs、mPEG‑PLL‑DOX NPs和ALN‑PEG‑PLL‑DOXNPs来对患有骨转移瘤小鼠进行治疗，具体实施方案如下：
[0110] 荷瘤小鼠随机分为5组，每组6只，造模第7天各组分别以5mg DOX/kg体重的给药剂量尾静脉注射以下药物：PBS、DOX、mPEG‑PLL‑DOX NPs、ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs或ALN‑PEG‑
AZO‑PLL‑DOX NPs，每4天给药一次。从造模的第一天开始，每隔一天测量各组小鼠右腿在
4min内抬脚次数和抬脚时间并根据以下标准给每组小鼠疼痛行为评分：4分：正常使用；3
分：有轻度跛行；2分：跛行明显，有停步抬高患肢现象；1分：部分不能使用患肢；0分：完全不
能使用患肢。小鼠的抬脚次数和抬脚时间的测量是通过摄像观察法，先将小鼠放入透明玻
璃盒(10cm×10cm×10cm)中预适应2‑3天，一只小鼠一个盒子，等小鼠适应了玻璃盒的环境
后，开始测量。测量前每只小鼠先在玻璃盒中适应10min，然后使用数码相机拍摄小鼠在玻
璃盒中10min内的活动视频，根据所拍摄的视频的第4min‑第8min来观察小鼠在4分钟内的
抬脚次数和抬脚时间，并根据全程视频对小鼠的活动情况进行打分，得到治疗效果图如图8
所示，图8中A图为不同造模天数，各组老鼠4分钟内抬脚次数比较结果，B图为不同造模天
数，各组老鼠4分钟内抬脚时间比较结果，C图为不同造模天数，各组老鼠疼痛行为评分比较
结果，D图为不同造模天数，各组老鼠体重比较结果，E图为不同造模天数，各组老鼠生存率
比较结果。由图8(A‑C)可见，荷瘤小鼠分别给予PBS，DOX，mPEG‑PLL‑DOX NPs或ALN‑PEG‑
PLL‑DOX NPs治疗后，在第17天，抬脚次数和抬脚时间达到了峰值，抬脚次数分别为20,19,
18,17(图8A)，抬脚时间分别为4.6s,3.4s,4.2s,3.6s(图8B)，而ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOXNPs
治疗组在第17天的抬脚次数和时间分别为4和1.9s,可见与其他组有显著差异，表明荷瘤小
鼠给予ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs治疗后能明显减轻骨痛。第17天后，不同给药组小鼠抬脚
次数和时间有下降趋势，这是由于一些荷瘤小鼠已经瘫痪，不能使用右腿。从荷瘤小鼠右腿
使用情况打分也可以看出(图8C)，ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs与其他组相比能明显减轻疼
痛，提高治疗效果。
AZO‑PLL‑DOX NPs，每4天给药一次。从造模的第一天开始，每隔一天测量各组小鼠右腿在
4min内抬脚次数和抬脚时间并根据以下标准给每组小鼠疼痛行为评分：4分：正常使用；3
分：有轻度跛行；2分：跛行明显，有停步抬高患肢现象；1分：部分不能使用患肢；0分：完全不
能使用患肢。小鼠的抬脚次数和抬脚时间的测量是通过摄像观察法，先将小鼠放入透明玻
璃盒(10cm×10cm×10cm)中预适应2‑3天，一只小鼠一个盒子，等小鼠适应了玻璃盒的环境
后，开始测量。测量前每只小鼠先在玻璃盒中适应10min，然后使用数码相机拍摄小鼠在玻
璃盒中10min内的活动视频，根据所拍摄的视频的第4min‑第8min来观察小鼠在4分钟内的
抬脚次数和抬脚时间，并根据全程视频对小鼠的活动情况进行打分，得到治疗效果图如图8
所示，图8中A图为不同造模天数，各组老鼠4分钟内抬脚次数比较结果，B图为不同造模天
数，各组老鼠4分钟内抬脚时间比较结果，C图为不同造模天数，各组老鼠疼痛行为评分比较
结果，D图为不同造模天数，各组老鼠体重比较结果，E图为不同造模天数，各组老鼠生存率
比较结果。由图8(A‑C)可见，荷瘤小鼠分别给予PBS，DOX，mPEG‑PLL‑DOX NPs或ALN‑PEG‑
PLL‑DOX NPs治疗后，在第17天，抬脚次数和抬脚时间达到了峰值，抬脚次数分别为20,19,
18,17(图8A)，抬脚时间分别为4.6s,3.4s,4.2s,3.6s(图8B)，而ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOXNPs
治疗组在第17天的抬脚次数和时间分别为4和1.9s,可见与其他组有显著差异，表明荷瘤小
鼠给予ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs治疗后能明显减轻骨痛。第17天后，不同给药组小鼠抬脚
次数和时间有下降趋势，这是由于一些荷瘤小鼠已经瘫痪，不能使用右腿。从荷瘤小鼠右腿
使用情况打分也可以看出(图8C)，ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs与其他组相比能明显减轻疼
痛，提高治疗效果。
[0111] 分别给予荷瘤小鼠PBS、DOX、mPEG‑PLL‑DOX NPs、ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs或ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs后，通过每两天监测小鼠的体重来评估不同剂型的全身毒性，并且观
察不同治疗组小鼠生存情况来评估治疗效果。由图8D可见，荷瘤小鼠给予不同剂型治疗后，
21天内体重变化不大，表明不同药物剂型没有明显的系统毒性。由图8E中的生存率曲线图
可见，与其他治疗组相比，ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs治疗组能够延长荷瘤小鼠的生存时
间。
察不同治疗组小鼠生存情况来评估治疗效果。由图8D可见，荷瘤小鼠给予不同剂型治疗后，
21天内体重变化不大，表明不同药物剂型没有明显的系统毒性。由图8E中的生存率曲线图
可见，与其他治疗组相比，ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs治疗组能够延长荷瘤小鼠的生存时
间。
[0112] 造模第21天将不同给药组(PBS、DOX、mPEG‑PLL‑DOX NPs、ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs和ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX NPs)小鼠安乐死，取出荷瘤的股骨，用生理盐水洗净血液，使用
Micro‑CT(SKYSCAN 1176,Belgium)进行断层扫描，并用相应的骨分析软件进行3D重建，分
别评估骨密度(BMD)和骨小梁数(Tb.N)。Micro‑CT进一步评估不同载药纳米粒对于骨转移
瘤的治疗效果。治疗效果如图9所示，图9中的A图为由Micro‑CT所拍的荷瘤小鼠股骨的冠状
面和矢状面，B图为对股骨前端的Micro‑CT3D重建图，C图为不同给药组小鼠的骨密度数比
较图，D图为不同给药组小鼠的骨小梁数比较图。荷瘤小鼠给予不同药物剂型治疗后，PBS
组、DOX组和mPEG‑PLL‑DOX NPs组的小鼠的股骨发生严重的破坏，表现为骨质被侵蚀和粉碎
性骨折，而ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs治疗组对骨质的破坏要小些，可能因为ALN对病变骨有靶
向的效果，因此对骨质有一定的保护，但仍然可以看出骨质的溶解。只有给予ALN‑PEG‑AZO‑
PLL‑DOX NPs治疗组，对骨质的保护是最有效的。3D重建的Micr‑CT图像也表现同样的结果，
对股骨前端的Micro‑CT 3D重建的图像表明正常的股骨前端的表面是光滑平整的，骨质也
是结实的，但给予PBS、DOX或mPEG‑PLL‑DOX NPs治疗后，股骨前端骨结构变得不完整，表面
发生侵蚀变得粗糙，骨质也变得疏松；ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs治疗组对骨质的保护比前三组
要好些，但骨质仍然有破坏，只有ALN‑EPG‑AZO‑PLL‑DOX NPs治疗组基本能保存完好的骨
质，表明其对骨转移瘤的治疗效果是最佳的(图9B)。由图9C和图9D可以看出，给予ALN‑PEG‑
AZO‑PLL‑DOX NPs治疗后，其骨密度和骨小梁数都比其他组高，表明ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX
NPs有较优的治疗效果。
Micro‑CT(SKYSCAN 1176,Belgium)进行断层扫描，并用相应的骨分析软件进行3D重建，分
别评估骨密度(BMD)和骨小梁数(Tb.N)。Micro‑CT进一步评估不同载药纳米粒对于骨转移
瘤的治疗效果。治疗效果如图9所示，图9中的A图为由Micro‑CT所拍的荷瘤小鼠股骨的冠状
面和矢状面，B图为对股骨前端的Micro‑CT3D重建图，C图为不同给药组小鼠的骨密度数比
较图，D图为不同给药组小鼠的骨小梁数比较图。荷瘤小鼠给予不同药物剂型治疗后，PBS
组、DOX组和mPEG‑PLL‑DOX NPs组的小鼠的股骨发生严重的破坏，表现为骨质被侵蚀和粉碎
性骨折，而ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs治疗组对骨质的破坏要小些，可能因为ALN对病变骨有靶
向的效果，因此对骨质有一定的保护，但仍然可以看出骨质的溶解。只有给予ALN‑PEG‑AZO‑
PLL‑DOX NPs治疗组，对骨质的保护是最有效的。3D重建的Micr‑CT图像也表现同样的结果，
对股骨前端的Micro‑CT 3D重建的图像表明正常的股骨前端的表面是光滑平整的，骨质也
是结实的，但给予PBS、DOX或mPEG‑PLL‑DOX NPs治疗后，股骨前端骨结构变得不完整，表面
发生侵蚀变得粗糙，骨质也变得疏松；ALN‑PEG‑PLL‑DOX NPs治疗组对骨质的保护比前三组
要好些，但骨质仍然有破坏，只有ALN‑EPG‑AZO‑PLL‑DOX NPs治疗组基本能保存完好的骨
质，表明其对骨转移瘤的治疗效果是最佳的(图9B)。由图9C和图9D可以看出，给予ALN‑PEG‑
AZO‑PLL‑DOX NPs治疗后，其骨密度和骨小梁数都比其他组高，表明ALN‑PEG‑AZO‑PLL‑DOX
NPs有较优的治疗效果。
[0113] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或
基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将
实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说
明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明
内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在
不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，
本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将
实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说
明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明
内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在
不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，
本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。