一种特异性长效RNA在制备治疗乳腺癌的药物中的用途

摘要

本发明提供了一种特异性长效RNA在制备治疗乳腺癌的药物中的用途，所述特异性长效RNA的核苷酸序列为：5’‑CCAAGGAGCAAGAUACACUGCUCCUUGGCU‑3’。本发明首次发现一个从未报道过的治疗乳腺癌的潜在有效靶点——lncRNA PAS1，揭示了其具体作用的分子机制：通过与组蛋白甲基转移酶SUV39H1相互作用，从而提高了核糖体DNA附近的H3K9me2/3修饰，抑制核糖体RNA的转录，使癌细胞中成熟核糖体的数量大大减少，抑制癌细胞中的蛋白合成，进而抑制乳腺癌的发生发展；进一步研究发现PAS1‑30nt‑RNA，可通过抑制肿瘤的生长和转移，延缓乳腺癌进程，为其他治疗争取时间，惠及乳腺癌患者。

权利要求

1.一种特异性长效RNA在制备治疗乳腺癌的药物中的用途，其特征在于，所述特异性长效RNA的核苷酸序列为：

5’-CCAAGGAGCAAGAUACACUGCUCCUUGGCU-3’。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特异性长效RNA经过2’OMe修饰和5’Chol修饰。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物为溶液、悬液或片剂的形式。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述溶液为注射溶液。

说明书

一种特异性长效RNA在制备治疗乳腺癌的药物中的用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种特异性长效RNA在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。

背景技术

[0002] 癌症是世界范围内最常见的公共卫生问题之一，其中，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，已经成为我国乃至全球的重大健康问题。根据最新的统计结果显示，乳腺癌是全球范围内女性恶性肿瘤发病率第一，也是致死率第一。

[0003] 乳腺癌的发生发展是比较复杂的病生理过程，寻找有效的治疗靶点，达到减缓乳腺癌进程将是乳腺癌患者的福音。目前，常见的乳腺癌靶向药物包括曲妥珠单抗和拉帕替尼单抗，但这些靶向药物不仅价格昂贵，且有不良反应。曲妥珠单抗最常见的不良反应是心脏毒性，而拉帕替尼单抗最常见的不良反应是腹泻。现阶段需要寻找更为准确、更多的有效治疗靶点。

[0004] 近几年已有多篇文章报道长非编码lncRNA也在乳腺癌的发生发展中发挥着重要的功能，然而lncRNA能否作为抑制乳腺癌的靶点，在乳腺癌发生后靶向治疗的效果如何并不知晓。

发明内容

[0005] 针对上述情况，本发明的目的在于提供一种特异性长效RNA在制备治疗乳腺癌的药物中的用途，所述特异性长效RNA可有效抑制乳腺癌肿瘤的生长和转移进程。

[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

[0007] 一种特异性长效RNA在制备治疗乳腺癌的药物中的用途，所述特异性长效RNA的核苷酸序列为：

[0008] 5’-CCAAGGAGCAAGAUACUGCUCCUUGGCU-3’。

[0009] 进一步的，所述特异性长效RNA经过2’OMe修饰和5’Chol修饰。

[0010] 进一步的，所述药物为溶液、悬液或片剂的形式；所述溶液为可注射溶液。

[0011] 进一步的，所述药物通过注射、口服、局部或直肠给药来进行施用。

[0012] 进一步的，所述特异性长效RNA的用量为3～10nmol/20g体重，优选为5nmol/20g体重。

[0013] 本发明发现了一个未被报道过的lncRNA PAS1，通过与组蛋白甲基转移酶SUV39H1相互作用，从而提高了核糖体DNA附近的H3K9me2/3修饰，抑制核糖体RNA的转录，使癌细胞中成熟核糖体的数量大大减少，抑制癌细胞中的蛋白合成，进而抑制乳腺癌的发生发展。通过对乳腺癌和癌旁组织进行测序，发现lncRNA PAS1在乳腺癌中明显下调，这说明它是一个乳腺癌的抑制分子。我们在细胞中分别过表达和敲低lncRNA PAS1后做了细胞功能试验，本专利发现lncRNA PAS1能够明显抑制癌细胞的生长、侵袭和转移能力。在免疫全缺陷Nod-scid鼠体内构建了原位肿瘤生长和肿瘤细胞经血转移的模型，进一步验证了lncRNA PAS1能够有效抑制乳腺癌的生长和转移。接下来我们找到了lncRNA PAS1中主要发挥作用的长度为30nt大小的茎环序列，在乳腺癌细胞内验证了其可以抑制核糖体的形成以及抑制乳腺癌细胞的生长转移侵袭能力。本专利还在Nod-scid鼠体内构建了原位肿瘤生长和肿瘤细胞经血转移的模型之后，对小鼠给予长效PAS1-30nt-RNA尾静脉注射治疗乳腺癌，我们发现PAS1-30nt-RNA能够有效在乳腺癌形成后起到治疗效果，抑制肿瘤的生长和转移。

[0014] 总之，本专利发现lncRNA PAS1可有效抑制乳腺癌发生发展，过表达lncRNA PAS1可抑制乳腺癌的生长转移。乳腺癌发生后给予PAS1-30nt-RNA尾静脉注射可有效抑制生长和转移。

[0015] 本发明相比现有技术的有益效果为：

[0016] 1、本发明首次发现一个从未报道过的治疗乳腺癌的潜在有效靶点——lncRNA PAS1，揭示了其具体作用的分子机制：通过与组蛋白甲基转移酶SUV39H1相互作用，从而提高了核糖体DNA附近的H3K9me2/3修饰，抑制核糖体RNA的转录，使癌细胞中成熟核糖体的数量大大减少，抑制癌细胞中的蛋白合成，进而抑制乳腺癌的发生发展；

[0017] 2、本发明在lncRNA PAS1中发现主要发挥作用的长度为30nt大小的茎环序列——PAS1-30nt-RNA，可通过抑制肿瘤的原位生长和转移，延缓乳腺癌进程，为其他治疗争取时间，惠及乳腺癌患者。

附图说明

[0018] 图1为lncRNA测序结果图；

[0019] 图2为所述lncRNA PAS1在细胞中的定位研究结果示意图；

[0020] 图3为所述lncRNA PAS1在细胞内对核糖体RNA及核糖体量的影响；

[0021] 图4为所述lncRNAPAS1与蛋白SUV39H1相互作用的区段；

[0022] 图5为所述lncRNA PAS1在体外对乳腺癌细胞增殖侵袭转移的抑制作用；

[0023] 图6为所述lncRNA PAS1在小鼠体内对乳腺癌增殖转移的抑制作用；

[0024] 图7为所述PAS1-30nt-RNA在体内外对乳腺癌增殖侵袭转移的抑制作用。

具体实施方式

[0025] 实施例中所采用的材料：

[0026] 浓盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、二甲苯、碳酸氢钠、异丙醇、三氯甲烷、丙三醇、无水乙醇、甲醇、冰醋酸、葡萄糖、无水乙酸钠、氯化钙等购自北京化工厂；对苯二酚、2-巯乙基磺酸钠、多聚甲醛、二磷酸氯喹盐、过硫酸铵、焦碳酸二乙酯(DEPC)、结晶紫、考马斯亮蓝R250、氯化镁六水合物、氯化锰、氯化钠、硼酸、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、脱氧胆酸钠、硝普钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、原钒酸钠盐、HEPES、二甲基亚砜(DMSO)、戌巴比妥钠、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、溴酚蓝、CHAPS、Tris、Tween-20、NP-40、Triton X-100、dNTP、氯霉素(Cam)等购自Sigma公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)等购自北京鼎国昌盛生物技术公司。

[0027] 实施例中所涉及的细胞培养：

[0028] 人乳腺癌细胞系MCF-7，Hs578T，MDA-MB-231，BT549细胞均购自ATCC，由本室冻存。其中，MCF-7，Hs578T，MDA-MB-231细胞在DMEM培养基中培养；BT549细胞在RPMI 1640培养基中培养。完全培养基中含有10％的胎牛血清、100U/毫升青霉素和100毫克/毫升的链霉素，在37℃、5％CO2的培养箱中培养。

[0029] 实施例中所采用的RNA提取和定量PCR分析方法：

[0030] 根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用Vazyme公司操作说明书进行。逆转录试剂盒对lug总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。

[0031] 实施例中所采用的结果分析：

[0032] 分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。数据分析采用ΔΔCt法。

[0033] 实施例中所涉及的实验方法包括：

[0034] 质粒构建：

[0035] 人长非编码lncRNA PAS1全长cDNA序列合成并插入到pcDNA3.1载体中。lncRNA PAS1的异位过表达是通过pcDNA3.1-PAS1转染获得的，以一个空的pcDNA3.1载体为对照。48小时后qRT-PCR检测长非编码PAS1的表达水平。

[0036] 细胞转染(以六孔板为例)：

[0037] (a)提前一天将细胞种植到六孔板中，20～24小时后转染。转染时细胞密度应为60％-80％，且位于对数生长期；

[0038] (b)用培养液洗涤培养板中的细胞1～2遍，最后每孔留下1ml培养液；

[0039] (c)配制转染混合溶液：溶液A，将3μg DNA加入200μl Opti-MEM培养基中混匀；溶液B，将6μl PEI加入200μl Opti-MEM培养基中，室温放置5min；

[0040] (d)将两者混匀，室温放置10min；

[0041] (e)将混合溶液加到细胞培养皿中，并与培养基混匀后继续培养4～6小时；

[0042] (f)将培养基换为新鲜的含10％FBS的培养基继续培养至48小时。

[0043] Transwell实验：

[0044] (a)消化细胞与细胞传代步骤一样，最后一遍PBS重悬离心得到细胞，用Adhesion buffer重悬细胞；

[0045] Adhesion buffer配方：CaCl2：1mM

[0046] MgCl2：1mM

[0047] MnCl2：0.2mM

[0048] BSA：0.5％

[0049] DMEM培养基溶解；

[0050] (b)细胞计数：一般将细胞稀释2-10倍后计数，保证每次4个大方格总数为50-200个；

[0051] (c)调整细胞浓度，细胞浓度调整为3×105个/ml；

[0052] (d)细胞迁移实验中在tranwell小室的下室加入含10g/ml collagen的培养基，上室加入100ml细胞(数量为3×104个)；

[0053] (e)细胞穿过6-8h后，取出transwell小室，用棉签轻轻旋转擦拭细胞接种面，去除未穿膜细胞；

[0054] (f)加入800μl/孔4％多聚甲醛固定15min，用棉签轻轻旋转擦拭细胞接种面；

[0055] (g)用硼酸钠配置的结晶紫溶液染色，600μl/孔，染色15min，用棉签轻轻旋转擦拭细；

[0056] (h)胞接种面。超纯水漂洗，用棉签轻轻旋转擦拭细胞接种面，倒置显微镜下观察并采图。

[0057] RNA免疫共沉淀(RIP)实验

[0058] (a)收集107细胞，用预冷PBS洗涤细胞两次；

[0059] (b)使用500μl新配置的RIP buffer重悬细胞沉淀；

[0060] RIP buffer配方：

[0061] Tris：25mM.PH7.4

[0062] KCl：150mM

[0063] DTT：0.5mM

[0064] NP-40：：0.5％

[0065] EDTA：5mM

[0066] 蛋白酶抑制剂

[0067] RNA酶抑制剂；

[0068] (c)4℃离心，12,000rpm 15min，上清为细胞裂解液；

[0069] (d)向细胞裂解液中加入相应的蛋白抗体(2-10μg)，4℃孵育2h；

[0070] (e)向上述裂解液中加入ProeinA/G珠子(40μl)，4℃摇床1h；

[0071] (f)4℃离心，弃上清，4,000rpm 1min，用RIP buffer洗三遍；

[0072] (g)Trizol试剂加入到洗脱液中制备RNA样品。

[0073] HE和免疫组化试验

[0074] 1.HE染色

[0075] (a)依次按照以下步骤进行石蜡切片脱蜡水化：二甲苯两次各10min，100％酒精两次各10min，95％酒精5min，90％酒精5min，80％酒精5min，70％酒精5min，超纯水5min；

[0076] (b)Harry′s苏木精液染色15min，水洗；

[0077] (c)酒精酸中漂洗两遍，自来水冲洗10min；

[0078] (d)伊红中染色10min；

[0079] (e)逐级脱水：超纯水5min，70％酒精5min，80％酒精5min，90％酒精5min，95％；

[0080] (f)酒精5min，100％酒精两次各10min，二甲苯两次各10min，中性树脂封片，镜检。

[0081] 2.免疫组化染色

[0082] (a)依次按照以下步骤进行石蜡切片脱蜡水化：二甲苯两次各10min，100％酒精两次各10min，95％酒精5min，90％酒精5min，80％酒精5min，70％酒精5min，超纯水5min；

[0083] (b)3％H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下30min。结束后PBS冲洗3遍，每次5min；

[0084] (c)加入抗原热修复液柠檬酸盐缓冲液，水浴锅煮沸25min，之后自然冷却到室温。结束后PBS洗3遍，每次5min；

[0085] (d)孵育一抗4℃过夜，第二天早上室温再孵育半小时。结束后PBS洗3遍，每次5min；

[0086] (e)孵育相应二抗，室温孵育30-60min。结束后PBS洗3遍，每次5min；

[0087] (f)DAB显色，显色后置于自来水中，再静置与超纯水中5min，Mayer’s苏木精复染细胞核，用自来水冲洗返蓝，时间越久越好，直至细胞核呈现明显蓝色；

[0088] (g)逐级脱水：超纯水5min，70％酒精5min，80％酒精5min，90％酒精5min，95％；

[0089] (h)酒精5min，100％酒精两次各10min，二甲苯两次各10min，中性树脂封片，最后镜检。

[0090] 实施例1——lncRNA PAS1在乳腺癌中的表达分析

[0091] 用两对乳腺癌患者的癌和癌旁组织以及恶性程度不同的两株乳腺癌细胞系MCF-7和Hs578T分别做了lncRNA测序，如图1中A、B所示，我们发现在第一对癌组织相对于癌旁组织中，有85条lncRNA是下调的，在第二对癌组织相对于癌旁组织，有469条lncRNA是下调的，在恶性程度较低的MCF-7细胞相对于恶性程度较高的Hs578T细胞，有134条lncRNA是下调的，在这其中有3条lncRNA是共同下调的。如图1中C所示，在这三条lncRNA中，我们又发现lncRNA PAS1是下调最为明显的，我们就挑选了它作为我们的研究对象，同时这些结果也提示了它可能作为一个潜在的抑癌分子在乳腺癌中发挥着重要的作用。

[0092] 实施例2——lncRNA PAS1在细胞中的定位位置

[0093] 本实施例中用三种乳腺癌细胞系——MCF-7，Hs578T，MDA-MB-231进行了核浆分离提取RNA，用QPCR检测了lncRNA PAS1在细胞内的定位，如图2中A所示，发现lncRNAPAS1主要定位在细胞核内。

[0094] 接着我们又用lncRNA PAS1的探针对细胞进行了原位杂交实验，如图2中B所示，发现lncRNA PAS1在细胞核内又主要是定位在核仁内。我们接下来进一步验证了lncRNA PAS1的核仁定位，将其与核仁的标志物Fibrillarin和UBF1分别进行共染，如图2中C所示，我们发现lncRNAPAS1定位于细胞的核仁中。

[0095] 实施例3——lncRNA PAS1对核糖体合成的影响

[0096] 实施例2的结果发现lncRNA PAS1的亚细胞定位是在核仁，由于rRNA的转录也是在细胞核仁中发生的，我们就猜测lncRNA PAS1可能可以调节rRNA。

[0097] 本实施例在多种乳腺癌细胞系中过表达或敲低lncRNA PAS1，再用QPCR检测rRNA的量，如图3中A、B所示，过表达lncRNA PAS1能够使rRNA的量减少，敲低lncRNA PAS1能够使rRNA的量增多。同样的结果在另外三种乳腺癌细胞系中都得到了相同的结果，综上，可以判断lncRNA PAS1能够负性调控rRNA的量。然后，我们又过量和敲低了lncRNA PAS1后，提取细胞的核糖体进行检测，结果如图3中C、D所示，发现lncRNA PAS1能够明显抑制细胞内核糖体的合成。之后，用5-Fu处理细胞，5-Fu能够阻滞细胞内对RNA的处理，用4sU标记新合成的RNA，提取了新合成的RNA，进一步发现lncRNA PAS1能够使新合成的rRNA的量减少，提示lncRNA PAS1影响的是rRNA的转录。接着我们构建了rRNA的luci报告质粒，进一步证实了lncRNA PAS1影响rRNA的转录。

[0098] 实施例4——lncRNA PAS1抑制rRNA转录的机理

[0099] 本实施例中先用实验室有的组蛋白修饰抗体H3K9me2/3、H3K9me3/ac、H3K4me3、H4ac做了染色质免疫共沉淀，发现在rDNA附近的H3K9me2/3修饰较多。接着我们发现过表达lncRNA PAS1能够明显使细胞内的H3K9me2/3水平升高，敲低lncRNA PAS1使H3K9me2/3水平降低。我们接着在过表达和敲低lncRNA PAS1的细胞中用H3K9me2/3抗体做了染色质免疫共沉淀，发现过表达lncRNA PAS1能够明显使rDNA区域的H3K9me2/3的修饰增多，敲低lncRNA PAS1能够明显使rDNA区域的H3K9me2/3的修饰减少。基于以上的结果猜测lncRNA PAS1能否与H3K9me2/3的甲基转移酶SUV399H1相互作用，从而我们在细胞内进行RIP实验，发现内/外源的SUV39H1都能够与内源的lncRNA PAS1相互作用，我们还排除了lncRNA PAS1与H3K9me1的甲基转移酶G9a的相互作用，说明lncRNA PAS1与SUV39H1的相互作用是特异的。接着在细胞里共染了lncRNA PAS1，它们在细胞内存在共同的亚细胞定位。

[0100] 如图4所示，我们用RNApull down的方法确定了lncRNA PAS1中与SUV39H1相互作用的区域，结合网站上对RNA结构的预测，我们发现lncRNA PAS1的1766-1795序列会形成稳定的茎环结构，且确实与SUV39H1有相互作用，也确定了是SUV39H1的M段与lncRNAPAS1有相互作用。

[0101] 实施例5——体内外实验验证lncRNA PAS1能够抑制乳腺癌的生长和转移[0102] 本实施例构建了过表达和敲低lncRNA PAS1的稳定乳腺癌细胞系，然后进行了体外的细胞功能实验，细胞增殖、侵袭、转移和克隆形成，如图5中A、B所示，发现lncRNA PAS1具有显著的抑制乳腺癌细胞增殖、生长、侵袭和转移的作用。如图5中C所示，我们还发现lncRNA PAS1是依赖SUV39H1发挥抑癌作用的，当我们在过表达lncRNA PAS1的细胞中敲低SUV39H1之后，lncRNA PAS1对细胞克隆形成和转移的抑制作用就消失了。

[0103] 接着本实施例将MDA-MB-231-Luc-D3H2LN细胞构建成为稳定表达lncRNA PAS1的细胞株，将其与对照细胞株打到6周龄雌性NOD-SCID鼠的第四对乳腺脂肪垫观察肿瘤的生长，或者是经由尾静脉打入血观察乳腺癌细胞经血转移并且种植在肺的情况，如图6中A、B所示，我们可以明显看到过表达lncRNA PAS1能够在小鼠体内抑制乳腺癌的生长和转移。我们还对原位生长的肿瘤测量其大小，最后将肿瘤取出称重，可以看到过表达lncRNA PAS1之后，肿瘤整个生长过程中速度减慢了，并且最后肿瘤的重量也有明显减小。

[0104] 如图7中A所示，在细胞中过表达PAS1-30nt-RNA，发现它能够使rRNA的量减少，与lncRNA PAS1全长的作用类似。还进一步测定了过表达PAS1-30nt-RNA之后，细胞内核糖体的量，也是减少的。通过进一步的细胞功能实验，如图7中B、C、D所示，发现PAS1-30nt-RNA能够明显抑制乳腺癌细胞的生长、侵袭和转移。

[0105] 实施例6——动物实验验证lncRNA PAS1能够抑制乳腺癌的生长和转移[0106] 本实施例提供了一种特异性长效RNA——PAS1-30nt-RNA及阴性对照Control RNA，其核苷酸序列分别为：

[0107]

[0108] 上述RNA均由广州锐博公司合成。

[0109] 在NOD-SCID鼠第四对脂肪垫打了MDA-MB-231-Luc-D3H2LN细胞，在两周后能够检测到肿瘤后，根据肿瘤的大小把老鼠进行分成均匀的两组，对两组老鼠分别从尾静脉给药，一组给Control RNA，一组给PAS1-30nt-RNA，每周给两次药，在给药两周后，如图7中E所示，发现PAS1-30nt-RNA能够明显抑制乳腺肿瘤在老鼠体内的生长。同样的，从NOD-SCID鼠尾静脉把MDA-MB-231-Luc-D3H2LN细胞打进去之后，直接把老鼠分成两组，从尾静脉分别给Control RNA和PAS1-30nt-RNA，四周之后，发现PAS1-30nt-RNA能够明显抑制乳腺癌细胞的经血转移到肺。综上，证实PAS1-30nt-RNA能够成为乳腺癌治疗新靶点。