一种紫球藻叶绿体表达系统及其应用

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种紫球藻叶绿体同源重组空载体及其应用。载体包括紫球藻叶绿体基因组上SEQ ID NO:1所示碱基序列的上游同源臂和SEQ ID NO:2所示碱基序列的下游同源臂，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示碱基序列的启动子，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示碱基序列的终止子，启动子和终止子之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列。采用本发明的紫球藻叶绿体同源重组空载体可实现多个外源基因在叶绿体中稳定表达。

权利要求

1.一种紫球藻叶绿体表达系统，其特征在于：表达系统包括上下游同源臂，以及同源臂间设启动子和终止子，启动子和终止子之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列；其中，上游同源臂为SEQ ID NO:1 所示碱基序列，下游同源臂为SEQ ID NO:2所示碱基序列。

2.按权利要求1所述的紫球藻叶绿体表达系统，其特征在于：所述同源臂间插入选择标记基因。

3.按权利要求1或2所述的紫球藻叶绿体表达系统，其特征在于：所述表达系统依次含上游同源臂、至少一个启动子、选择标记基因、与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列、终止子、和下游同源臂。

4.按权利要求3所述的紫球藻叶绿体表达系统，其特征在于：所述启动子为调控外源基因的启动子；或，启动子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的启动子；其中，启动子为SEQ ID NO:3所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:4所示的碱基序列。

5.按权利要求3所述的紫球藻叶绿体表达系统，其特征在于：所述终止子为调控外源基因的终止子；或，终止子为调控外源基因的终止子和调控选择标记基因的终止子；其中，终止子为SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6所示的碱基序列所示的碱基序列。

6.一种权利要求1所述的紫球藻叶绿体表达系统在紫球藻叶绿体转化中的应用。

7.按权利要求6所述的应用，其特征在于：将外源基因导入至所述表达系统再导入紫球藻细胞，经培养筛选获得转基因紫球藻。

说明书

一种紫球藻叶绿体表达系统及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是一种紫球藻叶绿体表达系统及其应用。

背景技术

[0002] 紫球藻属于红藻门、原红藻纲、紫球藻目、紫球藻科、紫球藻属。紫球藻一种比较原始的且是现今为止所发现的唯一的单细胞红藻。紫球藻分布极广，在海水、淡水、潮湿的土壤中都有发现。紫球藻细胞通常呈球形，直径约为 5-24 μm，细胞内含有一个大而呈星状的载色体，含有丰富的藻胆蛋白，其中以藻红蛋白含量最多，因此细胞呈现红色或暗紫色。紫球藻细胞外通常还含有着一层粘质鞘，即紫球藻多糖，细胞间的紫球藻多糖会相互粘连发生不规则的集聚。当在潮湿的土壤及墙壁上时，紫球藻呈现一种浅褐色或红色的薄片，失水时细胞呈皮壳状。紫球藻细胞以二分裂为生殖方式，属于无性生殖。在海水，咸水，淡水及潮湿的土壤中都能生长繁殖。紫球藻具有极强的抗盐性，能在含盐量高达 3.5 4.6%的环境中~正常生长。

[0003] 紫球藻在生长过程中会合成多不饱和脂肪酸，胞外多糖和藻胆蛋白等高附加值代谢产物，其次细胞内还含有其他代谢产物如：叶绿素、RNA、矿物元素和色素(类胡萝卜素、叶黄素)等活性物质，所以紫球藻具有广泛的应用前景以及巨大的市场潜力。紫球藻中油脂含量可占生物量的 9 16%，其中，多不饱和脂肪酸占总脂质的一半以上，其中二十碳五烯酸~(EPA)和花生四烯酸(ARA)含量最多。细胞内的脂肪酸含量和组成成分易受生长环境的影响而发生变化。可以通过控制培养条件，定向的生产某一种具有较高附加值的代谢产物，如ARA和EPA。

[0004] 紫球藻生长会经过延滞期、对数生长期、稳定期以及衰亡期等四个时期，当细胞进入生长稳定期后，能大量的向胞外分泌藻多糖，并形成一层厚厚的粘性鞘膜，其余的多糖则与培养基互溶，使得培养液呈现粘稠状，对紫球藻细胞有保护作用，但是增加了紫球藻收获的难度。另外，藻多糖的胶质状态具有稳定性，可被广泛应用于临床、食品、化妆品等行业中。紫球藻多糖常为硫酸酯多糖，主要由木糖、葡萄糖和半乳糖等单糖组成，具有阻止病毒吸附的作用，因此在治疗肿瘤上具有特殊的功效。另外，紫球藻多糖还具有预防和治疗心血管疾病、降血脂以及治疗肝、胆、胰等疾病的作用，也被广泛运用于保健品行业，因此紫球藻多糖是一种应用面广、功能效果明显的代谢产物。

[0005] 紫球藻的另一个重要产物是藻胆蛋白。藻胆蛋白是一种颜色鲜艳的水溶性色素蛋白，聚集成被称为藻胆体的超分子复合物，这些复合物聚集在叶绿体类囊体薄膜的外表面。藻胆蛋白的颜色主要来源于共价结合的亚基基团，这些基团是带有 A，B，C 和 D 环的开链四吡咯发色团，名为藻胆素。藻胆蛋白存在于原核蓝藻和真核红藻中。在蓝藻和红藻中，产生了四种主要的藻胆蛋白：别藻蓝蛋白(APC，蓝绿色)、藻蓝蛋白(PC，蓝色)、藻红蛋白(PE，紫色)和藻红蓝蛋白(PEC，橙色)。在大多数红藻中，藻红蛋白占藻胆蛋白的 70%以上，而在蓝藻中藻蓝蛋白的含量丰富。藻胆蛋白可用于食品色素和食品添加剂。布丁中含有的食品色素大多是化学品制成的，藻胆蛋白作为天然色素，可以作为布丁的着色剂并广泛用于食品中。分析级藻胆蛋白(纯度≥4.0)被报道具有明显的抗氧化、肝保护、抗炎等生物活性。目前，相关研究报道了以δ-氨基酮戊酸、血红素或胆绿素为前体的藻胆蛋白的不同生物合成途径。

[0006] 目前紫球藻的规模化培养和应用已经开始，但是在生物量和收获方面还有很大的困难。紫球藻代谢机制方面的研究成果很多，紫球藻叶绿体基因组也已经完成，为叶绿体遗传转化提供了数据支持。但缺少遗传转化的工具，包括叶绿体转化的同源插入位点、转化方法、调控序列等，这阻碍了紫球藻的代谢产物开发和应用。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种紫球藻叶绿体表达系统及其应用。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0009] 一种紫球藻叶绿体表达系统，表达系统包括上下游同源臂，以及同源臂间设启动子和终止子，启动子和终止子之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列；其中，上游同源臂含SEQ ID NO:1 所示碱基序列，下游同源臂含SEQ ID NO:2所示碱基序列。

[0010] 所述同源臂间插入选择标记基因。

[0011] 所述上游同源臂与下游同源臂间插入至少一个启动子和终止子。

[0012] 所述表达系统依次含上游同源臂、至少一个启动子、选择标记基因、与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列、终止子、和下游同源臂。

[0013] 所述启动子为调控外源基因的启动子；或，启动子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的启动子；其中，启动子为SEQ ID NO:3所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:4所示的碱基序列。

[0014] 所述终止子为调控外源基因的终止子；或，终止子为调控外源基因的终止子和调控选择标记基因的终止子；其中，终止子为SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6所示的碱基序列所示的碱基序列。

[0015] 所述上游同源臂为SEQ ID NO:1所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:1所示的序列3’端开始，向5’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段；

[0016] 所述下游同源臂为SEQ ID NO:2所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:2所示的序列5’端开始，向3’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段。

[0017] 一种紫球藻叶绿体表达系统在紫球藻叶绿体转化中的应用。

[0018] 具体，将外源基因导入至所述构建的表达系统再导入紫球藻细胞，经培养筛选获得转基因紫球藻。

[0019] 利用基因枪转化法将上述表达系统导入紫球藻，基因枪轰击压力为650psi，轰击距离为9 cm。

[0020] 本发明方法成功构建了紫球藻的叶绿体稳定表达系统。通过本发明能够有效的将多个外源基因重组到紫球藻的叶绿体基因组中，并通过筛选获得转基因藻株。与现有技术相比，本发明实现了紫球藻基因工程技术的重点突破，具有如下有益效果：

[0021] 1、本发明提供利用基因枪法转化紫球藻叶绿体的技术参数。基因枪转化法转化效率高，设备操作简单且结果可复现率高。

[0022] 2、本发明提供紫球藻叶绿体转化的筛选标记基因。除草剂草丁膦作为筛选压力的本底效应低，因耐药性产生的突变株假阳性率低，可以提高实验效率。

[0023] 3、利用本发明所提供的方法及参数，可以稳定实现紫球藻的叶绿体转化，并获得阳性突变株。在此平台基础上，可以促进紫球藻的基础研究进程，如对紫球藻叶绿体中光合作用、集光复合体蛋白尤其是藻蓝、藻红蛋白的结构和功能研究；或者在叶绿体中合成高附加值产物如虾青素等，并能实现大量的积累。

[0024] 4、 本发明提供两段紫球藻叶绿体基因组序列片段用作构建叶绿体同源重组载体，这两个片段在叶绿体基因组上是直接相连的，在切断位点两端为tRNA序列。tRNA在叶绿体基因组上是多拷贝的，其中一个或两个rRNA的功能缺失不会影响整个细胞的功能。因此利用这个位点做同源重组获得的突变株，其细胞任何功能不会收到影响。

[0025] 5、 本发明提供串联多个外源基因构成多顺反子的紫球藻叶绿体核糖体结合位点，这使得利用一个载体导入紫球藻可以获得多个外源蛋白。

[0026] 6、 本发明提供高效的紫球藻内源调控序列。相较于常规的通用型外源调控序列，内源调控序列具有高效无排异等作用，能够促进外源蛋白表达、提高蛋白含量。

[0027] 7、利用本发明获得的紫球藻突变株，可以同时表达功能蛋白基因如脂肪酸、虾青素合成途径的功能蛋白，或者藻胆蛋白等结构蛋白，或者抗菌肽、神经肽等提高生物活性的蛋白，该突变株将具有更高的蛋白含量、脂质含量、高附加值产品以及饵料性能等。

附图说明

[0028] 图1为本发明实施例提供的紫球藻空载体图谱。

[0029] 图2为本发明实施例提供的紫球藻表达载体图谱。

[0030] 图3为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL5000;泳道Wild为野生株；泳道Mutant为转基因藻株）。

[0031] 图4为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL8000;泳道Wild为野生株；泳道Mutants为转基因藻株）。

[0032] 图5为本发明实施例提供的转基因紫球藻Southern杂交图（其中泳道wild为野生株；泳道Mutant为转基因藻株）。

[0033] 图6为本发明实施例提供的转基因紫球藻Western杂交图（其中泳道wild为野生株；泳道Mutant为阳性转基因藻株）。

具体实施方式

[0034] 以下结合附图和实施例对本发明做进一步描述

[0035] 实施例1 紫球藻叶绿体内源性片段的克隆

[0036] 根据已公布的紫球藻叶绿体基因组，设计并合成如下引物：

[0037] SEQ1-for：5’-TATCCGGAATCACTGGGCGTAA-3’

[0038] SEQ1-rev：5’-TTTAAGGAGGTGATCCAGCCGC-3’

[0039] SEQ2-for：5’- AAGGGGATATAGCTCAGTTGG-3’

[0040] SEQ2-rev：5’-GGAGAACCAGCTAGCTCCGGAT-3’

[0041] SEQ3-for：5’-CATCAACTTTATCTAAAGACGA-3’

[0042] SEQ3-rev：5’-AATTTTTTTGTTAAATAAAAGTTTTTTGTG-3’

[0043] SEQ4-for：5’-CTGTATTGTAGTTTTTTTTAATA-3’

[0044] SEQ4-rev：5’-TAATTACTACAATTAGAATTAAACTC-3’

[0045] SEQ5-for：5’-TCAATAATTAATATTTATAGTGTTCA-3’

[0046] SEQ5-rev：5’-CTGCTATTTTACTTATCACTCATTA-3’

[0047] SEQ6-for：5’-GATTTATAAAAAACAAAAAAGCACTTC-3’

[0048] SEQ6-rev：5’-ACTAGGTGTCCCTATTATTGGTATG-3’

[0049] 其中引物SEQ1-for和SEQ1-rev的扩增产物是SEQ ID NO:1；引物SEQ2-for和SEQ2-rev的扩增产物是SEQ ID NO:2；引物SEQ3-for和SEQ3-rev的扩增产物是SEQ ID NO:3；引物SEQ4-for和SEQ4-rev的扩增产物是SEQ ID NO:4；引物SEQ5-for和SEQ5-rev的扩增产物是SEQ ID NO:5；引物SEQ6-for和SEQ6-rev的扩增产物是SEQ ID NO:6。

[0050] 以紫球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ1-for和SEQ1-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，57℃ 30sec，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是紫球藻叶绿体基因组16S rDNA，为992bp，即为片段SEQ ID NO: 1。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。

[0051] 以紫球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ2-for和SEQ2-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，55℃ 30 sec，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是紫球藻叶绿体基因组trnA-23S rDNA，为927bp，即为片段SEQ ID NO: 2。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:2的重组质粒pMD- SEQ2。

[0052] 以紫球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ3-for和SEQ3-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，45℃ 30 sec，72℃ 40 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是紫球藻叶绿体基因组psbA启动子，为583bp，即为片段SEQ ID NO: 3。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO: 3的重组质粒pMD-SEQ3。

[0053] 以紫球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ4-for和SEQ4-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，42℃ 20 sec， 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是紫球藻叶绿体基因组psbB启动子，为205 bp，即为片段SEQ ID NO: 4。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。

[0054] 以紫球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ5-for和SEQ5-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，42℃ 30 sec，72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是紫球藻叶绿体基因组atpA终止子，为226 bp，即为片段SEQ ID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:5的重组质粒pMD-SEQ5。

[0055] 以紫球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ6-for和SEQ6-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min， 42℃ 30 sec， 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是紫球藻叶绿体基因组psbA终止子，为195 bp，即为片段SEQ ID NO: 6。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:5的重组质粒pMD-SEQ6。

[0056] 实施例2：紫球藻叶绿体表达系统的构建

[0057] 设计并合成如下引物:

[0058] bar-for: 5’-ATGAGCCCAGAACGACGCC-3’

[0059] bar-rev: 5’-TCATCAAATCTCGGTGACGGG-3’

[0060] 以载体pSVB为模版，经引物bar-for和bar-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min， 54℃ 30 sec，72℃ 40 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为555 bp，即为除草剂抗性基因bar。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。

[0061] 以上述产物为基础，pMD18T为出发载体通过同源重组方法构建紫球藻叶绿体同源重组载体。其中pMD-SEQ2、pMD-SEQ3、pMD-SEQ5、pMD-SEQ6需要先利用PCR在序列5’端或3’端添加接头和酶切位点，SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、bar无须添加接头或酶切位点。

[0062] 设计并合成如下引物:

[0063] L1-for：5’-GGCTGGATCACCTCCTTAAACATCAACTTTATCTAAAGACGA-3’[0064] L1-rev：5’-GGCGTCGTTCTGGGCTCATGAATTTTTTTGTTAAATAAAAGTTTTTTGTG -3’[0065] L2-for：5’- CCCGTCACCGAGATTTGATGATCAATAATTAATATTTATAGTGTTCA -3’[0066] L2-rev：5’- TATTAAAAAAAACTACAATACAGTCAATAATTAATATTTATAGTGTTCA -3’[0067] L3-for：5’- CGAGCTCGATTTATAAAAAACAAAAAAGCACTTC -3’

[0068] L3-rev：5’- CCAACTGAGCTATATCCCCTTACTAGGTGTCCCTATTATTGGTAT-3’[0069] L4-for：5’- AAGGGGATATAGCTCAGTTGG-3’ (SEQ2-for)

[0070] L4-rev：5’-GGAATCCGGAGAACCAGCTAGCTCCGGAT -3’

[0071] 以pMD-SEQ3为模版，经引物L1-for及L1-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，45℃ 30 sec， 72℃ 40 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为600 bp，即为两端含接头的SEQ ID NO: 3。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 3-1备用。

[0072] 以pMD-SEQ5为模版，经引物L2-for及L2-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min， 42℃ 30 sec， 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为240 bp，即为两端含接头的SEQ ID NO: 6。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 6-1备用。

[0073] 以pMD-SEQ6为模版，经引物L3-for及L3-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min， 42℃ 30 sec，72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为200 bp，即为5’端含SacI酶切位点，3’端含接头的SEQ ID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 5-1备用。

[0074] 以pMD-SEQ2为模板，经引物L4-for及L4-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min， 55℃ 30 sec， 72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为930bp，即为3’端含EcoRI酶切位点的SEQ ID NO: 2。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 2-1备用。

[0075] 将相同浓度（20-100ng/mL）的SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3-1、bar基因片段、SEQ ID NO: 5-1和SEQ ID NO: 4混合为模板，利用融合PCR试剂盒依次连接并通过TA克隆方法插入pMD18T载体上，命名为pMD18T-1。

[0076] 将相同浓度（20-100ng/mL）的SEQ ID NO: 2-1、SEQ ID NO: 6-1混合为模板，利用融合PCR试剂盒连接，命名为fragment-2. fragment-2和pMD18T-1经过SacI和EcoRI两个酶酶切后，利用T4连接酶连接，构成紫球藻叶绿体表达系统载体，命名为pPs/ch/bar。载体结构见附图1。

[0077] 1个外源基因或两个以上外源基因通过SEQ ID NO: 7连接后可以通过酶切连接的方式插入pPs/ch/bar载体，从而构建紫球藻叶绿体表达载体，导入等紫球藻后可实现外源基因在叶绿体中的表达。外源基因可以是功能蛋白基因如催化各种酶促反应的蛋白基因、光合作用相关蛋白基因，结构性蛋白如细胞膜蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等等，以及营养型蛋白如神经肽、抗菌肽基因等。

[0078] 下面将具有抗菌活性的两个抗菌肽基因（GenBank No.6K50_A；GenBank No. AKA60777.2）插入该载体而后导入紫球藻中, 通过检测这两个外源基因的表达来检测该载体的性能。

[0079] 实施例3 按照上述实施例获得的载体在紫球藻叶绿体转化中的应用[0080] 1．紫球藻叶绿体表达载体的构建

[0081] 设计并合成如下引物：

[0082] F1-for: 5’-CCTCTAGAATGCATCATCACCATCACCATGGTTTCGGTTGCAACGGTCCCTGG-3’[0083] F1-rev: 5’-TTAGTAGCACTTGCAGACGAAAATAAATTATCCTTATGAAATGGTGATGGTGATGGTGCAT-3’

[0084] F2-for: 5’-ATGCACCATCACCATCACCATTTCTTCTTCCACATCATCAAGGG-3’[0085] F2-rev: 5’-GGGATCCTTACTTCCAGACGAGACCGTGGAT-3’

[0086] 其中，F1-for携带XbaI酶切位点和6×His标签，F1-rev的下划线序列片段为SEQ ID NO:7，F2-for中的下划线序列为6×His标签，F2-rev携带BamHI酶切位点。

[0087] 以人工合成的抗菌肽基因1为模板，经引物F1-for及F1-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5 min预变性;94℃ 1 min, 55℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为220 bp，即为5’端含XbaI酶切位点的抗菌肽序列。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为F1。

[0088] 以人工合成的抗菌肽基因2为模板，经引物F2-for及F2-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5 min预变性;94℃ 1 min, 52℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为240 bp，即为3’端含BamHI酶切位点的抗菌肽序列。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为F2。

[0089] 将相同浓度（20-100ng/mL）的F1和F2混合，利用融合PCR试剂盒连接，而后通过XbaI和BamHI酶切连接的方式，将融合片段连接到空载体pTl/ch/bar上。获得的载体经测序验证序列准确，命名为pPs/ch/bar-anti2其载体结构如附图2所示。

[0090] 2. 紫球藻的转化

[0091] 在转化前1h，取对数生长期的紫球藻藻液，离心力8000 g离心5min，弃上清，用培8 -1
养液调整浓度到1×10cell ml 。然后取0. 2m1藻液涂在固体培养平板的中央，呈直径约
2cm的圆形。涂好的平板置于超净工作台中备用。

[0092] 微粒子弹的制备:取50 ul金粉悬浮液(约含3mg金粉)边涡旋边加入5uL质粒pTl/ch/bar-anti2 (质粒浓度>=1ug ul-1) , 50ul 2.5M CaCl2, 20ul 0.1M亚精胺。然后继续涡旋3min。离心5 6 sec，弃上清。然后用250 μL无水乙醇洗两次，最后用60 μL无水乙醇重~悬。这样一管包被了质粒的微粒子弹可用于5 6次轰击。
~

[0093] 在无菌条件下(超净工作台中)，用高压氦气式基因枪进行轰击。轰击参数压力为450psi，轰击距离为6 cm。

[0094] 轰击后，藻细胞先在固体培养平板上黑暗条件下培养8h，然后再转到培养液中继续培养40 h，使细胞生长状态得以恢复。

[0095] 3. 转化后紫球藻的筛选和鉴定

[0096] 经过恢复培养的紫球藻细胞，转到选择性培养液中，以杀死未转化的藻细胞。选择性培养液即为含有15ug ml-1草丁膦的f/2培养液。15d后将培养液以7000g离心5min，弃上清。收集到的藻体涂布到含有10 ug ml-1草丁膦固体培养平板上，使抗性的藻细胞分散生长，得到抗性单藻落。约培养20d后，平板上长出单藻落。再将单藻落挑出，并划线到含有5 ug ml-1草丁嶙的固体培养平板上，使抗性藻落进一步纯化并增强抗性。20d后，挑取单藻落至培养液中继续培养约20d，6000g离心5min，收集藻体，每个藻体湿重>= 100mg，然后置于液氮中冷冻备用。

[0097] 提取转基因紫球藻的基因组总DNA，用以进行分子鉴定。首先用PCR方法来鉴定质粒的整合情况。PCR中使用的上游引物为bar for，下游引物为bar rev，产物为bar基因，反应程序如前所述。在一部分抗性紫球藻基因组中扩增到了这个片段，在未转化的紫球藻中均未发现该片段，参见附图3。

[0098] 然后在SEQ ID NO:1 5’端上游和SEQ ID NO:2 3’端下游分别设计并合成引物，引物序列如下:

[0099] con-F for: 5’- AGCATCGGCTAACTCCGTGC-3’

[0100] con-F rev: 5’- TAACCGCTGCGCCTCAACGC-3’

[0101] 这对引物con-F for和con-F rev在野生型紫球藻基因组总DNA中扩增到包括同源臂的片段，长度约为2000 bp；在实现同质化的转基因紫球藻基因组总DNA中，扩增到同源臂及全部基因表达框的片段，长度约为4200 bp。

[0102] 以阳性转基因藻的全基因组DNA为模板，以引物con-F for和con-F rev进行PCR扩增。PCR反应程序为: 94℃ 1min, 55℃ 30 sec, 72℃ 50 sec，共30个循环；72℃ 5min延伸。PCR产物经电泳分离有两条带 (参见附图4)。经测序，其中长的条带序列与载体序列一致，说明外源基因已插入紫球藻叶绿体基因组中，但未实现同质化。

[0103] PCR有阳性结果的转基因紫球藻样品，要继续进行Southern杂交鉴定。以bar、抗菌肽1、抗菌肽2基因PCR产物为模板制备地高辛标记的探针，每个样品的基因组总DNA不少于4ug。利用罗氏的地高辛标记Southern杂交试剂盒进行杂交等过程，结果如附图5所示。这表明在阳性突变株中，外源片段已经稳定插入叶绿体基因组。

[0104] Southern杂交有阳性结果的转基因紫球藻样品，要继续进行western杂交鉴定。Western杂交使用小鼠抗His IgG和羊抗鼠IgG与辣根过氧化物酶(HRP)结合的方法对表达蛋白进行鉴定。杂交结果显示，杂交后出现了一条约28 kDa的条带和16 kDa的条带，与外源基因蛋白大小一致，而未转化的藻株的基因组中没有这个条带(参见图6)，这表明在阳性藻株中，外源蛋白已经表达。

[0105] 上述实施例表明利用本发明的载体成功实验了两个抗菌肽基因在紫球藻叶绿体中实现共表达，证明了本发明载体调控外源基因在紫球藻叶绿体中表达外源基因的能力，可以实现各种蛋白基因的表达，包含功能蛋白基因如催化各种酶促反应的蛋白基因、光合作用相关蛋白基因，结构性蛋白如细胞膜蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等等，以及营养型蛋白如神经肽、抗菌肽基因等。

[0106] 序列表

[0107] SEQ ID NO:1

[0108] 5’-TATCCGGAATCACTGGGCGTAAAGCGTCTGTAGGTTGTTCAGTAAGTCTAATGTTAAAGACTAGGGCTCAACCCTGGAAAAGCATTAGAAACTACTAGACTAGAGTATGGTAGAGGTAGAGGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTACTGGGCCATAACTGACACTGAGAGACGAAAGCTAAGGGAGCGAATAGGATTAGATACCCTAGTAGTCTTAGCTGTAAACGATGGATACTAGATGTTGCGTGTTTTTTCATGCAGTGTCGTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTATGCTCGCAAGGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTTGATGCAACGCGGAGAACCTTACCAGAACTTGACATATCATGAATCTTTATTAATGTAAAGAGTGTCTTCGGAAACATGAATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGGACTCTAAAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTTCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTAGAACAAAGAGTTGCAAACTTGTGAAAGTAAGCTAATCTCATAAATCTAGCCTCAGTTCAGATTGTAGGCTGAAACTCGCCTACATGAAGGTGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCTACACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGCTGGCTATGCCCAAAGTCGTTACTCTAACCGTAAGGAGGGGGGCGCCTAAGGCAGAGCTAGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACTGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTAAA-3’

[0109] （a）序列特征：16S rDNA

[0110] ●长度：992 bp

[0111] ●类型： 碱基序列

[0112] ●链型：单链

[0113] ●拓扑结构：线性

[0114] （b）分子类型：DNA

[0115] （c）假设：否

[0116] （d）反义：否

[0117] （e）最初来源：紫球藻叶绿体基因组

[0118] SEQ ID NO:2

[0119] 5‘-AAGGGGATATAGCTCAGTTGGTAGAGCGTTGCCTTTGCAAGGCAAATGTCAGCGGTTCGAATCCGCTTATCTCCAAAAACAAAACAAAGTTATTTCAAGTGAATAAGAGCTTATGGTGGATACCTTGGTATTTAGAAGCGATGAAGGGCGTGACTACCGACGAAACGCTACGGGGAGTTGGAAGTAAGCATTAATCCGTAGGTACCCGAATGAGGAAACTCCTAGAACTTTTTTCTGAATTAATAGGAAAAAAAGAGCAAACCTAGCGAACTGAAACATCTTAGTAGCTAGAGGAAAAGAAAGCAAAAGCGATTCCCTTAGTAGTGGCGAACGAAACGGGAACAGCCTAAACTAAGTATTTTTACTTAGGGTTGTGGGACAACATATATGTATCTTAATAGCTAAGCGAATTAGTTGGAATACTAAACAAAAAAGAGTGAAAGTCTCGTAGCTGAAAGCTAGATGGAACTAGTTGTATCCCGAGTAGTATGGGACACGTGAAACCCCGTATGAATCAGCGAGGACCACCTCGTAAGGCTAAATATTCCTAGATAACCGATAGTGAAACAGTACCGTGAGGGAAAGGTGAAAAGAACCCCGGGAGGGGAGTGAAATAGAACATGAAACCATAAGCTTACAAGCAGTGGAAGGACGACTAATCGTCTAACCTCGTGCCTGTTGAAGAATGAGCCGGCGACTTATAGGTAGTGGCAGGTTAAAACAAACTAGTTGGAGCCACAGCGAAAGCGAGTCTGATAAGGGCGCTAGTCACTATTTATAGACCCGAACCCGGATGATCTAGTCATGGCCAGGATGAAGCTTAGGTAACACTGAGTGGAGGTCCGAACCGACTGATGTTGAAAAATCAGCGGATGAGCTGTGATTAGGGGTGAAATGCCAATCGAATCCGGAGCTAGCTGGTTCTCC-3’

[0120] （a）序列特征：trnA-23S rDNA

[0121] ●长度：927 bp

[0122] ●类型： 碱基序列

[0123] ●链型：单链

[0124] ●拓扑结构：线性

[0125] （b）分子类型：DNA

[0126] （c）假设：否

[0127] （d）反义：否

[0128] （e）最初来源：紫球藻叶绿体基因组

[0129] SEQ ID NO:3

[0130] 5‘-CATCAACTTTATCTAAAGACGAAGTTGATAGCATGGTAAATACTGCACAACAATATGAAGCAGAAGATAAAATAAAAAGAGAGCAAATTGATATTAAAAATCAAGCAGATTCTTTATGTTACCAATCTGAAAAACAATTAAAAGAATTAAGTGATAAAATTACTGAAGATGATAAAAATAAATTAGAATCTCTAATTAAACAACTTAGAGATAGTGTAAAAGAAGAGAATTTTGATTCAATGAAGGCTCTAAGTAAAGAATTAGAACAAGAATTAATGGCTATTGGACAAAAAATTTATAGTCAAAAAAATGAATCTAATAGTCCTAATTCTAATCCTTCAGAAAATGATAATGTTATTGATACAGAAGGAAATTAAAAAACCATTAAGATTACAAGTTGACTTGTAATCTTAATGGTTTTTTTAATAATAATTTATAAACTCACTTCAAATAACTTACTGAGATAATGAAACAATAAAGCTTTGCATAAAAGATATGAAAAAAGTGATAATATAGATAACAAGTTATTTAGATAGCTTGGGAAGTTTCAATACACAAAAAACTTTTATTTAACAAAAAAATT-3’[0131] （a）序列特征：psbA启动子

[0132] ●长度：583 bp

[0133] ●类型： 碱基序列

[0134] ●链型：单链

[0135] ●拓扑结构：线性

[0136] （b）分子类型：DNA

[0137] （c）假设：否

[0138] （d）反义：否

[0139] （e）最初来源：紫球藻叶绿体基因组

[0140] SEQ ID NO:4

[0141] 5‘-CTGTATTGTAGTTTTTTTTAATATAATTTTCCTAATTTTAACAAATAACTAATTTGTAAAATATTAATTAATCTATTGAAATATTATTAAGATTGTTATTTTCAAAGACTTTCTGTGTCTTTTGTATCTGTATTTTATTATATTAAGATCTATAGTTATTTTAAGAATAAACAAGAGAAGAGTTTAATTCTAATTGTAGTAATTA-3’[0142] （a）序列特征：psbB启动子

[0143] ●长度：205 bp

[0144] ●类型： 碱基序列

[0145] ●链型：单链

[0146] ●拓扑结构：线性

[0147] （b）分子类型：DNA

[0148] （c）假设：否

[0149] （d）反义：否

[0150] （e）最初来源：紫球藻叶绿体基因组

[0151] SEQ ID NO:5

[0152] 5‘-TCAATAATTAATATTTATAGTGTTCAGAGTAATTAATAAATAATAGCTCTGAACACTCAATTATATAATCAATTAGATATTAATAAATCATAACCATTCTTCTCTAATTCTAAAGCTAAAGAGTAATCTCCTGTTTTTATTATTTTTCCTTCACTCATTATATGTATGTAATCTGGTTTTACATAGTCTAGCAGCCTTTGGTAATGAGTGATAAGTAAAATAGCAG-3’

[0153] （a）序列特征：atpA终止子

[0154] ●长度：226 bp

[0155] ●类型： 碱基序列

[0156] ●链型：单链

[0157] ●拓扑结构：线性

[0158] （b）分子类型：DNA

[0159] （c）假设：否

[0160] （d）反义：否

[0161] （e）最初来源：紫球藻叶绿体基因组

[0162] SEQ ID NO:6

[0163] 5‘-GATTTATAAAAAACAAAAAAGCACTTCGTACGAAGTGCTTTTTTGTTTTTTATATTGGGAGTTCAAGACATTCCTTGAATTATATAATCGTAATAAGGAGCTACAAAGTCCTCTTCCTCCTGAGATATAACTTCTACAGTTGCCTCTTTTAAGCATTTGATTGCGTCAATCATACCAATAATAGGGACACCTAGT-3’

[0164] （a）序列特征：psbA终止子

[0165] ●长度：195 bp

[0166] ●类型： 碱基序列

[0167] ●链型：单链

[0168] ●拓扑结构：线性

[0169] （b）分子类型：DNA

[0170] （c）假设：否

[0171] （d）反义：否

[0172] （e）最初来源：紫球藻叶绿体基因组

[0173] SEQ ID NO:7

[0174] 5‘-ATAAGGATAATTTATT-3’

[0175] （a）序列特征：rbs，核糖体结合位点

[0176] ●长度：16 bp

[0177] ●类型： 碱基序列

[0178] ●链型：单链

[0179] ●拓扑结构：线性

[0180] （b）分子类型：DNA

[0181] （c）假设：否

[0182] （d）反义：否

[0183] （e）最初来源：紫球藻叶绿体基因组。