一种丹顶鹤SNP标记及其筛选方法和应用

摘要

本发明公开了一种丹顶鹤SNP标记及其筛选方法和应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过采集10个丹顶鹤的血液样品，提取基因组DNA，利用GBS‑seq方法对所述基因组DNA进行GBS文库构建及测序，采用SAMTOOLS软件进行群体SNP的检测，挑取72个适合设计引物的SNP，根据所述SNP序列设计出相应的引物对，采集另外30个丹顶鹤的基因组DNA并应用上述的引物对进行PCR扩增和测序，最后筛选获得33个高质量的公共SNP位点。作为丹顶鹤的分子标记的33个SNP位点，可以在辅助繁殖，遗传多样性研究，基于SNP的关联分析，以及用于资源鉴定与分类等方面进行应用，对丹顶鹤种群管理具有重要应用价值。

权利要求

1.丹顶鹤33个公共SNP位点，其特征在于，如下所示：

2.权利要求1所述的丹顶鹤33个公共SNP位点在丹顶鹤分子标记辅助繁殖或遗传多样性研究中的应用。

说明书

一种丹顶鹤SNP标记及其筛选方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，更具体地说，涉及一种丹顶鹤SNP标记及其筛选方法和应用。

背景技术

[0002] 丹顶鹤(Grus japonensis)又名红冠鹤，属鹤形目(Gruiformes)、鹤属(Grus)，因头顶裸露呈红色而得名。主要分布于俄罗斯远东、中国东北、蒙古、朝鲜半岛以及日本北海道等地，栖息于内陆湿地和沿海滩涂等地区。丹顶鹤在东亚地区常被认为是幸福、吉祥、长寿和忠贞的象征，深受人民的喜爱。丹顶鹤需要洁净而开阔的湿地环境作为栖息地，是对湿地环境变化最为敏感的指示生物。丹顶鹤是我国的一级保护动物，在IUCN红色名录中被评为濒危物种。为了维护丹顶鹤的种群数量，我国在盐城、扎龙等地建立丹顶鹤保护区。受栖息地气候环境变化、水土污染及人类活动影响，丹顶鹤面临生境丧失及破碎化的威胁，其野生种群数量仍在下降。

[0003] 遗传多样性是进化生物学的核心概念与生物复杂性、生态系统恢复以及物种对环境变化的反应能力相关，是物种适应外界不良环境的潜在能力和长期发展的基础和重要指标。特别是在那些珍稀濒危物种的遗传多样性研究中，掌握其目前的遗传变异水平和遗传结构，避免因种群规模过小或者过于分散而导致的近交衰退或不能正常繁育等问题，根据现状划分不同的管理单元，根据实际情况采取相应的保护和管理措施，对濒危野生动物的保护具有重要的意义。

[0004] 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，因其位点丰富、分布广泛、检测便捷快速而被当作分子标记的一种手段，广泛用于遗传分析等方面。GBS(Genotyping-by-sequencing)是指利用限制性内切酶打断基因组DNA，对特定片段进行高通量测序获得目标物种大量遗传多态性标签序列的测序方法，也是常用SNP筛选方式。在筛选SNP的过程中，首先选取合适的限制性内切酶，结合高通量群体测序进行基因分型，构建SNP分子标记。随后，利用发掘的变异位点设计特异性的引物来对基因组DNA进行PCR扩增，得到基于SNP位点的特定的多态性产物。最后，利用测序和溶解曲线等方法分析产物的多态性。SNP标记遗传稳定性高、具有代表性并且其等位基因频率容易估计，把SNP作为丹顶鹤遗传研究标记的方式，可以加强人们对于丹顶鹤的遗传结构的了解，从而更好地对丹顶鹤种群进行管理。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种丹顶鹤SNP标记的筛选方法。本发明所要解决的另一技术问题在于提供根据上述丹顶鹤SNP标记的筛选方法获得的丹顶鹤SNP标记。本发明最后要解决的问题是提供所述丹顶鹤SNP标记的应用。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

[0007] 一种丹顶鹤SNP标记的筛选方法，具体步骤如下：

[0008] 1)采集多个丹顶鹤的血液样品，提取基因组DNA；

[0009] 2)应用限制性内切酶对步骤1)获得的基因组DNA进行酶切，再加上接头，然后对每个样品进行扩增，随后对样品进行混合，选择片段进行文库构建；利用Illumina HiSeq测序平台，进行双末端测序，对测序获得的原始数据进行数据统计及质量检测，获得待分析序列。

[0010] 3)采用软件SAMTOOLS对步骤2)获得的待分析序列进行群体SNP的检测，获取SNP序列，再通过比对获取公共SNP序列，根据所获SNP位点设计出相应的引物对，然后使用所设计的引物对对另外采集和提取到的多个丹顶鹤的DNA进行PCR扩增和测序，根据测序结果挑选出33个公共SNP位点的序列，所述33个公共SNP位点的引物对如下所示：

[0011]

[0012] 。

[0013] 优选地，步骤1)中所述丹顶鹤的血液样品数量为10，步骤3)中所述另外采集到的丹顶鹤DNA的样本数为30。

[0014] 优选地，步骤3)中引物设计主要参数为：引物长度18-20bp；单个引物少于3个核苷酸的互补；保证同对引物间的Tm值的差不大于2℃；两个引物之间少于连续3个核苷酸的配对。

[0015] 优选地，步骤3)中所述PCR扩增的体系为25μL：12.5μL 2×Taq Master Mix Plus(Dye Plus)，10.5μL ddH2O，上下游引物各1μL，DNA为1μL；所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，50℃-65℃退火15s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃再延伸5min。

[0016] 所述的丹顶鹤33个公共SNP位点，如下所示：

[0017]

[0018]

[0019] 所述的丹顶鹤33个公共SNP位点在丹顶鹤分子标记辅助繁殖或遗传多样性研究中的应用。

[0020] 有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

[0021] (1)本发明提供的丹顶鹤SNP标记的筛选方法，通过采集10个丹顶鹤的血液样品，提取基因组DNA，利用GBS-seq方法对所述基因组DNA构建GBS文库并测序，采用软件SAMTOOLS进行群体SNP的检测，挑选出72个SNP序列，根据所述SNP序列设计出相应的引物对，再采集另外30个丹顶鹤的基因组DNA并应用上述的引物对进行PCR扩增和sanger测序，最后筛选获得33个高质量的公共SNP位点。

[0022] (2)本发明开发丹顶鹤的33个SNP位点，可以在辅助繁殖，遗传多样性研究，基于SNP的关联分析，以及资源鉴定与分类等方面进行应用，对丹顶鹤种群管理具有重要应用价值。

附图说明

[0023] 图1为3个SNP延伸反应后的检测峰图。

具体实施方式

[0024] 下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

[0025] 本发明使用DNAiso Reagent提取试剂提取丹顶鹤血液DNA。

[0026] 本发明采用GBS-seq方法，使用Illumina HiSeq PE150平台进行测序。

[0027] 实施例1：

[0028] 一种丹顶鹤SNP筛选及遗传多态性评估的方法，包括如下步骤：

[0029] 步骤一、丹顶鹤DNA的提取：

[0030] 采集南京市红山森林动物园10只丹顶鹤血液样品，将样品保存在含有抗凝血剂的灭菌试管中并保存于-80℃。血液样本的DNA提取采用DNAiso Reagent提取试剂，具体步骤如下：

[0031] (1)将1μL血液样品放入匀浆器中，加入1mL DNAiso Reagent。使用匀浆器反复匀浆，直至没有明显块状组织沉淀。将裂解液转移至离心管中。

[0032] (2)裂解液经10，000g 4℃离心10分钟，将上清液转移至新的离心管中。

[0033] (3)向上述裂解液中加入0.5mL的无水乙醇。反复颠倒混匀1分钟，使用枪头将DNA缠绕出来转移至新的离心管中，或者将上清液轻轻倒出，将DNA沉淀留在离心管底部。

[0034] (4)缓慢地沿离心管壁加入1mL 75％的乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇。

[0035] (5)将除去乙醇后的基因组DNA沉淀在室温下干燥10秒，缓慢加入适量的TE Buffer(pH8.0)。将DNA保存在-20℃的冰箱备用。

[0036] 步骤二、GBS-seq基因组DNA测序及丹顶鹤SNP位点筛选：

[0037] 将基因组DNA用限制性内切酶进行酶切，以得到适合的标记密度，酶切后的片段两端加P1和P2接头(可与酶切DNA缺口互补)，PCR扩增两端分别含有P1和P2接头的标记序列，形成DNA片段混合池，电泳回收需要区间的DNA，建立DNA文库，文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至lng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，插入片段符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求混合池后进行Illumina HiSeq PE150测序。测序得到的原始图像数据经碱基识别分析转化为序列数据(raw reads)，过滤掉含有接头序列的测序序列；去除单端测序序列中N的含量超过该条序列长度比例的10％时和含有的低质量(＜＝5)碱基数超过该条序列长度比例的50％时的成对序列；经过对测序数据的严格过滤，得到高质量的待分析序列，对样品中阐述数据进行统计，结果显示测序质量高(Q20≥94.67％、Q30≥86.28％)，GC分布正常，样本都没有被污染，建库测序成功。统计分析序列两端为MseI捕获的序列数、捕获的序列数占分析序列数的比率，即酶捕获率，以评估酶切效率；有效的高质量测序数据通过BWA软件(参数：mem-t 4-k 32-M)比对到参考基因组，比对结果经SAMTOOLS进行排序，结果显示，数据与参考基因组的相似度达到重测序分析的要求，同时又有不错的覆盖深度和覆盖度。以上实验操作，由北京诺禾致源生物科技有限公司完成。

[0038] 采用SAMTOOLS软件进行群体SNP的检测。为了确保样本SNP的可信性，对样本检测的SNP的序列支持数，质量值(QUAL)和相邻SNP的距离统计累积分布。经过滤后，获得10只丹顶鹤的适合设计引物的72个高质量公共SNP位点用于后续分析。根据72个SNP位点使用Primer Premier 5设计出72对引物，引物设计主要参数为：引物长度18-20bp；单个引物少于3个核苷酸的互补；保证同对引物间的Tm值的差不大于2℃；两个引物之间少于连续3个核苷酸的配对。使用引物对从盐城的30只丹顶鹤血液中提取的DNA进行PCR扩增。其PCR扩增体系为25μL：12.5μL 2×Taq Master Mix Plus(Dye Plus)，10.5μL ddH2O，上下游引物各1μL，DNA为1μL；所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，50℃-65℃退火15s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃再延伸5min。取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶(1％浓度)电泳，结果显示所提DNA质量为优质。将DNA进行Sanger测序。最终挑选出33个公共SNP位点，其引物及位点信息如表1所示。Sanger测序，由南京擎科生物科技有限公司完成。

[0039] 步骤三、种质资源遗传多态性评估：

[0040] 利用Cervus V3.0.7计算SNP分型结果的遗传多态性，期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、结果显示期望杂合度的范围为0.066-0.508，平均值为0.329，多态信息含量范围为0.062-0.375，平均值为0.261：使用Genepop V4哈迪温伯格平衡(HWE)，结果显示HWE的P值范围为0.012-1.000，平均值为0.687，仅有GjSNP14和GjSNP22两个位点偏离HWE，详细信息见表1，说明该组位点能够应用于丹顶鹤遗传资源多态性的评估。

[0041] 表1 SNP位点、引物及其遗传多样性分析

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