检测细菌在丹参定殖能力的方法

摘要

本发明涉及一种检测细菌在丹参中定殖能力的方法，包括如下步骤：1)将待检测细菌接种于灭菌处理后的丹参幼苗中培养以使所接种的细菌定殖；2)将定殖好的丹参幼苗分别经过如下步骤处理并分组：W)无菌水冲洗；SD)灭菌的盐溶液洗涤10min～30min后再用无菌水冲洗；B)依次用灭菌的盐溶液洗涤、用次氯酸钠洗涤、用Na2S2O3溶液冲洗；3)扩增各分组中定殖好的所述待检测细菌的特征性核酸片段，并将扩增结果进行染色，根据W、SD和B组是否出现目标条带以确定所述待检测细菌的定殖能力，在B组出现目标条带定值能力最强，SD组次之，W组最次。该方法能够更加客观评价细菌定殖能力。

权利要求

1.一种检测细菌在丹参中定殖能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将待检测细菌接种于灭菌处理后的丹参幼苗中培养以使所接种的细菌定殖；所述待检测菌种为Sp7和Sp245的Azospirillum菌；

2）将定殖好的丹参幼苗分别经过如下步骤处理并分组：W）无菌水冲洗；

SD）灭菌的盐溶液洗涤10 min 30 min后再用无菌水冲洗；

~

B）依次用灭菌的盐溶液洗涤10 min 30 min、用3% 7% (g/100ml) 次氯酸钠洗涤~ ~

1.5min~2.5min、用Na2S2O3溶液冲洗；

其中，所述盐溶液包括以下组分：

127mM~147mM NaCl，1.7mM~3.7mM KCl，5mM~15mM Na2HPO4，1.3mM ~2.3mM KH2PO4，0.3mM~0.7mM MgSO4，0.7mM~1.3mM CaCl2，0.07%~0.13%（v/v）Triton‑X100，且所述盐溶液pH=7.0~

7.8；

3）扩增各分组中定殖好的所述待检测细菌的特征性核酸片段，并将扩增结果进行染色，根据W、SD和B组是否出现目标条带以确定所述待检测细菌的定殖能力，在B组出现目标条带定殖能力最强，SD组次之，W组最次；

所述细菌的特征性核酸片段为细菌的16S rDNA中的片段；

所述细菌的特征性核酸片段扩增所用上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:1和2所示。

2.根据权利要求1所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述方法还包括扩增丹参内源性表达稳定的基因作为内参基因的步骤。

3.根据权利要求2所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述丹参内源性表达稳定的基因为LEAFY基因。

4. 根据权利要求3所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，扩增所述LEAFY基因所用上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:3和4所示。

5.根据权利要求1 4任一项所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述~灭菌处理后的丹参幼苗的制备方法包括：

将丹参种子培养发芽10 15天后得到所述丹参幼苗。

~

6.根据权利要求5所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述丹参种子经过灭菌清洗处理，所述灭菌清洗处理选自下列处理：

70% 85%的乙醇水溶液清洗、40% 60% (g/100ml)次氯酸钠清洗以及无菌水清洗。

~ ~

7.根据权利要求5所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述丹参种子在培养发芽之前还经过低温春化处理：于1/2 MS固体培养基中，0°C 8°C避光培养2 4天。

~ ~

8. 根据权利要求7所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述培养发芽5 10天的培养条件为：光照培养12h 16h，温度23°C  27°C，黑暗培养8h 12h，温度20°C ~ ~ ~ ~ ~

24°C。

说明书

检测细菌在丹参定殖能力的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物‑植物互作研究领域，具体而言，涉及一种检测细菌在丹参定殖能力的方法。

背景技术

[0002] 现有科学研究和市面上出售的菌剂，都能在一定程度上影响植物的生长、发育以及代谢活动，尤其是植物促生菌(plant growth‑promoting rhizobacteria,PGPR)能够促进植物生长、防治病害、增加作物产量等作用。细菌在植物根系的成功定殖，在细菌与植物互作关系中起着极其重要的作用。由于实验室条件下很多促生效果显著的微生物，应用到大田却不能发挥较好的作用效果，其中定殖能力的强弱便是影响微生物发挥作用的关键。因此，接种有益菌能否成功定殖寄主植物根围或叶围，并且具备定殖能力强、定殖数量多等特点，是决定生防菌的直接作用效果、施用剂量以及应用转化等关键因素。

[0003] 目前，最常用的细菌定殖检测方法包括显微镜检查和菌落计数，但都比较耗时费力且受人为操作影响较大。分子生物学能够进一步揭示细菌根部定殖的特殊规律，且检测结果较为准确，而现有的分子标记、荧光标记、特殊引物等研究生防细菌定殖丹参能力的检测方法相对较少。

发明内容

[0004] 本发明涉及一种检测细菌在丹参中定殖能力的方法，包括如下步骤：

[0005] 1)将待检测细菌接种于灭菌处理后的丹参幼苗中培养以使所接种的细菌定殖；

[0006] 2)将定殖好的丹参幼苗分别经过如下步骤处理并分组：

[0007] W)无菌水冲洗；

[0008] SD)灭菌的盐溶液洗涤10min～30min后再用无菌水冲洗；

[0009] B)依次用灭菌的盐溶液洗涤10min～30min、用3％～7％(g/100ml)次氯酸钠洗涤1.5min～2.5min、用Na2S2O3溶液冲洗；

[0010] 其中，所述盐溶液包括以下组分：

[0011] 127mM～147mM NaCl，1.7mM～3.7mM KCl，5mM～15mM Na2HPO4，1.3mM～2.3mM KH2PO4，0.3mM～0.7mM MgSO4，0.7mM～1.3mM CaCl2，0.07％～0.13％(v/v)Triton‑X100，且所述盐溶液pH＝7.0～7.8；

[0012] 3)扩增各分组中定殖好的所述待检测细菌的特征性核酸片段，并将扩增结果进行染色，根据W、SD和B组是否出现目标条带以确定所述待检测细菌的定殖能力，在B组出现目标条带定值能力最强，SD组次之，W组最次。

[0013] W、SD和B组的洗脱/灭菌能力有差别，W组最弱，B组最强，因而若B组出现目标条带的扩增产物，则说明出现目标对应的待检测细菌定殖能力较强。通过该方法，能够更加客观评价细菌定殖能力。

附图说明

[0014] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0015] 图1为本发明一个实施例中细菌Sp7和Sp245定殖丹参根系的检测结果；

[0016] Sp7&Sp245：从小麦中分离提取，早期研究已被鉴定为附生细菌和内生细菌；IGS，细菌16S‑23S rRNA基因间隔区，Sp7:～562bp，Sp245:～547bp；LFY，丹参LEAFY基因～257bp；Controls：PCR对照；No TC：无DNA模板；‑：无菌丹参；+：细菌DNA；

[0017] 图2为本发明一个实施例中分别接种两种细菌的丹参经三种不同化学处理后的荧光染色图；标尺长度为32μm。

具体实施方式

[0018] 现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

[0019] 因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

[0020] 本发明涉及一种检测细菌在丹参中定殖能力的方法，包括如下步骤：

[0021] 1)将待检测细菌接种于灭菌处理后的丹参幼苗中培养以使所接种的细菌定殖；

[0022] 2)将定殖好的丹参幼苗分别经过如下步骤处理并分组：

[0023] W)无菌水冲洗；

[0024] SD)灭菌的盐溶液洗涤10min～30min后再用无菌水冲洗；

[0025] B)依次用灭菌的盐溶液洗涤10min～30min、用3％～7％(g/100ml)次氯酸钠洗涤1.5min～2.5min、用Na2S2O3溶液冲洗；

[0026] 其中，所述盐溶液包括以下组分：

[0027] 127mM～147mM NaCl，1.7mM～3.7mM KCl，5mM～15mM Na2HPO4，1.3mM～2.3mM KH2PO4，0.3mM～0.7mM MgSO4，0.7mM～1.3mM CaCl2，0.07％～0.13％(v/v)Triton‑X100，且所述盐溶液pH＝7.0～7.8；

[0028] 3)扩增各分组中定殖好的所述待检测细菌的特征性核酸片段，并将扩增结果进行染色，根据W、SD和B组是否出现目标条带以确定所述待检测细菌的定殖能力，在B组出现目标条带定值能力最强，SD组次之，W组最次。

[0029] 本发明可适用于根际微生物定殖情况的研究。根际(rhizosphere)是指生物和物理特性受根系紧密影响的区域，它与微生物群系共同构成一个极复杂的生态区系，是确保植物根系生长发育正常进行的生境场所，也是植物与外界环境进行物质与能量交换的主要场所，此处微生物多样性丰富，具有强烈的根际效应。因此，根际微生物所形成的微生物环境对植物生长起到极其重要的作用。

[0030] 在一些实施方式中，所述盐溶液包括以下组分：

[0031] 132mM～142mM NaCl，1.9mM～3.5mM KCl，8mM～12mM Na2HPO4，1.5mM～2.1mM KH2PO4，0.4mM～0.6mM MgSO4，0.9mM～1.1mM CaCl2，0.08％～0.12％(v/v)Triton‑X100，且所述盐溶液pH＝7.2～7.6。

[0032] 在一些实施方式中，细菌的特征性核酸片段为细菌的16S rDNA中的片段。

[0033] 16S rDNA在结构与功能上具有高度的保守性，常用于细菌分离，在本发明中可以作为细菌种类简单的指纹序列。

[0034] 在一些实施方式中，将扩增结果进行染色的方法选自银染、亚甲蓝染色、溴化乙锭染色以及吖啶橙染色。

[0035] 在一些实施方式中，细菌的特征性核酸片段扩增所用上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:1和2所示。

[0036] SEQ ID NO:1和2所示序列针对16S rDNA的进化保守区进行设计，能将该区段扩增出来。

[0037] 在一些实施方式中，所述方法还包括扩增丹参内源性表达稳定的基因作为内参基因的步骤。

[0038] 在一些实施方式中，所述丹参内源性表达稳定的基因为LEAFY基因。

[0039] 在一些实施方式中，扩增所述LEAFY基因所用上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:3和4所示。

[0040] 在一些实施方式中，所述灭菌处理后的丹参幼苗的制备方法包括：

[0041] 将丹参种子培养发芽10～15天后得到所述丹参幼苗。

[0042] 在一些实施方式中，所述丹参种子经过灭菌清洗处理，所述灭菌清洗处理选自下列处理：

[0043] 70％～85％的乙醇水溶液清洗、40％～60％(g/100ml)次氯酸钠清洗以及无菌水清洗。

[0044] 在一些实施方式中，所述丹参种子在培养发芽之前还经过低温春化处理：

[0045] 于1/2MS固体培养基中，0℃～8℃避光培养2～4天。

[0046] 在一些实施方式中，所述培养发芽5～10天的培养条件为：光照培养12h～16h，温度23℃～27℃，黑暗培养8h～12h，温度20℃～24℃。

[0047] 在一些实施方式中，所述方法还包括：

[0048] 在将定殖好的丹参幼苗中的细菌进行染色以辅助判断细菌定殖能力。

[0049] 在一些实施方式中，所述对细菌染色所用的染料为SYTO 9以及碘化丙啶。

[0050] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

[0051] 实施例

[0052] 1.丹参种子灭菌与幼苗培养

[0053] 取8‑10粒丹参种子于离心管中，加入1mL 80％乙醇，置于振荡器1000rpm振荡3min。弃上清后，加1mL 50％NaClO振荡5min。弃上清后，加1mL无菌水洗涤4次。将种子转移至1/2MS固体培养基上，并用Parafilm封口膜封口，置于4℃暗室低温春化。三天后，移至光照培养箱中，25℃(14h)光照，22℃(10h)黑暗，待种子发芽生长一周后做接种处理。

[0054] 2.接种细菌

[0055] 使用从小麦中分离提取的Sp7和Sp245，均属于Azospirillum，早期研究已被鉴定为附生细菌(epiphytic bacterium)和内生细菌(endophytic bacterium)，可用于植物与微生物相互作用中细菌定殖特性研究的参考菌株。

[0056] 将两种目标菌种接种在6mL LB培养液中，28℃恒温培养箱，250rpm摇床培养48h。细菌培养液10,000rpm离心5min，弃上清液后，用无菌水稀释菌液，分光光度计测得细菌溶液浓度在600nm处的吸光值为0.7左右。在超净工作台内，将100μL稀释后的菌液均匀涂布在
1/2MS植物培养基上，并将丹参幼苗转移至方形培养皿(规格9cm×9cm)上，并用封口膜封口，每个培养基内可放置六株幼苗，之后再放置在恒温培养室(25℃，12h白天，12h黑夜)内培养一周。同时，用100μL无菌水涂布培养基，并放置六株丹参幼苗，用于空白对照。

[0057] 3.核酸提取

[0058] 对于接种细菌的丹参植物，在接种第七天后提取核酸。在此之前，采用三种不同类型的化学处理，以检测接种的细菌定殖丹参根系的能力强弱，即是以附生菌还是内生菌的形式与植物共生。三种化学处理丹参根系组织包括：1)无菌水冲洗两次，经此处理的样品标记为W；2)灭菌的盐溶液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,0.5mM MgSO4,1mM CaCl2,0.1％Triton‑X100,pH 7.4)洗涤20min，再用无菌水冲洗两次，样品记为SD；3)灭菌的盐溶液洗涤20min，再用5％次氯酸钠洗涤2min，最后用Na2S2O3溶液冲洗两次，样品记为B。

[0059] 分别转移3‑5株丹参根系于事先标记了W，SD和B的离心管内，然后相应地经过上述步骤1，2和3所述的化学处理后，再将丹参根系转移至预填充了研磨磁珠(14mm硅珠)的离心管内，加入750μL 2×CTAB和300μL氯仿，经组织研磨器进行充分研磨3min。室温16,000g离心10min，将上清液转移至新的离心管中。加入100μL醋酸铵和750μL无水乙醇，4℃，16,000g离心30min。弃上清，加入500μL 75％乙醇，4℃，16,000g离心10min，重复此步骤。弃上清后，干燥核酸，加无菌双蒸水稀释DNA至100ng/μL，DNA的纯度和浓度通过Nanodrop 2000与1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

[0060] 4.PCR法鉴定细菌基因

[0061] 使用细菌16S‑23S  IGS引物，正向引物16S‑e1390f(SEQ  ID NO:1：5’‑TGYACACACCGCCCGTCA‑3’，其中Y代表T或C)，反向引物23S‑e130r(SEQ ID NO:2：5’‑GGGTTBCCCCATTCRG‑3’，其中B代表G或C或T，R代表G或A)。25μL的PCR反应体系包括2.5μL 10×PCR buffer缓冲液，0.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，正反引物各0.8μM，0.5μL 5U/μL Taq聚合酶，约100ng DNA模板，最后加无菌ddH2O至25μL。PCR反应程序包括95℃预变性5min，30次循环包括95℃变性15s，60℃退火30s以及72℃延伸90s，最后72℃继续延伸5min。经嗅化乙锭染色后，PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳一小时左右，再经过凝胶成像仪检测PCR扩增结果并拍照。通过PCR扩增细菌指纹图谱的结果，来判断样品W、SD和B是否有目标细菌的指纹图谱。

[0062] 同时，没有接种细菌的无菌丹参作为阴性对照，通过PCR扩增，理论上是没有任何细菌指纹，若有指纹，则丹参幼苗被污染，实验需要重复。当样品W、SD和B的PCR结果都有明显的细菌指纹图谱，则认为该接种到丹参的细菌是以内生菌形式定殖，定殖能力较强。当仅有样品W的PCR结果有细菌指纹图谱，或样品SD也有微弱的指纹图谱，但样品B没有，则认为该接种丹参的细菌是以附生菌形式定殖，定殖能力较弱。检测结果见图1。

[0063] 5.PCR法鉴定植物基因

[0064] 在PCR扩增中，除了设计细菌特异性引物来扩增特定的细菌基因，也基于拟南芥的LEAFY基因，专门设计了植物特异性引物来扩增丹参特定基因LEAFY基因。丹参基因组设计的正、反向引物分别是SmLFY‑F(SEQ ID NO:3：5’‑GTTCCGGTACGCGAAGAAG‑3’)和SmLFY‑R(SEQ ID NO:4：5’‑GGACGTACCAAATGGAGAGG‑3’)。25μL的PCR反应体系包括2.5μL10×PCR buffer缓冲液，0.2mM dNTPs，正反引物各0.4μM，0.4μL 5U/μL Taq聚合酶，约200ng DNA模板，最后加无菌ddH2O至25μL。PCR反应程序包括95℃预变性1min，28次循环包括95℃变性15s，60℃退火15s以及72℃延伸45s，最后继续72℃延伸5min。经嗅化乙锭染色后，PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳一小时左右，再经过凝胶成像仪检测PCR扩增结果并拍照记录。
检测结果见图1。

[0065] 6.荧光显微镜双重验证

[0066] 为了观察细菌与植物相互作用中细菌的侵染状况，在接种细菌一周后，剪取小部分植物组织，用无菌水冲洗后，结合植物组织通过三种不同类型的化学处理方式后，分别放TM置在不同的载玻片上，滴加20μL左右绿色荧光核酸染料SYTO 9(SYTO 9Green Fluorescent Nucleic Acid Stain,ThermoFisher,USA)和绿红色荧光核酸染料PI(Propidium Iodide TM
ReadyProbes Reagent,ThermoFisher,USA)分别染色3min，再滴加适量无菌水洗掉载玻片上多余的染液，最后加盖玻片。SYTO 9绿色荧光核酸染料经证明能够对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活细胞和死细胞进行染色。荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。然后，将载玻片放置在Olympus(FSX100)荧光显微镜下观察，寻找合适的视野观察植物组织中已被染色的细菌群落，并分别使用10×、20×和30×的放大倍数来观察并拍照。通过观察细菌侵染植物的染色结果，与样品W、SD和B的PCR结果相对照，以进一步验证细菌定殖植物的方式(附生菌或内生菌)和定殖能力的强弱。
荧光镜检的结果见图2，荧光染色结果与PCR检测结果一致，对于附生细菌Sp7，丹参组织经过B化学方式洗涤后，无法检测到该菌。而对于内生细菌Sp245，丹参组织经过B化学方式洗涤后，仍能够检测到该菌的存在。进而说明了，基于两种特殊引物的PCR检测和植物组织特定的化学处理方式相结合，对于细菌定殖丹参的能力强弱和细菌功能的研究具有较强的研究意义和实用价值。

[0067] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0068] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。