胞二磷胆碱药物制剂及其脑梗塞急性期意识障碍的新用途

摘要

本发明提供了胞二磷胆碱钠或其组合物，包括含量在99.0％以上的胞二磷胆碱钠以及在脑梗塞急性期意识障碍的应用，还提供了一种胞二磷胆碱钠或其组合物的制备方法，包括，将5’‑胞苷酸和氯化磷酸胆碱分散于非质子有机溶剂中，加入1‑丙基磷酸环酐反应，滤除反应液中不溶物，收集滤液；冷却滤液，析出晶体，过滤得到胞二磷胆碱酸；将胞二磷胆碱酸与钠碱/盐反应生成胞二磷胆碱钠。本发明通过选择合适的原料和缩合剂，避免了传统化学法工艺中大量强酸性缩合剂以及吡啶，苯等高毒性溶剂的使用，提高了产品品质。

权利要求

1.一种胞二磷胆碱钠组合物的制备方法，其特征在于，所述胞二磷胆碱钠组合物包括含量在99.0％以上的胞二磷胆碱钠，还包括杂质A，

其含量在0.2％以下；

杂质B，

其含量在0.1％以下，

杂质C，

其含量在0.1％以下，

所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：将5’-胞苷酸和氯化磷酸胆碱分散于非质子有机溶剂中，加入1-丙基磷酸环酐反应，滤除反应液中不溶物，收集滤液，所述非质子有机溶剂为乙腈、乙醚或丙酮，1-丙基磷酸环酐的加入速度为1～3ml/min；

步骤2：冷却步骤1中的滤液，析出晶体，过滤得到胞二磷胆碱酸，所述冷却降温速率为7～10℃/h；步骤3：胞二磷胆碱酸与钠碱/盐反应生成胞二磷胆碱钠，所述钠碱/盐为氢氧化钠、碳酸钠和/或碳酸氢钠。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

1-丙基磷酸环酐加入后搅拌反应0.5～3h，再加热反应体系至回流，继续反应3～5小时；

反应结束后将反应体系降温至40～70℃，趁热除去不溶物。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对步骤3制得的胞二磷胆碱钠进行重结晶处理。

说明书

胞二磷胆碱药物制剂及其脑梗塞急性期意识障碍的新用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种胞二磷胆碱的制备，特别涉及一种合成工艺路线短、产品品质高的胞二磷胆碱的制备方法、胞二磷胆碱药物制剂及其在脑梗塞急性期意识障碍中的新用途。

背景技术

[0002] 胞二磷胆碱(胞二磷胆碱钠或胞磷胆碱钠)为脑代谢激活剂，能够促进脑细胞呼吸，改善脑功能，增强上行网状结构激活系统的功能，促进苏醒，降低脑血管阻力。胞二磷胆碱的结构式如下：

[0003]

[0004] 胞二磷胆碱是临床用量最大的神经激活剂，目前常用生物发酵法和化学合成法获得胞二磷胆碱。生物发酵法存在发酵周期长，单位产量低，反应液中成分复杂，工艺后期处理难度高，操作复杂，后处理需要用到柱层析纯化等，需要大量的设备进行处理，和化学合成法相比在效率和收率上都没有优势。

[0005] 传统的化学合成法一般以氯化磷酸胆碱钙盐为起始原料，以苯为溶剂，回流除去结晶水，然后以碳酸盐或草酸通过形成难溶的碳酸钙或草酸钙将钙离子除去，在不含活泼氢的有机胺类溶剂中再通过乙酰氯或者固体光气活化氯化磷酸胆碱，最后和胞苷酸反应生成胞二磷胆碱，再经相应的重结晶等后处理步骤得到成品。在传统的化学合成工艺中使用了大量强酸性缩合剂(如草酰氯等)以及吡啶、苯等高毒性溶剂，由此带来以下几个明显的缺点：

[0006] 1、采用氯化磷酸胆碱钙盐为起始原料，需要用1类溶剂苯进行脱水，工艺流程复杂，同时会带来苯的溶剂残留，不利于后续制剂的生产；

[0007] 2、合成过程中产生大量的酸性废水和碳酸钙，氯化钠等废盐，环保处理难度较大，同时后处理工艺中需要用到减压蒸馏等特殊手段(除去不含活泼氢的有机胺类溶剂)，生产上对设备的耐腐蚀性等要求较高，成本较高；

[0008] 3、经过乙酰氯，固体光气处理后的中间体为高度活性物质，容易发生副反应，造成原料反应不完全，收率低，产品含量低。

[0009] 为了解决上述现有技术中的问题，发明人在现有技术的基础上，研究出了一种反应条件温和、环境友好的制备高品质胞二磷胆碱的合成方法，从而提供了一种胞二磷胆碱钠或其组合物及其制备方法、制剂和用途。

发明内容

[0010] 为了解决上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：通过选择合适的原料和缩合剂，避免了传统化学法工艺中大量强酸性缩合剂(如草酰氯等)以及吡啶，苯等高毒性溶剂的使用；使得工艺反应条件温和，路线短，能耗低，后处理简便，从而完成了本发明。

[0011] 本发明的目的在于提供以下方面：

[0012] 第一方面，本发明提供了一种胞二磷胆碱钠或其组合物，包括质量含量在99.0％以上的胞二磷胆碱钠。

[0013] 所述胞二磷胆碱钠或其组合物中还包括杂质A，

[0014] 其含量在0.2％以下；和/或，

[0015] 进一步地，还包括杂质B，

[0016] 其含量在0.1％以下。

[0017] 所述胞二磷胆碱钠或其组合物中还包括杂质C，

[0018] 其含量在0.1％以下。

[0019] 第二方面，本发明提供了一种上述胞二磷胆碱钠或其组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

[0020] 步骤1：将5’-胞苷酸和氯化磷酸胆碱分散于非质子有机溶剂中，加入1-丙基磷酸环酐反应，滤除反应液中不溶物，收集滤液；

[0021] 步骤2：冷却步骤1中的滤液，析出晶体，过滤得到胞二磷胆碱酸；

[0022] 步骤3：胞二磷胆碱酸与钠碱/盐反应生成胞二磷胆碱钠。

[0023] 其中，所述非质子有机溶剂选自乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、苯、乙醚、四氯化碳和丙酮中的一种或组合，优选为乙腈、乙醚或丙酮；

[0024] 所述钠碱/盐呈碱性，选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、醋酸钠和乳酸钠中的任意或组合，优选为氢氧化钠、碳酸钠和/或碳酸氢钠。

[0025] 在所述制备方法中，

[0026] 1-丙基磷酸环酐加入后搅拌反应0.5～3h，再加热反应体系至回流，继续反应3～5小时；

[0027] 反应结束后将反应体系降温至40～70℃，趁热除去不溶物。

[0028] 优选地，还可以对步骤3制得的胞二磷胆碱钠进行重结晶处理。

[0029] 第三方面，本发明提供了一种上述胞二磷胆碱钠或其组合物，或使用上述方法制得的胞二磷胆碱钠或其组合物的胞二磷胆碱制剂，在所述制剂中胞二磷胆碱钠为活性成分。

[0030] 其中，所述制剂注射使用或口服使用，优选所述制剂为注射剂或口服制剂。

[0031] 第四方面，本发明提供了上述胞二磷胆碱钠或其组合物、上述方法制得的胞二磷胆碱钠或其组合物在制备脑缺血神经功能恢复药物中的应用，进一步地，在制备治疗脑梗塞急性期意识障碍药物中的应用。

[0032] 根据本发明提供的胞二磷胆碱钠或其组合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：

[0033] (1)相对于传统合成方法而言，本发明提供的制备方法转化率更高，副反应少，也没有使用反应性的有机胺类溶剂；反应溶剂和重结晶溶剂简单处理后可以循环套用，反应体系复杂性降低，采取简单的重结晶工艺就能实现产品的纯化，得到高含量的胞二磷胆碱钠；

[0034] (2)本发明提供的制备方法中，通过使用高效缩合剂1-丙基磷酸环酐，避免了传统化学法工艺中大量强酸性缩合剂(如草酰氯等)以及吡啶，苯等高毒性溶剂的使用，以及由此带来的大量工艺废水等环保问题；

[0035] (3)同时该工艺反应条件温和，路线短，能耗低，后处理简便，仅通过混合溶剂重结晶得到高含量的产品，解决了传统化学法和发酵法工艺中后处理困难，收率低的问题。

具体实施方式

[0036] 下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些示例性说明而变得更为清楚、明确。

[0037] 在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

[0038] 在本发明的描述中，需要说明的是，术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

[0039] 以下详述本发明。

[0040] 胞二磷胆碱钠传统的化学合成法一般以氯化磷酸胆碱钙盐为起始原料，以苯为溶剂，回流除去结晶水，然后以碳酸盐或草酸通过形成难溶的碳酸钙或草酸钙将钙离子除去，在不含活泼氢的有机胺类溶剂中再通过乙酰氯或者固体光气活化氯化磷酸胆碱，最后和胞苷酸反应生成胞二磷胆碱，再经相应的重结晶等后处理步骤得到成品。

[0041] 其化学合成工艺的反应方程式示意图如下：

[0042]

[0043] 传统化学合成工艺非常容易发生副反应，导致制得的产品含量低。通过仔细研究发现，该工艺中一般产生以下杂质(impurity)A、杂质B、杂质C、杂质D和E，

[0044]

[0045] 由于上述合成工艺周期长，处理复杂，产品中杂质多，在多次试验的基础上，本发明从起始原料、缩合剂和纯化工艺化等方面进行优化选择，以氯化磷酸胆碱为起始原料，从源头上跳过了传统工艺中苯回流脱水和加酸根脱除钙离子的过程，缩短了工艺流程，避免了1类溶剂残留，减少了固体废弃物的产生；同时选择温和的缩合剂1-丙基磷酸环酐(T3P)进行磷酸胆碱和胞苷酸的缩合，避免了传统酰氯类试剂和中间体的高活性带来的副反应，原料反应更完全，杂质产生更少，产品含量更高。

[0046] 具体而言，本发明提供了一种胞二磷胆碱钠或其组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

[0047] 步骤1：将5’-胞苷酸和氯化磷酸胆碱(C5H15ClNO4P)分散于非质子有机溶剂中，加入1-丙基磷酸环酐(T3P)反应，滤除反应液中不溶物，收集滤液；

[0048] 步骤2：冷却步骤1中的滤液，析出晶体，过滤得到胞二磷胆碱酸；

[0049] 步骤3：胞二磷胆碱酸与钠碱/盐反应生成胞二磷胆碱钠，即为胞二磷胆碱。

[0050] 本发明的合成路线示意图如下：

[0051]

[0052] 在步骤1中，加入的1-丙基磷酸环酐具有缩合剂的作用，使分散到非质子有机溶剂中的5’-胞苷酸和氯化磷酸胆碱发生缩合反应。1-丙基磷酸环酐的活化能力很好，可以很容易地和活泼氢发生反应，选用非质子有机溶剂可以避免1-丙基磷酸环酐和溶剂发生副反应。

[0053] 所述非质子有机溶剂选自乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、苯、乙醚、四氯化碳和丙酮中的一种或组合，优选为乙腈、乙醚或丙酮，更优选使用沸点相对高、对原料溶解较好地乙腈作为反应溶剂。

[0054] 所述非质子有机溶剂的用量一般为5’-胞苷酸用量的8～15倍，以重量计，优选为8～13倍。

[0055] 1-丙基磷酸环酐可以提高5’-胞苷酸和氯化磷酸胆碱的反应活性，与传统合成工艺中的酰氯或固体光气不同，1-丙基磷酸环酐对5’-胞苷酸和氯化磷酸胆碱起到协同缩合的作用，没有中间过渡态；而酰氯或固体光气需要先生成中间酰化物再转变为目标产物，因而在反应过程中很容易产生与中间过渡态相关的副反应，例如传统工艺中常存在的杂质E。

[0056] 另外，酰氯或固体光气的反应活性很高，可以轻松地活化5’-胞苷酸中氨基基团的活泼氢，生成杂质D。而1-丙基磷酸环酐的活化活性低于酰氯或固体光气，不足以活化5’-胞苷酸中氨基基团的活泼氢，因而不会生成杂质D。

[0057] 通过选用温和的缩合剂避免了杂质D和E的生成，减少了反应中副反应的发生，促进了目标产物的生成。

[0058] 研究还发现，在传统的胞二磷胆碱钠合成工艺中，由于使用的活化剂为酰氯或固体光气，其活性过高甚至可以与水发生反应，为了避免酰氯或固体光气和水的副反应，在反应时要使用苯对所用的溶剂、试剂进行脱水处理，以保证目标反应的进行。

[0059] 在化学药品领域，根据《化学药物残留溶剂研究的技术指导原则》，第一类溶剂是指人体致癌物、疑为人体致癌物或环境危害物的有机溶剂，并明确规定苯为第一类溶剂，其具有不可接受的毒性或对环境造成公害，应该尽量避免使用。

[0060] 在本发明中，使用的缩合剂为1-丙基磷酸环酐，其反应活性相对较低，不会和水发生反应，因此在胞二磷胆碱钠的合成过程中，不必专门脱除反应体系中存在的水分。这就避免了第一类溶剂苯的使用，还缩短了合成工艺路线和生产周期。

[0061] 为了使反应体系中1-丙基磷酸环酐的反应活性更温和，优选控制加入缩合剂时反应体系的反应温度，避免高温提高1-丙基磷酸环酐的活性和由此导致的非目标基团活性增强。

[0062] 基于1-丙基磷酸环酐反应活性，一般在低于50℃时加入缩合剂。较好地，在室温(10～30℃)下加入缩合剂进行反应。

[0063] 室温环境下加入1-丙基磷酸环酐时，由于反应最初1-丙基磷酸环酐的浓度高，在1-丙基磷酸环酐的缩合活化作用下，5’-胞苷酸和氯化磷酸胆碱主要依靠动力学进行反应，根据5’-胞苷酸中活泼氢的活化难度进行特定反应。

[0064] 5’-胞苷酸的内酯环中，由于环上羟基具有空间位阻，具有环状结构的1-丙基磷酸环酐很少活化5’-胞苷酸的环羟基(3’位和4’位)，而很容易活化其上空间位阻较小的磷酸氢，从而使反应体系中目标反应成为优势反应。

[0065] 进一步地，还需要控制1-丙基磷酸环酐的加入速度。1-丙基磷酸环酐的加入速度为0.5～5ml/min，优选为1～3ml/min，最好为1.5～2ml/min。

[0066] 在加入1-丙基磷酸环酐时最好不断搅拌，以使1-丙基磷酸环酐加入反应体系后能够快速分散。

[0067] 1-丙基磷酸环酐加入后反应体系立即开始反应，1-丙基磷酸环酐加入结束后继续搅拌反应，使5’-胞苷酸和氯化磷酸胆碱在动力学反应条件下充分反应，可以避免加热条件下热力学反应易发生的副反应。

[0068] 1-丙基磷酸环酐加入后继续搅拌反应0.5～3h，优选为0.5～2h，更优选为0.75～1.5h。

[0069] 此时，反应体系中大部分5’-胞苷酸和氯化磷酸胆碱已经反应完毕，为了提高剩余反应原料的反应活性，加热反应体系后通过提高反应物质分子的热动力提高反应产率。

[0070] 在一种优选的实施方式中，将反应体系升温至回流，继续反应3～5小时，使反应原料充分反应。

[0071] 在步骤1中，所述5’-胞苷酸和氯化磷酸胆碱的摩尔比可以为1:1，优选为1:1～1.1，更优选为1:1～1.05。

[0072] 其中，所述1-丙基磷酸环酐与5’-胞苷酸等摩尔，优选1-丙基磷酸环酐与5’-胞苷酸的摩尔比为1:1～1.1，更优选为1:1～1.05。

[0073] 回流反应结束后停止加热，降低反应体系温度并趁热除去不溶物。考虑到有机溶剂的可挥发性，过滤时溶液温度高很容易产生隐患，影响生产车间的安全；也很容易被操作人员吸入，影响操作人员的健康。当反应体系的温度过低时，产物或其他物质析出，无法实现除杂的目的。

[0074] 经过多次研究，优选将反应体系降温至40～70℃，更优选为50～60℃，反应溶剂挥发速度相对较慢，并且可溶性物质在该温度条件不析出。热过滤除去反应体系中的不溶物可以初步提高产物的含量。

[0075] 在步骤1的反应过程中，由于反应条件温和，滤液中不含有传统合成工艺中常有的杂质D和E，而仅含有杂质A和极少量的杂质B。其中，A为原料杂质，B为反应杂质。

[0076] 在本发明提供的反应方法中，由于5’-胞苷酸上3’位和4’位环羟基被缩合剂活化的能力很弱，并且由于环上空间位阻的影响和本发明反应条件温和的多重作用下，热力反应的杂质B的含量很低，很少生成，从而在步骤1中便降低了后续处理的难度，有助于提高终产物胞二磷胆碱钠的品质。

[0077] 在步骤2中，冷却步骤1中得到的滤液使析出胞二磷胆碱酸。

[0078] 冷却时，滤液降温速度过快可能会导致析出物包埋滤液中杂质，从而导致析出物杂质含量高。

[0079] 在一种优选的实施方式中，可以自然冷却步骤1中得到的滤液。所述自然冷却是指不对滤液进行降温干预，仅依靠滤液和环境温度的温差实现滤液的缓慢降温。

[0080] 自然冷却时，环境温度越低可以析出越多产物，但是析出周期会相应变长。优选环境温度为10～30℃，更优选为10～25℃，最好为10～20℃。

[0081] 在另一种优选的实施方式中，以5～15℃/h的降温速率冷却滤液，以使胞二磷胆碱酸析出。优选为6～12℃/h，更优选为7～10℃/h，析出速度快，包埋杂质少。

[0082] 过滤收集析出物，得到胞二磷胆碱酸。

[0083] 而滤除胞二磷胆碱酸的滤液可套用至下一次生产，有效提高了反应溶剂的使用率，降低了生产成本和化学废液的处理量。

[0084] 在步骤3中，通过将步骤2中制得胞二磷胆碱酸与碱性的钠碱/盐进行成盐反应，制得胞二磷胆碱钠。优选将胞二磷胆碱酸溶于纯化水中与水溶性的钠碱/盐进行成盐反应。

[0085] 为了提高胞二磷胆碱酸的溶解速率，必要时可以加热。

[0086] 其中，所述碱性的钠碱/盐选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、醋酸钠和乳酸钠中的任意或组合；优选所述钠碱/盐为氢氧化钠、碳酸钠和/或碳酸氢钠；更优选使用碱性相对较弱的碳酸钠或碳酸氢钠，可以减少成盐过程中酯键的水解。

[0087] 为了保证胞二磷胆碱酸全部转变为钠盐，优选加入钠碱/盐调节水溶液pH值至7～8，最好为7.5～8，以使胞二磷胆碱酸充分反应为胞二磷胆碱钠。钠碱/盐优选溶解后滴加入溶解有胞二磷胆碱酸的溶液中。

[0088] 为了提高胞二磷胆碱酸和钠碱/盐的反应速率，可以加热溶解有胞二磷胆碱酸的水溶液。然而，当该溶液的温度过高时，特别是在碱性水性条件下可以引起反应产物的水解。

[0089] 研究发现，在成盐反应过程中，5’-胞苷酸中的磷酸酯基团在碱性水溶液中会发生水解，形成杂质C。而胞二磷胆碱钠中P-O酯键由于空间位阻的影响相对不容易水解。

[0090] 多次研究后发现，将该溶液加热至30～40℃后加入钠碱/盐，有利于成盐反应，还可以减少水解反应的发生。

[0091] 成盐反应结束后，搅拌下向该溶液中加入不良溶剂使胞二磷胆碱钠析出。所述不良溶剂优选为乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮和/或二甲基甲酰胺，优选为丙酮或乙醇，更优选为乙醇。

[0092] 优选趁热加入不良溶剂，在成盐反应溶液对胞二磷胆碱钠溶解性能逐渐变差时，相对较高的溶液温度也存在一个逐渐降低的过程，从而使含量较低的杂质A和B继续呈溶解状态而不析出，而目标产物胞二磷胆碱钠随着溶液溶解能力的饱和而逐渐析出。

[0093] 其中，所述不良溶剂的加入体积为成盐反应中水溶液体积的0.1～0.5倍，优选为0.1～0.4倍，最好为0.1～0.3倍。当不良溶剂的加入量过多时，胞二磷胆碱钠的析出速度过快，容易包埋过多杂质，降低产物的纯度和含量。

[0094] 所述不良溶剂的加入速度不易过快，以免胞二磷胆碱钠局部析出。优选在搅拌下分3～5次将不良溶剂全部加入。

[0095] 在加入不良溶剂时，搅拌速度为50～300r/min，优选为100～150r/min，可以使不良溶剂快速分散。

[0096] 加入不良溶剂后，使胞二磷胆碱钠析出。

[0097] 进一步地，加入不良溶剂后还可以将溶液降温至10±2℃，优选降温速率为0.1～0.5℃/min；更优选为0.1～0.3℃/min。

[0098] 保温30～60min使溶液中逐渐析出晶核，优选为45～60min；保持搅拌速度为40～80r/min；优选为40～50r/min，使晶体颗粒大小均匀。

[0099] 在析出过程中，缓慢的晶体成长速度有利于优势晶体的成长，有助于提高产物的稳定性。

[0100] 过滤收集析出物，干燥，即得胞二磷胆碱钠(胞二磷胆碱)，所述胞二磷胆碱钠中仅含有杂质A、B和C。

[0101] 在一种优选的实施方式中，还可以将制得的胞二磷胆碱进行重结晶处理，以进一步提高胞二磷胆碱的含量，降低杂质的含量。

[0102] 在重结晶处理中，优选将制得的胞二磷胆碱钠溶解于热的结晶溶剂中至饱和，冷却，析晶。

[0103] 所述结晶溶剂为乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、二甲基甲酰胺的一种或多种的水溶液，为了降低反应的毒性，优选使用乙醇/水溶液为结晶溶剂。

[0104] 杂质A、B和C与产物胞二磷胆碱钠的物理性质相似，都具有很好的水溶性。为了提高杂质A、B和C的去除量，尽量使其保留在重结晶的母液中，优选使用乙醇体积浓度为15～25％的水溶液作为结晶溶剂。

[0105] 为了降低重结晶产物中的热源、微生物等物质，还可以使用注射用水或灭菌注射用水结晶溶剂。

[0106] 在重结晶处理时，将步骤2中制得的胞二磷胆碱钠溶解于结晶溶剂中，加热提高其溶解度以减少溶剂用量。为了减少步骤2中制得的产物在重结晶中发生酯键水解，优选将重结晶溶剂加热至35～45℃后溶解胞二磷胆碱钠至饱和。

[0107] 趁热经微孔滤膜过滤，除去不溶物和除菌后再降温，可以降低胞二磷胆碱钠中杂质C的含量。

[0108] 在重结晶时，降温速率过快时，产物析出快，容易包埋和夹杂母液中的杂质，造成产品杂质含量过高；降温速率过慢时，造成析出时间过长，结晶效率低。

[0109] 优选降温速率为5～10℃/h，优选为6～8℃/h，将溶液降温至5～8℃，保温使晶体析出。优选保温5～10h，使晶体充分成长。

[0110] 重结晶过程中控制搅拌速率为80～120r/min(转/分)，优选为80～100r/min。

[0111] 过滤收集滤饼，真空干燥或烘干，得到胞二磷胆碱钠(也称为胞二磷胆碱)。

[0112] 通过重结晶，使杂质A、B和C留存在母液中，进一步提高了产物胞二磷胆碱钠的纯度和含量。本发明提供的胞二磷胆碱钠制备方法可以得到含量大于99.0％，特别是大于99.3％，优选大于99.6％的胞二磷胆碱钠。

[0113] 在本发明提供的胞二磷胆碱钠制备方法中，由于反应条件温和，不会产生杂质D和E，反应原料更容易反应完全，杂质A和B的量大大减少。

[0114] 相对于传统合成方法而言，本发明提供的制备方法转化率更高，副反应少，也没有使用反应性的有机胺类溶剂；本发明的反应溶剂和重结晶溶剂简单处理后可以循环套用，反应体系复杂性降低，采取简单的重结晶工艺就能实现产品的纯化，降低杂质A、B和C的含量，得到高含量的胞二磷胆碱钠。

[0115] 在制备过程中，两次结晶的溶剂经简单蒸馏回收后可重复利用，有效减少了有机溶剂的使用量，降低了生产成本和试剂回收的难度；该方法对环境友好。

[0116] 另外，本发明提供的制备方法中，通过使用高效缩合剂1-丙基磷酸环酐，避免了传统化学法工艺中大量强酸性缩合剂(如草酰氯等)以及吡啶，苯等高毒性溶剂的使用，以及由此带来的大量工艺废水等环保问题；同时该工艺反应条件温和，路线短，能耗低，后处理简便，仅通过混合溶剂重结晶得到高含量的产品，解决了传统化学法和发酵法工艺中后处理困难，收率低的问题。

[0117] 第二方面，本发明还提供了一种使用上述方法制备的胞二磷胆碱钠或其组合物，其包括质量含量在99％以上，优选99.5％以上的胞二磷胆碱钠。

[0118] 进一步地，所述胞二磷胆碱钠或其组合物还含有杂质A，其含量在0.2％以下，优选在0.1％以下；

[0119] 所述胞二磷胆碱钠或其组合物还含有杂质B，其含量在0.1％以下，优选在0.05％以下；

[0120] 所述胞二磷胆碱钠或其组合物还含有杂质C，其含量在0.1％以下，优选在0.05％以下。

[0121] 特别地，所述胞二磷胆碱钠或其组合物在长期试验的条件(25℃±2℃/65％RH±5％RH)下放置18个月，胞二磷胆碱钠的含量不低于99.0％，杂质A的含量不高于0.2％，杂质B的含量不高于0.1％，杂质C的含量不高于0.1％。

[0122] 第三方面，本发明提供了一种使用上述方法制得的胞二磷胆碱钠或其组合物的胞二磷胆碱制剂，所述制剂以胞二磷胆碱钠为活性成分。

[0123] 所述制剂注射使用或口服使用，优选所述制剂为注射剂或口服制剂。

[0124] 其中，注射剂可以是冻干制剂、溶液剂或无菌分装制剂；口服制剂可以是片剂、胶囊剂、缓释剂或颗粒剂。

[0125] 所述制剂还可以和其他活性成分配伍使用，例如，比拉西坦、依达拉奉或血栓通等，制成胞二磷胆碱复方制剂。

[0126] 另外，根据前述胞二磷胆碱钠或其组合物、胞二磷胆碱制剂、胞二磷胆碱复方制剂，本发明还提供了其在制备脑缺血神经功能恢复药物中的应用。进一步地，在制备治疗脑梗塞急性期意识障碍药物中的应用。

[0127] 实施例

[0128] 实施例1

[0129] 胞二磷胆碱钠的制备：

[0130] 向反应瓶中加入5’-胞苷酸50g，乙腈500ml，氯化磷酸胆碱36g，开启搅拌，在25℃下以2.0ml/min的速度加入1-丙基磷酸环酐52g，加毕搅拌1小时后升温至反应体系回流，回流反应3小时后，反应体系降温至55℃并趁热过滤，收集滤液；

[0131] 滤液自然冷却至25℃，析出大量晶体，过滤得到胞二磷胆碱酸，滤液套用至下一批；

[0132] 将收集的胞二磷胆碱酸溶于1000ml纯化水中，升温至35℃搅拌溶解后加入碳酸氢钠调节pH值至7.5，加毕，搅拌下加入200ml乙醇，以2℃/min的降温速率将溶液降温至10℃，保温45min，过滤收集胞二磷胆碱钠；

[0133] 将胞二磷胆碱钠溶解于约40℃的乙醇体积浓度为15％的乙醇/水溶液中至饱和，0.2μm的微孔滤膜过滤后，滤液以6℃/h降温速率温至5℃，保持搅拌速率为80r/min，保温
5h。

[0134] 过滤收集滤饼，真空干燥，得到胞二磷胆碱钠72.08g，收率为91.30％。

[0135] 实施例2

[0136] 胞二磷胆碱钠的制备：

[0137] 向反应瓶中加入5’-胞苷酸50g，乙腈500ml，氯化磷酸胆碱34.5g，开启搅拌，在30℃下以1.5ml/min的速度加入1-丙基磷酸环酐49.5g，加毕搅拌0.75小时后升温至反应体系回流，回流反应5小时后，反应体系降温至60℃并趁热过滤，收集滤液；

[0138] 滤液冷却至15℃，析出大量晶体，过滤得到胞二磷胆碱酸，滤液套用至下一批；

[0139] 将收集的胞二磷胆碱酸溶于1000ml纯化水中，升温至40℃搅拌溶解后加入碳酸氢钠调节pH值至7，加毕，搅拌下加入300ml乙醇，以1℃/min的降温速率将溶液降温至10℃，保温60min，过滤收集胞二磷胆碱钠；

[0140] 将胞二磷胆碱钠溶解于约50℃的乙醇体积浓度为25％的乙醇/水溶液中至饱和，0.2μm的微孔滤膜过滤后，滤液以8℃/h降温速率温至8℃，保持搅拌速率为100r/min，保温
5h。

[0141] 过滤收集滤饼，真空干燥，得到胞二磷胆碱钠73.06g，收率为92.54％。

[0142] 实施例3

[0143] 胞二磷胆碱钠的制备：

[0144] 向反应瓶中加入5’-胞苷酸50g，乙腈500ml，氯化磷酸胆碱35.5g，开启搅拌，在20℃下以3.0ml/min的速度加入1-丙基磷酸环酐51g，加毕搅拌1.5小时后升温至反应体系回流，回流反应5小时后，反应体系降温至50℃并趁热过滤，收集滤液；

[0145] 滤液自然冷却至25℃，析出大量晶体，过滤得到胞二磷胆碱酸，滤液套用至下一批；

[0146] 将收集的胞二磷胆碱酸溶于1000ml纯化水中，升温至30℃，搅拌溶解后加入碳酸钠调节pH值至8，加毕，搅拌下加入200ml乙醇，以3℃/min的降温速率将溶液降温至10℃，保温60min，过滤收集胞二磷胆碱钠；

[0147] 将胞二磷胆碱钠溶解于约45℃的乙醇体积浓度为20％的乙醇/水溶液中至饱和，0.2μm的微孔滤膜过滤后，滤液以5℃/h降温速率温至7℃，保持搅拌速率为100r/min，保温
5h。

[0148] 过滤收集滤饼，真空干燥，得到胞二磷胆碱钠71.41g，收率为90.45％。

[0149] 实施例4

[0150] 分别称取实施例1～3制得的胞二磷胆碱钠62.5g，氯化钠4.5g，溶解于500ml注射用水中，加入1g的针用活性炭吸附30min，0.2μm微孔滤膜过滤，以胞二磷胆碱钠计2ml:250mg的规格装量，湿热灭菌，制得制剂A、B和C。

[0151] 实施例5

[0152] 胞二磷胆碱钠片剂

[0153] 处方如下：

[0154]

[0155] 制备工艺为：

[0156] 将上述物料混合均匀后，常规工艺制软材，烘干，以胞二磷胆碱钠计100mg的规格压片。

[0157] 对比例

[0158] 对比例1

[0159] 与实施例1制备方法相同，区别在于：

[0160] 加入1-丙基磷酸环酐时使反应体系的温度为50℃。

[0161] 对比例2

[0162] 与实施例1制备方法相同，区别在于：

[0163] 在制备钠盐时，使用氢氧化钠调节溶液pH值至9.0。

[0164] 对比例3

[0165] 与实施例1制备方法相同，区别在于：

[0166] 胞二磷胆碱钠没有经过重结晶处理。

[0167] 实验例

[0168] 实验例1

[0169] 按照2015年版药典规定测定实施例1～3制得的胞二磷胆碱的残留溶剂。结果如下：

[0170]   乙醇/ppm 乙腈/ppm实施例1 88 6
实施例2 125 12
实施例3 106 8

[0171] 实施例1～3避免了1类溶剂的使用，使得产品中几乎不存在有毒有害的有机溶剂；另外，实施例1～3中的有机溶剂残留量非常少，长期使用安全性高。

[0172] 实验例2

[0173] 使用高效液相色谱法(外标法)测定实施例1～3和对比例1～3制得的胞二磷胆碱的含量。

[0174]实施例 含量/％ 对比例 含量/％
实施例1 99.6 对比例1 98.3
实施例2 99.7 对比例2 98.6
实施例3 99.7 对比例3 98.6

[0175] 实验例3

[0176] 使用高效液相色谱法(外标法)测定实施例1～3和对比例1～3制得的胞二磷胆碱的质量含量、杂质A、B和C的质量含量。所述检测样品在长期试验条件(25℃±2℃/65％RH±5％RH)下分别放置0、6、12、18月。结果如下：

[0177]

[0178] 由上表可知，长期试验后，实施例1～3中的胞二磷胆碱钠的质量含量很稳定，而杂质A的含量不超过0.2％，杂质B的含量不超过0.05％，杂质C的含量不超过0.1％。

[0179] 实验例4

[0180] 使用高效液相色谱法(外标法)测定实施例4制得的胞二磷胆碱制剂A、B、C中胞二磷胆碱(占标示量百分比)和杂质A、B和C的质量含量。所述检测样品在加速试验条件(40℃±2℃/75％RH±5％RH)下分别放置1、3、6月。按照2015年版药典规定测定酸度、溶液澄清度。

[0181] 结果如下：

[0182]

[0183] 可见，经过加速试验后，制剂A～C中胞二磷胆碱的含量很稳定，只有少量降解；而杂质A的含量不超过0.3％，杂质B的含量不超过0.3％，杂质C的含量不超过0.1％；加速试验后胞二磷胆碱制剂的澄明度也满足注射要求。

[0184] 实验例5

[0185] 选用健康雄性小鼠80只，体重25-30g，正常饲养3天，称重，随机分成5组，每组16只，分别为假手术组(阴性对照组)、模型组、尼莫地平组、高、低剂量胞磷胆碱钠组。按30mg/kg静注尼莫地平混悬液(阳性对照药)，高、低剂量胞磷胆碱钠(给药剂量分别为5g/kg体重、2.5g/kg体重给药)，假手术组、模型组给予同体积注射用水静注，每天给药1次，连续给药7天。

[0186] 于第6天晚上8点开始分批禁食不进水，第7天上午8点分批称重给药1h后，用10％水合氯醛(0.03ml/10g)腹腔注射麻醉小鼠，小鼠麻醉后，颈部正中偏左切口，逐层分离暴露左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉，用动脉夹段颈内动脉，于颈总动脉距离分叉1mm处剪一个约0.2mm宽的小口，将线栓插入，经颈总动脉分叉不进入颈内动脉，向上深入只分叉以上8-10mm，直至有阻力，机阻断大脑中动脉入口处，结扎颈内动脉切口和拴线，2h后轻轻抽出拴线，实现再灌注，造大脑中动脉阻塞-再灌注动物模型。假手术组只暴露左侧血管不做插线处理。

[0187] 所有小鼠再灌注22h后，对造模小鼠进行神经功能缺失评分：采用Longa标准进行。评分标准：0分：无神经功能缺失症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：爬行时出现向偏瘫转圈；3分：行走时，身体向偏瘫倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失；5分：死亡。

[0188]

[0189] 注：与模型组比，**P＜0.01，*P＜0.05

[0190] 以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。