一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法

摘要

本发明公开了一种暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，包括以下步骤：(1)选取暗纹东方鲀稚鱼，无菌解剖摘取肝脏，清洗，剪碎；(2)将剪碎的肝脏利用胶原酶Ⅱ消化液消化，过滤，离心，沉淀中加入裂解液处理后得细胞悬液，然后加入到分离液中，离心去除杂质；(3)向沉淀中加预温过的完全培养基，混匀，补足完全培养基，进行培养。对于现有技术，本发明暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，能够解决肝细胞分离困难的问题，并且肝细胞分离效率高，培养得到的细胞生长良好，生理状态稳定，符合原代培养要求。

权利要求

1.一种暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选取暗纹东方鲀稚鱼，无菌解剖摘取肝脏，清洗，剪碎；所述暗纹东方鲀稚鱼，是体长为2±0.5cm，体重为2±0.3g的未经饲料转化，用红虫或卤虫饲养的稚鱼，取肝组织前饲养在盐度为1‑3的水环境中，饥饿处理；

(2)将剪碎的肝脏利用胶原酶Ⅱ消化液消化，过滤，离心，沉淀中加入裂解液处理后得细胞悬液，然后加入到分离液中，离心去除杂质；

(3)向沉淀中加预温过的完全培养基，混匀，补足完全培养基，进行培养。

2.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述胶原酶Ⅱ消化液的浓度为0.5‑2mg/ml，加入量为每克肝组织加入7‑9ml，25‑28℃消化1.5‑3h。

3.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述沉淀中加入红细胞裂解液处理，方法为：在沉淀中加入红细胞裂解液，混匀，离心，得细胞沉淀，向沉淀中加入基础培养基，混匀，得细胞悬液。

4.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述分离液为60％percoll分离液，细胞悬液与percoll分离液的体积比为3:(4‑6)。

5.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述完全培养基成分包括：DMEM基础培养基中加入胎牛血清和暗纹东方鲀血清，DMEM基础培养基、胎牛血清及暗纹东方鲀血清体积比为12‑15：4‑5：1‑3，并且加入包含青霉素和链霉素的双抗溶液和谷氨酰胺溶液，调pH至7.6～7.8之间。

6.根据权利要求5所述的暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于，每

100ml完全培养基中加入110μl双抗溶液和0.5～1.5ml L‑谷氨酰胺溶液，双抗溶液中含有青霉素100Units/ml和链霉素100μg/ml，谷氨酰胺溶液的浓度为20mmol/L。

说明书

一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法，属于暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养技术领域。

背景技术

[0002] 暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)属于海淡水洄游型鱼类，主要分布于长江中下游地区，为长江三鲜之一。近年来，国家和政府加大了对河鲀养殖产业的支持，暗纹东方鲀
养殖技术成熟，产量逐年升高。然而，在产业快速发展的同时，养殖过程中的种种问题也逐
渐浮现(如种质资源退化，各种病害频发)。因此，加大对暗纹东方鲀的基础研究力度有利于
其养殖业的健康快速发展。然而，在暗纹东方鲀基础研究方面，原代肝细胞的培养仍没有突
破。

[0003] 肝脏作为鱼类最主要的代谢器官，在鱼类的消化吸收、物质代谢、毒素分解和病害防御等生命活动中发挥重要作用。原代培养的肝细胞离体时间短，生物性状尚未发生很大
变化，较好的保留及维持了肝细胞的完整性和代谢活性，在一定程度上可以更精准的反应
体内代谢情况。然而，根据前期实验，暗纹东方鲀肝脏中的脂肪含量达75％以上，远远超过
常规鱼类肝脏中的脂肪含量。肝脏中高密度脂肪的积累，给肝细胞的分离带来了巨大的困
难。

发明内容

[0004] 发明目的：针对上述技术问题，本发明目的提供一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法，该方法对后续在细胞层面开展相关理论研究提供了技术支持。

[0005] 技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

[0006] 一种暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，包括以下步骤：

[0007] (1)选取暗纹东方鲀稚鱼，无菌解剖摘取肝脏，清洗，剪碎；

[0008] (2)将剪碎的肝脏利用胶原酶Ⅱ消化液消化，过滤，离心，沉淀中加入裂解液处理后得细胞悬液，然后加入到分离液中，离心去除杂质；

[0009] (3)向沉淀中加预温过的完全培养基，混匀，补足完全培养基，进行培养。

[0010] 作为优选：

[0011] 步骤(1)中所述暗纹东方鲀稚鱼，是体长为2±0.5cm，体重为2±0.3g的未经饲料转化，用红虫或卤虫饲养的稚鱼，取肝组织前饲养在盐度为1‑3的水环境中，饥饿处理。

[0012] 步骤(2)中所述胶原酶Ⅱ消化液的浓度为0.5‑2mg/ml，加入量为每克肝组织加入7‑9ml，25‑28℃消化1.5‑3h。

[0013] 步骤(2)中所述沉淀中加入红细胞裂解液处理，方法为：在沉淀中加入红细胞裂解液，混匀，离心，得细胞沉淀，向沉淀中加入基础培养基，混匀，得细胞悬液。

[0014] 步骤(2)中所述分离液为60％percoll分离液，细胞悬液与percoll分离液的体积比为3:(4‑6)。

[0015] 步骤(3)中所述完全培养基成分包括：DMEM基础培养基中加入胎牛血清和暗纹东方鲀血清，DMEM基础培养基、胎牛血清及暗纹东方鲀血清体积比为12‑15：4‑5：1‑3，并且加
入包含青霉素和链霉素的双抗溶液和谷氨酰胺溶液，调pH至为7.6～7.8之间。

[0016] 优选，每100ml完全培养基中加入110μl双抗溶液和0.5～1.5ml L‑谷氨酰胺溶液，双抗溶液中含有青霉素100Units/ml和链霉素100μg/ml，谷氨酰胺溶液的浓度为20mmol/L

[0017] 本发明申请人利用已报道的鱼类及哺乳动物肝细胞分离培养方法进行反复实验，针对暗纹东方鲀，只能得到少量的肝细胞，生存能力弱，难以应用到实验研究中去。基于此，
本发明申请人经过多年研究，提供了本发明技术方案，其解决了暗纹东方鲀肝细胞分离困
难的问题，并得到较好的原代培养方法。这为暗纹东方鲀相关理论基础的研究奠定了基础，
也为其他高脂肪组织细胞分离培养方法的建立提供了参考。

[0018] 技术效果：相对于现有技术，本发明暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，能够解决肝细胞分离困难的问题，并且肝细胞分离效率高，培养得到的细胞生长良好，生理状态
稳定，符合原代培养要求。

附图说明

[0019] 图1是暗纹东方鲀肝组织。

[0020] 图2是消化处理后暗纹东方鲀原代肝细胞(400×)。

[0021] 图3是1d培养后暗纹东方鲀原代肝细胞(400×)。

[0022] 图4是实施例1、对比例1、对比例2培养1d得到的暗纹东方鲀肝细胞图片对比(400×)。

[0023] 图5是实施例1、对比例1、对比例2分离得到的暗纹东方鲀肝细胞相对数量(肝细胞相对数量指的是一个显微镜视野400×下的)。

[0024] 图6是实施例1、对比例1、对比例2分离得到的暗纹东方鲀肝细胞活力。

具体实施方式

[0025] 为了更清楚的理解本发明技术方案，在此对本发明作进一步的详细描述。

[0026] 实施例1

[0027] 1.一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法，具体操作步骤为：

[0028] (1)选取暗纹东方鲀体长为2±0.5cm，体重为2±0.3g的未经饲料转化，用红虫或卤虫饲养的稚鱼(取肝组织前饲养在盐度为1‑3的水环境中一周，饥饿处理48h)，使用70％
酒精棉球擦拭鱼体，无菌解剖，Hank’s液多次清洗去除杂质，得到的肝组织如图1所示；

[0029] (2)将清洗好的肝脏放入事先准备好的Ⅱ型胶原酶(1mg/mL)消化液中(用量为每3
克肝组织加入8ml)，用高温消毒灭菌过的眼科剪将肝脏剪碎约1‑3mm 大小。将肝脏碎片连
同胶原酶Ⅱ消化液转移至50ml的无菌离心管中，于28℃恒温震荡摇床上消化3h。

[0030] (3)消化的组织悬液加入等体积完全培养基终止消化，经过80目筛网过滤，过滤液放入新的离心管中，4℃1000rpm 10min，弃掉上清；

[0031] (4)在沉淀中加入红细胞裂解液，10ml离心管中加入3‑6ml，移液枪吹打混匀，4℃800rpm离心5min，得细胞沉淀，向沉淀中加入6ml基础培养基，移液枪反复吹打混匀，将细胞
悬液缓慢加到60％percoll分离液上方，使细胞悬液与percoll分离液的体积比为3:5，4℃
3000rpm离心5min，得细胞沉淀。所用的60％percoll分离液的配制方法为：percoll原液
90ml与10×PBS 10ml混合(pH 7.4，渗透压335mOsm)，制成缓冲型percoll液；取30ml缓冲型
percoll液与20ml 1×PBS混合，4℃5000r/min离心3min，获得密度为1.05～1.06g/ml的
60％的percoll梯度分离液。

[0032] (5)往沉淀中加3～5ml完全培养液，在离心管中反复吹打混匀，将液体转移至细胞2 3 5
培养瓶(7ml，25cm)中，补足完全培养基体至8ml，细胞密度保持在1×10/ml～1×10/ml之
间，倒置显微镜下观察细胞如图2，从图中可以看出，细胞分散均匀，状态良好，适宜后续培
养，观察后放入28℃细胞培养箱中培养1‑2d；

[0033] 其中完全培养液的配制方法：DMEM基础培养基加入胎牛血清,暗纹东方鲀鱼血清，DMEM基础培养基与胎牛血清和暗纹东方鲀血清体积比为7：2：1，然后每100ml培养液中加入
110μl双抗溶液(青霉素100Units/ml、链霉素100μg/ml)和1.5ml L‑谷氨酰胺溶液(20mmol/
L)，使用3.7％NaHCO3溶液调pH至为7.6～7.8之间。

[0034] (6)1‑2d后，倒掉原培养瓶中培养液，加入DEME基础培养基(无血清)约5ml，清洗两次，倒掉清洗液后加入新的完全培养液8ml，继续扩大培养。

[0035] (7)1d后培养的暗纹东方鲀原代肝细胞见图3、图4，从图中可以看出绝大多数肝细胞形态发生改变，状态稳定。

[0036] 2.暗纹东方鲀肝原代细胞台盼蓝染色与细胞计数

[0037] 随机吸取培养瓶中细胞悬液，加入台盼蓝进行染色(细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀)，在3min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞(镜下观察，死细胞被
染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状)，最后统计细胞活力。

[0038] 活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％

[0039] 细胞计数结果显示，本发明方法分离培养的暗纹东方鲀原代肝细胞，活细胞率稳定在85％以上，如图5、图6所示，并且细胞生理状态稳定，细胞形态良好，均已达到原代细胞
培养要求，实验证明本发明方法可行。

[0040] 作为实施例1的补充说明，在基本实验操作相同的基础上，选择不同的实验参数进行了两组实验，分别为(a)肝脏消化时选取Ⅱ型胶原酶浓度为0.5mg/ml，消化处理时间为25
℃3h，完全培养基配比为DMEM基础培养基与胎牛血清和暗纹东方鲀血清体积比为12:5:3；
(b)肝脏消化时选取Ⅱ型胶原酶浓度为2mg/ml，消化处理时间为28℃1.5h，完全培养基配比
为DMEM基础培养基与胎牛血清和暗纹东方鲀血清体积比为15:4:1；结果与实施例1基本相
同，细胞分散良好，台盼蓝染色细胞活力达到85％以上，证明选取范围可靠。

[0041] 对比例1

[0042] 与实施例1基本相同，不同之处仅在于个体大小差异，如下：

[0043] 选取正常饲料驯化的暗纹东方鲀幼鱼，体长为10±2cm，体重为45±8g。

[0044] 结果显示，倒置显微镜观察可见细胞分散稀疏，数量少，如图4、图5实所示。台盼蓝染色显示，细胞活力较低，如图6所示。说明选取未经转料的幼龄个体可大大增强细胞分离
效果。

[0045] 对比例2

[0046] 实施例1基本相同，不同之处仅在于肝细胞分离方法方面差异，如下：

[0047] 实验选用常规分离动物细胞所用的胰蛋白酶消化液，将肝脏碎片放入装有0.25％胰蛋白酶消化液的离心管中。0.25％胰蛋白酶的配制方法为：将胰蛋白酶粉末与D‑Hank’s
平衡盐溶液(pH7.2左右)按比例搅拌，混匀，过滤除菌。结果显示，细胞分散良好，数量较少，
如图4、图5所示。台盼蓝染色结果显示，细胞活力较低，仅有64％，如图6所示，对比实施例1，
说明本发明选取胶原酶消化对细胞损伤较小。