一种基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂

摘要

本发明公开了一种基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂，其序列为：5’‑GATATGCGACCGATT‑3’。本发明提供的基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂，可以显著升高鸭血清细胞因子IL‑1β/12p40、IL‑1β、IFN‑α和IFN‑β水平，上调鸭免疫器官肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊中天然免疫相关基因RIG‑I、TLR3、TLR7、IFN‑α、IFN‑β、IL‑1β和TNF‑α、炎症相关基因COX2和iNOS、细胞凋亡相关基因Caspase3的组织表达水平，增强鸭天然免疫反应和抗病性能。

权利要求

1.一种基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂，其特征在于，其序列为：5’-GATATGCGACCGATT-3’。

2.一种权利要求1所述的基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

步骤1、鸭天然免疫增强剂的合成采用化学合成方法合成鸭天然免疫增强剂；

步骤2、鸭天然免疫增强剂的纯化采用变性聚丙烯酰氨凝胶电泳PAGE方法纯化合成的鸭天然免疫增强剂；

步骤3、鸭天然免疫增强剂的浓度计算采用紫外分光光度仪测定鸭天然免疫增强剂溶液在260nm的吸光值，根据公式：DNA浓度＝A260×转化系数×稀释率，计算鸭天然免疫增强剂的浓度。

说明书

一种基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂

技术领域

[0001] 本发明属于农业技术领域，涉及一种基于模式识别受体(PRRs)配体的鸭天然免疫增强剂。

背景技术

[0002] 随着我国畜牧业的高速发展，特别是规模化、集约化养殖方式的普及推广，动物疾病出现了多样化，动物传染性疾病，尤其是病毒性传染病的危害日益突出，不仅严重影响动
物生产，而且可能威胁人类健康。免疫预防和药物治疗是目前防制动物传染病的重要手段，
虽曾发挥重要作用，但由于：①有些病毒具有多种亚型，且病毒抗原极易漂移和转换(如禽
流感病毒)；②在机体免疫压力与环境压力下，一些病毒不断变异，相继出现新的变异株、强
毒株与血清型(如鸭肝炎病毒)；③多种病毒与亚型混合感染日趋普遍。因而，近年来动物免
疫失败时有发生。此外，由于畜牧业中兽药滥用和超标使用现象普遍存在，一方面导致动物
性食品中兽药残留，严重影响人类健康；另一方面，各种养殖场大量排泄物(包括粪便、尿
等)向周围环境排放，兽药又成为环境污染物，给生态环境带来不利影响，引起人们高度关
注。由此可见，传统的动物传染病免疫预防和药物治疗手段受到严重挑战，促使人们不断探
索新的疫病防治途径。

[0003] 天然免疫系统是机体防御的第一道关卡，它们能识别病原微生物，触发细胞内与细胞间的信号通路，对抗病原体感染。宿主的胚系编码的模式识别受体(PRRs)是天然免疫
系统的重要成分，能够通过识别病原相关分子模式(PAMPs)，如微生物鞭毛、肽聚糖、脂多
糖、CpG基序、单链和双链RNA等，释放有抗病原微生物作用的细胞因子(如IFN-β等)，从而诱
导机体产生抗病原微生物天然免疫反应，在控制病原微生物感染和疫病发生过程中发挥重
要作用。自从人类PRRs被发现以来,以调控机体天然免疫和适应性免疫功能，预防和治疗人
类疾病为目的PRRs免疫调控剂的研究在医药界引起巨大反响和广泛研究，为以PRRs为靶
向，研发新型免疫增强剂和靶向治疗药物奠定了基础。目前，多种PRRs激动剂作为人类疫苗
免疫增强剂和治疗药物的安全性和功效已经得到验证，并已在世界各地广泛应用。而动物
PRRs免疫调控剂的研究起步较晚，虽有研究表明一些畜禽PRRs配体具有潜在的免疫调控作
用，可诱导DC活化产生大量IL-12和I型干扰素，在机体天然免疫反应中发挥着十分重要的
作用，但对于其作用的详细机制还不十分清楚，畜禽生产中的应用还鲜有报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂。

[0005] 其具体技术方案为：

[0006] 一种基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂，其序列为：5’-GATATGCGACCGATT-3’。

[0007] 一种本发明所述基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 步骤1、鸭天然免疫增强剂的合成

[0009] 采用化学合成方法合成鸭天然免疫增强剂。

[0010] 步骤2、鸭天然免疫增强剂的纯化

[0011] 采用变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)方法纯化合成的鸭天然免疫增强剂。

[0012] 步骤3、鸭天然免疫增强剂的浓度计算

[0013] 采用紫外分光光度仪测定鸭天然免疫增强剂溶液在260nm的吸光值，根据公式：DNA浓度＝A260×转化系数×稀释率，计算鸭天然免疫增强剂的浓度。

[0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果：

[0015] 本发明提供的基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂，可以显著升高鸭血清细胞因子IL-1β/12p40、IL-1β、IFN-α和IFN-β水平，上调鸭免疫器官肝脏、脾脏、胸腺和法氏
囊中天然免疫相关基因RIG-I、TLR3、TLR7、IFN-α、IFN-β、IL-1β和TNF-α、炎症相关基因COX2
和iNOS、细胞凋亡相关基因Caspase3的组织表达水平，增强鸭天然免疫反应和抗病性能。

具体实施方式

[0016] 下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

[0017] 1.鸭天然免疫增强剂的合成

[0018] 根据动物PRRs家族成员TLR9的配体分子结构，设计与合成鸭天然免疫增强剂。

[0019] 2.试验动物分组与处理

[0020] 选择同批出壳的1日龄雏鸭，适应性喂养7d后，随机分为试验组和对照组，每组20只。其中试验组雏鸭皮下注射合成的鸭天然免疫增强剂(5μg/羽)，对照组雏鸭皮下注射相
同体积的生理盐水，连续3天。实验期间各组雏鸭自由采食、饮水。

[0021] 3.样品采集

[0022] 试验开始后第18天，颈静脉采集血液，室温下分离血清，-20℃冷冻保存；将试验鸭处死，采集肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊等组织器官，立即放入液氮中保存。

[0023] 4.鸭天然免疫反应指标检测

[0024] (1)血清细胞因子和免疫球蛋白水平的检测

[0025] 血清细胞因子IL-1β/12p40、IFN-α和IFN-β和免疫球蛋白IgG、IgA和IgM水平采用ELISA法测定。

[0026] (2)免疫组织器官中天然免疫相关基因的检测

[0027] 肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中天然免疫相关基因RIG-I、TLR3、TLR7、IFN-α、IFN-β、IL-1β和TNF-αmRNA表达水平的检测采用qRT-PCR方法。

[0028] (3)免疫组织器官中炎症相关基因的检测

[0029] 肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA表达水平的检测采用qRT-PCR方法；COX2和iNOS蛋白质水平的检测采用Western Blot方法。

[0030] (4)免疫组织器官中细胞凋亡相关基因的检测

[0031] 肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中细胞凋亡相关基因Bcl2和Caspase3mRNA表达水平的检测采用qRT-PCR方法；、Bcl2和Caspase3蛋白质水平的检测采用Western Blot方法。

[0032] 5.试验结果

[0033] (1)血清细胞因子和免疫球蛋白水平的检测

[0034] 试验组和对照组鸭血清细胞因子IL-1β/12p40、IL-1β、IFN-α和IFN-β和免疫球蛋白IgG、IgA和IgM水平见表1和表2。

[0035] 表1血清细胞因子水平

[0036]

[0037] 表2血清免疫球蛋白水平

[0038]

[0039] 由表1和表2可知，试验组鸭血清细胞因子IL-1β/12p40、IL-1β、IFN-α和IFN-β水平均显著高于对照组，而血清免疫球蛋白IgA、IgG和IgM水平差异不显著。表明合成的鸭天然
免疫增强剂可以显著升高鸭血清细胞因子IL-1β/12p40、IL-1β、IFN-α和IFN-β水平，而对于
血清免疫球蛋白IgA、IgG和IgM水平无显著影响。

[0040] (2)免疫组织器官中天然免疫相关基因的检测

[0041] 试验组和对照组鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中天然免疫相关基因RIG-I、TLR3、TLR7、IFN-α、IFN-β、IL-1β和TNF-αmRNA表达水平见表3～表6。

[0042] 表3肝脏组织中天然免疫相关基因表达水平

[0043]

[0044] 表4脾脏组织中天然免疫相关基因表达水平

[0045]

[0046] 表5胸腺组织中天然免疫相关基因表达水平

[0047]

[0048] 表6法氏囊组织中天然免疫相关基因表达水平

[0049]

[0050]

[0051] 由表3～表6可知，试验组鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中天然免疫相关基因RIG-I、TLR3、TLR7、IFN-α、IFN-β、IL-1β和TNF-αmRNA表达水平均高于或显著高于对照组，表
明合成的鸭天然免疫增强剂可以上调或显著上调鸭免疫器官组织中天然免疫相关基因的
表达水平。

[0052] (3)免疫组织器官中炎症相关基因的检测

[0053] 试验组和对照组鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA与蛋白质表达水平见表7～表10。

[0054] 表7肝脏组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA和蛋白质表达水平

[0055]

[0056] 表8脾脏组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA和蛋白质表达水平

[0057]

[0058] 表9胸腺组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA和蛋白质表达水平

[0059]

[0060] 表10法氏囊组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA和蛋白质表达水平

[0061]

[0062] 由表7～表10可知，试验组鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA与蛋白质表达水平几乎全部(除脾脏中COX2mRNA外)高于或显著高于对照组，
表明合成的鸭天然免疫增强剂可以上调或显著上调鸭免疫器官组织中炎症相关基因COX2
和iNOS mRNA与蛋白质表达水平。

[0063] (4)组织器官中细胞凋亡相关基因的检测

[0064] 试验组和对照组鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中细胞凋亡相关基因Bcl2和Caspase3mRNA与蛋白质表达水平见表11～表14。

[0065] 表11肝脏组织中凋亡相关基因Bcl2和Caspase3mRNA和蛋白质表达水平

[0066]

[0067] 表12脾脏组织中凋亡相关基因Bcl2和Caspase3mRNA和蛋白质表达水平

[0068]

[0069] 表13胸腺组织中凋亡相关基因Bcl2和Caspase3mRNA和蛋白质表达水平

[0070]

[0071]

[0072] 表14法氏囊组织中凋亡相关基因Bcl2和Caspase3mRNA和蛋白质表达水平

[0073]

[0074] 由表11～表14可知，试验组鸭肝脏、胸腺和法氏囊中的Caspase3基因mRNA与蛋白质表达水平、脾脏中Caspase3基因mRNA表达水平均显著高于对照组，而试验组与对照组鸭
Bcl2基因mRNA与蛋白质表达水平之间差异不显著。表明合成的鸭天然免疫增强剂可以上调
鸭免疫器官组织中细胞凋亡相关的Caspase3基因mRNA与蛋白质表达水平，而对Bcl2基因
mRNA与蛋白质表达水平无显著影响。

[0075] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简
单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。