一种具有降解硫化物性能的木糖氧化无色杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株新菌株—木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)AX及其降解硫化物的应用，所述木糖氧化无色杆菌AX保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2019483，保藏日期2019年6月24日；本发明提供了一种具有硫化物降解性能的木糖氧化无色杆菌AX，该菌株在12h内对初始浓度为100mg·L‑1的Na2S降解率达到94.4％，该降解菌的发现对工业废水中硫化物的高效净化具有重要意义。

权利要求

1.一种具有降解硫化物性能的木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans） AX，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2019483，保藏日期2019年6月

24日。

2.一种权利要求1所述木糖氧化无色杆菌AX在生物降解硫化物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将木糖氧化无色杆菌AX经发酵培养获得的发酵液即含菌悬液，按所述发酵液体积的5%‑10%接种至硫化物选择培养基中，得到硫化物降解液；在20‑50℃、120 160 rpm条件下培养，降解硫化物；所述硫化物液体选择培养基的组~

‑1 ‑1 ‑1

成为：硫源100‑500 mg·L ，碳源3800‑4000 mg·L ，氮源480‑500 mg·L ，KH2PO4 1100‑‑1 ‑1 ‑1

1200 mg·L ，K2HPO4 1100‑1200 mg·L ，MgCl2·6H2O 180‑200 mg·L ，柠檬酸铁5‑10 ‑1

mg·L ，溶剂为水，pH值5.0‑9.0。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、甘油、乙醇或乙酸钠。

5.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述氮源为氯化铵、醋酸铵、牛肉膏、蛋白胨或硝酸钠。

6.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述木糖氧化无色杆菌AX处理废水中硫化物以

2‑ ‑

S 、HS形式存在。

7.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述木糖氧化无色杆菌AX经发酵培养获得的发酵液即含菌悬液通过以下方法制备：（1）斜面培养：将木糖氧化无色杆菌AX接种至斜面培养基，30℃培养7天，获得菌体斜‑1 ‑1 ‑1

面；所述斜面培养基组成为：蛋白胨10 g·L ，酵母粉5 g·L ，NaCl 10 g·L ，溶剂为水，‑1

pH值7.0 7.5，琼脂 15 18 g·L ；

~ ~

（2）种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，30℃培养1天，获得种子液；所‑1 ‑1 ‑1

述种子培养基组成为：蛋白胨10 g·L ，酵母粉5 g·L ，NaCl 10 g·L ，溶剂为水，pH值

7.0 7.5；

~

（3）发酵培养：将种子液以体积浓度5 10%的接种量接种至发酵培养基， 30℃培养10~ ‑1 ‑1 ~

12h，获得发酵培养液；所述发酵培养基组成为：蛋白胨10 g·L ，酵母粉5 g·L ，NaCl 10 ‑1

g·L ，溶剂为水，pH值7.0 7.5。

~

说明书

一种具有降解硫化物性能的木糖氧化无色杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一种具有降解硫化物性能的木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans AX)及其应用。

背景技术

[0002] 工农业废水中的硫化物是造成水体发黑发臭的重要原因，该类废水的排放量大，污染负荷高，毒性大，且会对构筑物的正常运转产生很大影响。含硫化物的废水若不经处理
直接排入水体将会危害水生生物，并产生潜在腐蚀性。废水中会有硫化氢气体逸出，这是一
种无色的有毒气体，具有强烈的臭鸡蛋气味，不但会引起人的神经中毒，而且能与大气层的
臭氧反应生成硫酸，形成酸雨，会对环境造成较大的危害。因此，严格控制硫化物的排放以
及研究去除硫化物的处理工艺显得尤为迫切。

[0003] 目前，国内外处理恶臭硫化物废水的方法很多，依其弱酸性和强还原性而进行脱硫可分为物理法、化学法、生物法。每一种方法都有其各自的适用范围和特点，要根据恶臭
物质的来源、浓度、性质及其处理要求确定脱臭方法，在实践中常常采用几种方法结合来处
理恶臭气体。与传统物理化学方法比较，生物净化法可以使污染物得到充分地降解和转化，
且工艺设备简单，管理维护方便，能耗少，运行费用低，二次污染小，近几年来备受青睐。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种具有降解硫化物性能的木糖氧化无色杆菌AX及其应用。

[0005] 本发明采用如下技术方案：一种具有降解硫化物性能的木糖氧化无色杆菌,该木糖氧化无色杆菌命名为AX，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，
保藏编号：CCTCC NO：M 2019483，保藏日期2019年6月24。所述木糖氧化无色杆菌AX菌株的
特征为：菌落颜色为黄色，菌落呈小型单个菌落，圆形，凸起，外缘圆整，半透明，表面湿润单
个，短杆状，该菌株16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

[0006] 一种所述木糖氧化无色杆菌在生物降解硫化物中的应用。

[0007] 进一步地，将木糖氧化无色杆菌经发酵培养获得的发酵液即含菌悬液，按所述发酵液体积的5％‑10％接种至硫化物选择培养基中，得到硫化物降解液。在20‑50℃、120～
160rpm条件下培养，降解硫化物；所述硫化物液体选择培养基的组成为：硫源100‑500mg·
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
L ，碳源3800‑4000mg·L ，氮源480‑500mg·L ，KH2PO4 1100‑1200mg·L ，K2HPO4 1100‑
‑1 ‑1 ‑1
1200mg·L ，MgCl2·6H2O 180‑200mg·L ，柠檬酸铁5‑10mg·L ，溶剂为水，pH值5.0‑9.0。

[0008] 进一步地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、甘油、乙醇或乙酸钠。

[0009] 进一步地，所述氮源为氯化铵、醋酸铵、牛肉膏、蛋白胨或硝酸钠。

[0010] 进一步地，所述硫化物的浓度为100‑500mg·L‑1。

[0011] 进一步地，所述木糖氧化无色杆菌处理废水中硫化物以S2‑、HS‑形式存在。

[0012] 进一步地，所述木糖氧化无色杆菌经发酵培养获得的发酵液即含菌悬液通过以下方法制备：

[0013] (1)斜面培养：将木糖氧化无色杆菌AX接种至斜面培养基，30℃培养7天，获得菌体‑1 ‑1 ‑1
斜面；所述斜面培养基组成为：蛋白胨10g·L ，酵母粉5g·L ，NaCl 10g·L ，溶剂为水，
‑1
pH值7.0～7.5，琼脂15～18g·L 。

[0014] (2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，30℃培养1天，获得种子‑1 ‑1 ‑1
液；所述种子培养基组成为：蛋白胨10g·L ，酵母粉5g·L ，NaCl 10g·L ，溶剂为水，pH
值7.0～7.5；

[0015] (3)发酵培养：将种子液以体积浓度5～10％的接种量接种至发酵培养基，30℃培‑1 ‑1
养10～12h，获得发酵培养液；所述发酵培养基组成为：蛋白胨10g·L ，酵母粉5g·L ，
‑1
NaCl 10g·L ，溶剂为水，pH值7.0～7.5。

[0016] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种高效、耐热能力强的木糖氧化‑1
无色杆菌AX及其硫化物降解的应用，该菌株在12h内能对初始浓度为100mg·L 的Na2S降解
效率达到94.4％，该降解菌对工业废水中硫化物的高效净化具有重要意义。

附图说明

[0017] 图1为菌株AX的透射电镜照片：A为菌体形态照片和B革兰氏染色照片；

[0018] 图2为菌株AX的系统发育树图；

[0019] 图3不同碳源下菌株AX对硫化物降解性能比较；

[0020] 图4不同氮源下菌株AX对硫化物降解性能比较；

[0021] 图5不同pH下菌株AX对硫化物降解性能比较；

[0022] 图6不同底物浓度下菌株AX对硫化物降解性能比较；

[0023] 图7不同温度下菌株AX对硫化物降解性能比较。

具体实施方式

[0024] 以下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

[0025] 实施例1：木糖氧化无色杆菌株AX(Achromobacter xylosoxidans AX)的分离、纯化及其鉴定

[0026] (1)Achromobacter xylosoxidans AX的分离及纯化

[0027] 从浙江卫星能源有限公司废水处理池污泥中筛选木糖氧化无色杆菌株AX，具体步骤如下：

[0028] 取浙江卫星能源有限公司污水中污泥，静置24h后，滤去上清液，取下层污泥10mL接种于含100mL硫化物液体选择培养基250mL培养瓶中，培养温度30℃，160rpm振荡培养
24h，将菌液离心分离，收集菌体，用无菌水配制成一定浓度的菌液。将所得到的菌液用Na2S
固体选择培养基经多次平板划线分离纯化，得到单菌落即还原菌种，记为菌株AX。

[0029] 配制硫化物液体选择培养基，配制方法如下：硫源100mg·L‑1，葡萄糖5g·L‑1，‑1 ‑1 ‑1
KH2PO4 1200mg·L ，K2HPO4·3H2O 1570mg·L ，MgCl2·6H2O 200mg·L ，NH4Cl 1000mg·
‑1 ‑1
L ，柠檬酸铁10mg·L ，溶剂为水，pH值7.5～8.0，121℃灭菌20min。

[0030] (2)菌株AX的鉴定

[0031] a、菌株AX的生理生化特征

[0032] 菌落颜色为黄色，菌落呈小型单个菌落，圆形，凸起，外缘圆整，半透明，表面湿润单个，短杆状。透射电镜下观察该菌体的形态为杆菌(图1中A所示)，具有鞭毛，革兰氏染色
阴性(图1中B所示)，氧化酶阳性，接触酶阳性。它生长最适pH值为8.0，最适温度为40℃。

[0033] b、菌株AX的16S rRNA序列分析

[0034] 通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株AX为Achromobacter xylosoxidans，具体步骤如下：

[0035] 采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取和纯化菌株AX的DNA，4℃保存。选用细菌的通用引物F27和1492R对纯化的DNA进行
PCR扩增，引物序列分别为：

[0036] F27：5’‑AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG‑3’

[0037] 1492R：5’‑GGT TAC CTT GTT ACG ACT T‑3’

[0038] PCR反应体系为(50μL)：模板DNA 1.75μL，引物F27和引物R1492各1μL，MgCl2‑1 ‑1 ‑1
(25mmol·L )3μL，Taq酶(5U·μL )0.25μL，10×PCR缓冲液5μL，dNTP(2.5mmol·L )4μL，
重蒸水34μL。

[0039] PCR反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序
(浙江天科生物科技有限公司)，测序结果见序列SEQ ID NO：1所示。

[0040] 将AX的16S rRNA序列上传到Genbank，获得Genbank的登录号MN108144，同时同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Achromobacter属，与Achromobacter 
xylosoxidans(CP006958)同源性最高，达到92％，图2为该菌株的系统发育树图。为了进一
步确定鉴定结果的可靠性，经过生理生化实验，最终确定菌株AX属于Achromobacter 
xylosoxidans，因此，将该菌株命名为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)
AX。

[0041] 实施例2木糖氧化无色杆菌AX发酵培养液

[0042] (1)斜面培养：将木糖氧化无色杆菌AX接种至斜面培养基，30℃培养7天，获得菌体‑1 ‑1 ‑1
斜面；所述斜面培养基组成为：蛋白胨10g·L ，酵母粉5g·L ，NaCl 10g·L ，溶剂为水，
‑1 ‑1 ‑1
通过1mol·L 盐酸和1mol·L 氢氧化钠调节pH值为7.0，琼脂粉15g·L 。

[0043] (2)种子培养：从菌体斜面挑取菌落接种至种子培养基，30℃培养1天，获得种子‑1 ‑1 ‑1
液；所述种子培养基组成为：蛋白胨10g·L ，酵母粉5g·L ，NaCl 10g·L ，溶剂为水，通
‑1 ‑1
过1mol·L 盐酸和1mol·L 氢氧化钠调节pH值为7.0。

[0044] (3)发酵培养：将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，30℃培养‑1
12h，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基中各组分的浓度为：蛋白胨10g·L ，
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
酵母粉5g·L ，NaCl 10g·L ，溶剂为水，通过1mol·L 盐酸和1mol·L 氢氧化钠调节pH
值为7.0。

[0045] 实施例3木糖氧化无色杆菌AX发酵培养液

[0046] (1)斜面培养：将木糖氧化无色杆菌AX接种至斜面培养基，30℃培养7天，获得菌体‑1 ‑1 ‑1
斜面；所述斜面培养基浓度组成为：蛋白胨10g·L ，酵母粉5g·L ，NaCl 10g·L ，溶剂为
‑1 ‑1 ‑1
水，通过1mol·L 盐酸和1mol·L 氢氧化钠调节pH值为7.5，琼脂粉18g·L 。

[0047] (2)种子培养：从菌体斜面挑取菌落接种至种子培养基，30℃培养1天，获得种子‑1 ‑1 ‑1
液；所述种子培养基组成为：蛋白胨10g·L ，酵母粉5g·L ，NaCl 10g·L ，溶剂为水，通
‑1 ‑1
过1mol·L 盐酸和1mol·L 氢氧化钠调节pH值为7.5。

[0048] (3)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，30℃培养‑1
10h，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基中各组分的浓度为：蛋白胨10g·L ，
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
酵母粉5g·L ，NaCl 10g·L ，溶剂为水，通过1mol·L 盐酸和1mol·L 氢氧化钠调节pH
值为7.5。

[0049] 由实施例2‑实施例3培养得到的木糖氧化无色杆菌AX发酵培养液，木糖氧化无色杆菌在LB液体培养基中培养12小时，其OD600为1.3，说明具有较高的活性。

[0050] 实施例4：Achromobacter xylosoxidans AX硫化物降解性能检测

[0051] (1)考察不同碳源下木糖氧化无色杆菌AX对硫化物的降解性能

[0052] 在不同碳源下实施木糖氧化无色杆菌降解硫化物的实验，结果表明最佳碳源为葡萄糖，具体实施步骤如下：

[0053] 以硫化钠为唯一硫源(浓度100mg·L‑1)，按体积浓度5％接种量将OD600为1.2的发酵含菌悬液培养液(实施例2方法制备)接种于不同碳源的Na2S液体选择培养基A1、B1、C1、
D1、E1，其中碳源分别为葡萄糖、蔗糖、乙醇、甘油和乙酸钠，所述液体选择培养基组成为：碳
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
源均为3800mg·L ，硫源100mg·L ，氮源480mg·L ，KH2PO4 1100mg·L ，K2HPO4 
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
1100mg·L ，MgCl2·6H2O 180mg·L ，柠檬酸铁5mg·L ，溶剂为水，通过1mol·L 盐酸和
‑1
1mol·L 氢氧化钠调节pH值为7.0。在30℃，160rpm振荡培养12h，获得培养液，采用亚甲基
蓝分光光度法测定硫化物的浓度，即取3mL培养液作为样品，先将样品通过孔径为0.22μm的
细菌过滤器过滤去除微生物，然后取滤液用紫外分光光度计测出其在665nm波长下的吸光
度值。

[0054] 碳源为微生物的生长提供重要的能源，并构成微生物的细胞物质。不同的碳源因其结构和分子量不同，对微生物还原的影响程度也不尽相同。结果如图3所示，碳源为葡萄
糖时，12h菌株AX对硫化物的降解率达到90.64％，其他碳源也能促进菌株AX对硫化物的降
解，但降解效果不如葡萄糖，原因为葡萄糖是小分子物质，易被细菌吸收利用，葡萄糖作为
碳源可能更适合脱硫酶的合成，从而使降解率较大。其它碳源可能不利于菌体对其吸收利
用，导致降解效率偏低。

[0055] 2.考察不同氮源下木糖氧化无色杆菌AX对硫化物的降解性能

[0056] 在不同氮源下实施木糖无色杆菌降解硫化物的实验，结果表明其最佳氮源为氯化铵，具体实施方案如下：

[0057] 以硫化钠为唯一硫源(浓度500mg·L‑1)，按体积浓度5％接种量将OD600为1.2的发酵含菌悬液(实施例3方法制备)接种于不同氮源的Na2S液体选择培养基，其中氮源分别为
氯化铵、醋酸铵、牛肉膏、蛋白胨、硝酸钠，所述液体选择培养基的组成为：氮源均为480mg·
‑1 ‑1 ‑1 ‑1 ‑1
L ，碳源均为4000mg·L ，硫源500mg·L ，，KH2PO4 1200mg·L ，K2HPO4 1200mg·L ，
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
MgCl2·6H2O 200mg·L ，柠檬酸铁10mg·L ，溶剂为水，通过1mol·L 盐酸和1mol·L 氢
氧化钠调节pH值为9。在30℃，160rpm振荡培养12h，获得培养液，采用亚甲基蓝分光光度法
测定硫化物的浓度，即取3mL培养液作为样品，先将样品通过孔径为0.22μm的细菌过滤器过
滤去除微生物，然后取滤液用紫外分光光度计测出其在665nm波长下的吸光度值。

[0058] 结果如图4所示，氮源为氯化铵时，12h菌株AX对硫化物的降解率达到91％，其他氮源也能促进菌株AX对硫化物的降解，但降解效果不如氯化铵，原因是：氯化铵可能更利于脱
硫酶的合成。蛋白胨、牛肉膏属于有机氮源，文献曾提及：有机氮源更有利于细胞的生长，但
是不一定有利于酶的合成。

[0059] 3.考察不同pH下木糖氧化无色杆菌AX对硫化物的降解性能

[0060] 在不同pH下实施木糖氧化无色杆菌AX对硫化物的降解实验，结果表明其最佳pH为8.0，具体实施方案如下：

[0061] 以NaHS为唯一硫源(浓度200mg·L‑1)，按体积浓度5％接种量将OD600为1.2的发酵含菌悬液(实施例2方法制备)接种于不同pH的NaHS液体选择培养基，所述液体选择培养基
‑1 ‑1 ‑1
的组成为：氮源为500mg·L ，碳源均为3800mg·L ，硫源200mg·L ，，KH2PO4 1200mg·L
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
，K2HPO4 1200mg·L ，MgCl2·6H2O 200mg·L ，柠檬酸铁10mg·L ，溶剂为水，通过
‑1 ‑1
1mol·L 盐酸和1mol·L 氢氧化钠调节液体选择培养基的pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0
和9.0。在30℃，160rpm振荡培养12h，获得培养液，采用亚甲基蓝分光光度法测定硫化物的
浓度，即取3mL培养液作为样品，先将样品通过孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤去除微生
物，然后取滤液用紫外分光光度计测出其在665nm波长下的吸光度值。

[0062] 结果如图5所示，pH值为8.0时，12h菌株AX对硫化物的降解率达到90.3％。，其他PH也能促进菌株AX对硫化物的降解，但降解效果不如PH为8时的培养基的降解效果，原因为pH
为8时，更有利于菌株的生长，当细菌量较大时，降解效率相应的会较好，但是在碱性条件
下，由于中和作用导致大量的S在液相中积累，菌体生长被抑制，导致降解效率较低。

[0063] 4.考察不同硫化物浓度下木糖氧化无色杆菌AX对硫化物的降解性能

[0064] 在不同Na2S浓度下实施木糖氧化无色杆菌AX对硫化物的降解实验，具体实施方案如下：

[0065] 以硫化钠为唯一硫源，按体积浓度5％接种量将OD600为1.2的发酵含菌悬液(实施‑1
例3方法制备)接种于不同Na2S浓度的液体选择培养基，所述Na2S浓度分别为100mg·L ，
‑1 ‑1 ‑1 ‑1 ‑1
150mg·L ，200mg·L ，300mg·L ，400mg·L ，500mg·L ，所述液体选择培养基的组成
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
均为：氮源为480mg·L ，碳源均为4000mg·L ，KH2PO4 1200mg·L ，K2HPO4 1200mg·L ，
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
MgCl2·6H2O 200mg·L ，柠檬酸铁10mg·L ，溶剂为水，通过1mol·L 盐酸和1mol·L 氢
氧化钠调节液体选择培养基的pH值分别为8.0。在30℃，160rpm振荡培养12h，获得培养液，
采用亚甲基蓝分光光度法测定硫化物的浓度，即取3mL培养液作为样品，先将样品通过孔径
为0.22μm的细菌过滤器过滤去除微生物，然后取滤液用紫外分光光度计测出其在665nm波
长下的吸光度值。

[0066] 结果如图6所示，在12h后菌株AX对高浓度硫化物的降解率达到了52％。

[0067] 5.考察不同温度下木糖氧化无色杆菌AX对硫化物的降解性能

[0068] 在不同温度下实施木糖氧化无色杆菌AX对硫化物的降解实验，结果表明在40℃下菌株AX对硫化物的降解率最高，具体实施方案如下：

[0069] 以硫化钠为唯一硫源，考察不同温度下木糖氧化无色杆菌AX对硫化物的降解性能，按体积浓度5％接种量将OD600为1.2的含菌悬液(实施例2方法制备)接种于Na2S液体选
‑1
择培养基，所述液体选择培养基的浓度组成均为：氮源为480mg·L ，碳源均为4000mg·L
‑1 ‑1 ‑1 ‑1 ‑1
，KH2PO4 1200mg·L ，K2HPO4 1200mg·L ，MgCl2·6H2O 200mg·L ，柠檬酸铁10mg·L ，
‑1 ‑1
溶剂为水，通过1mol·L 盐酸和1mol·L 氢氧化钠调节液体选择培养基的pH值分别为
8.0。于不同温度下，分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和50℃，160rpm振荡培养12h，获得
培养液，采用亚甲基蓝分光光度法测定硫化物的浓度，即取3mL培养液作为样品，先将样品
通过孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤去除微生物，然后取滤液用紫外分光光度计测出其在
665nm波长下的吸光度值。

[0070] 结果如图7所示，在40℃下，12h后菌株AX对硫化物的降解率达到了94.4％。