一株多环芳烃降解菌及其筛选方法与应用

摘要

一株多环芳烃降解菌及其筛选方法与应用，涉及海洋石油烃降解菌。为转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX，转化异源物食烷菌为革兰氏染色阴性的食烷菌属的菌株，生物学特性为非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm，最适生长条件为：pH＝7.0～8.5，温度25～28℃；可在降解有机化合物中应用。经鉴定，一株转化异源物食烷菌的16S rDNA基因序列于模式菌株Alcanivorax xenomutans JC109(T)，相似度为99.93％。

权利要求

1.一株多环芳烃降解菌，其特征在于为转化异源物食烷菌（Alcanivorax xenomutans）

45II‑AX，所述转化异源物食烷菌（Alcanivorax xenomutans）45II‑AX为革兰氏染色阴性的食烷菌属的菌株，生物学特性为非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm，最适生长条件为：pH=7.0～8.5，温度25～28℃；所述转化异源物食烷菌（Alcanivorax xenomutans）45II‑AX已于2019年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 18723。

2.如权利要求1所述一株多环芳烃降解菌，其16S rRNA核苷酸序列为：tggtgcaatccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcattctgatccgcgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgattggctttgagagattagctccgcctcgcgacctcgcaaccctctgtaccaaccattgtagcacgtgtgtagcccaggccgtaagggccatgatgacttgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctccctagagttcccacccgaagtgctggcaactaaggacaagggttgcgctcgttacgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtcactgcgctcccgaaggcaccaatctatctctagaaagttcgcaggatgtcaaggcctggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtctacttatcgcgttagctgcgccaccaaagtcactaaggaccccaacggctagtagacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagcgtcagtgtcagtccaggaggccgccttcgccactggtgttccttccgatctctacgcatttcaccgctacaccggaaattccacctccctctactgcactctagcgtgccagtatcggatgcaattccaaggttgagccctgggctttcacatccgacttaacacaccgcctacgcgcgctttacgcccagtaattccgattaacgctcgcacctttcgtattaccgcggctgctggcacgaaattagccggtgcttcttctgtaggtaacgtcaagtactccagggtattagcccaaagccttcctccctactgaaagtgctttacaacccgaaggccttcttcacacacgcggcatggctggatcaggcttgcgcccattgtccaagattccccactgctgcctcccgtaggagtccgggccgtgtctcagtcccggtgtgactggccatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtgggccattaccccaccaacaagctaatccgacgcgggctcatccatcagcgcaaggtccgaagatcccctgctttcccccgtagggattatgcggtattagctcgagtttccccgagttatcccccactaatgggcagattcccacgtgttactcacccgtccgccgctcgacgcctggga。

3.如权利要求1所述一株多环芳烃降解菌在降解有机化合物中应用， 所述有机化合物为石油烃类化合物。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于所述石油烃类化合物为多环芳烃类化合物。

说明书

一株多环芳烃降解菌及其筛选方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及海洋石油烃降解菌，尤其是涉及一株多环芳烃石降解菌及其筛选方法与应用。

背景技术

[0002] 由于原油中含有不稳定的碳氢化合物，包括多环芳烃、甲苯、乙苯和二甲苯，这些有害物质可以通过呼吸、皮肤吸收和眼球进入人体内的血管中，有可能引起恶心、头痛、头
晕等不适的感觉，甚至致癌，所以这次溢油事件对于附近居民的健康存在很大的威胁。溢油
污染事故还会引起大面积海域严重缺氧，破坏海洋生产力，致使大量鱼、虾、贝类和海鸟死
亡，造成局部“海洋荒漠化”；浮油被海浪冲到海岸，粘污海滩，造成海滩荒芜，破坏海产养殖
和盐田生产，污染或毁坏滨海旅游区，降低海洋生态系统的服务功能和价值。石油污染物的
生物富集作用不仅对海洋生物有毒害作用，可以通过食物链最终富集在人体内，从而对人
类健康造成严重的危害。随着社会的不断发展，人类对石化产品的不断开发利用，致使环境
中多环芳烃污染物浓度在逐年增加，已经威胁到人类的身体健康。存在于环境中的多环芳
烃有天然和人为的两种来源。天然来源包括：某些细菌、藻类和植物的生物合成产物；森林、
草原燃起的野火及火山喷发物；从化石燃料、木质素、底泥等散发出多环芳烃是长期地质年
代间由生物降解物再合成的产物。多环芳烃是最早发现且为数最多的一类化学致癌物，可
以引起正常细胞发生转化并发展成肿瘤。目前已对2000多种化合物做了实验，发现有致癌
作用的达500多种，其中200多种为多环芳烃及其衍生物(张志家,金祖亮,竺酒恺,徐晓强
.1990)。

[0003] 多环芳烃在环境中的归宿包括挥发、光氧化、化学氧化、生物积累、土壤吸附及微生物降解等。多环芳烃在自然界中发生的化学反应可分为取代反应和加成反应，即分子中
的不饱和化学键被破坏，生成较稳定的化合物(Cerniglia,C.E.1992)。此外，多环芳烃在自
然环境中的反应大多是光氧化反应，在自然光或人造紫外线的照射下，多环芳烃会与氧气、
臭氧或其它氧化剂反应生成内环过氧化物。多环芳烃还非常容易与大气特别是气溶胶中的
SO2、SO3、或硫酸反应，生成水溶性的磺酸、亚磺酸和双磺酸。但诸多研究表明，微生物降解在
PAHs的迁移转化乃至最终从环境中消失的过程中占有重要的地位，是环境中多环芳烃去除
最主要的途径(Gibson,D.T.,Mahadevan,V.,Jerina,R.M.,et al.1975)。

发明内容

[0004] 本发明的第一目的在于提供一株多环芳烃降解菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX。

[0005] 本发明的第二目的在于提供一株多环芳烃降解菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX的筛选方法。

[0006] 本发明的第三目的在于提供一株多环芳烃降解菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX 16SrRNA核苷酸序列。

[0007] 本发明的第四目的在于提供一株多环芳烃降解菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX可降解石油烃和高环多环芳烃(芘和苯并芘等)，可用于在石油或多环芳烃污染的
盐碱性土壤的治理以及发生漏油事故海域等中应用。

[0008] 所述一株多环芳烃降解菌为转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX，所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX为革兰氏染色阴性的食烷
菌属的菌株，生物学特性为非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈圆形，黄色
不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm，最适生长条件为：pH＝
7.0～8.5，温度25～28℃；所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX已于
2019年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝
阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：
CGMCC No.18723。

[0009] 所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX筛选自太平洋深海沉积物，样品编号45II‑CC‑S06‑MC01，距沉积物表层4～6cm，大洋45航次第二航段CC海
区，153°23.1205′W，12°58.1135′N，沉积物为黄褐色，无味，弱黏性，表层呈半流动状，手搓
略有粉砂感，太平洋深海沉积物样品在无菌收集后低温保存。

[0010] 所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX的筛选方法包括以下步骤：

[0011] 1)取大洋表层海水用121℃高压蒸汽灭菌20min后加入1％体积的无菌NH4NO3溶液和KH2PO4溶液及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4，所得培养基pH值约为7.5；

[0012] 在步骤1)中，所述NH4NO3溶液的加入量可为100g/L；所述KH2PO4溶液的加入量可为10g/L，pH可为6.7；所述FeSO4的加入量可为0.4g/L。

[0013] 2)接种前加入1％(V/V)多环芳烃和烷烃(碳源浓度为40mg/L)，培养物在28℃条件下进行初步富集培养，待富集物中培养基均变浑浊，说明烷烃和多环芳烃部分被降解，此时
转接第二次，第三次转接到30天时准备分离单菌；

[0014] 在步骤2)中，所述多环芳烃和烷烃中碳源的浓度可为40mg/L。

[0015] 3)取第三次转接即第四轮富集30天时的培养物涂布到HLB固体培养基平板上，28℃温箱培养一周后从平板上挑出不同形态的菌落，分离纯化，提取DNA，进行16s测序，即得
转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX。

[0016] 在步骤3)中，所述HLB固体培养基的组分可为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠30g，琼脂粉15g/L，去离子水1L，pH6.9～7.1。

[0017] 所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX 16S rRNA核苷酸序列可为：

[0018] tggtgcaatccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcattctgatccgcgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgattggctt
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[0019] 所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX可在降解有机化合物中应用，所述有机化合物可为石油烃类化合物等；所述石油烃类化合物可为多环芳烃
等芳烃类化合物。

[0020] 经鉴定，一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX的16S rDNA基因序列于模式菌株Alcanivorax xenomutans JC109(T)，相似度为99.93％，且在系统发
育树上形成共同一枝，因此命名为Alcanivorax xenomutans 45II‑AX，可降解石油烃和高
环多环芳烃(芘和苯并芘等)，可用于在石油或多环芳烃污染的盐碱性土壤的治理以及发生
漏油事故海域等中应用。

附图说明

[0021] 图1为本发明所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX的菌落宏观形态图。

[0022] 图2为本发明所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX的系统发育分析树。

[0023] 图3为本发明所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX的多环芳烃降解率。

[0024] 图4为本发明所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX的烷烃降解率。

具体实施方式

[0025] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

[0026] 实施例1：菌株形态特征

[0027] 将单菌落划线接种至HLB固体培养基中，将平板倒置于恒温培养箱内，28℃培养48h，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm，参
见图1。

[0028] 实施例2：菌株的筛选和鉴定

[0029] (1)太平洋深海沉积物(样品编号45II‑CC‑S06‑MC01，距沉积物表层4～6cm，大洋45航次第二航段CC海区，153°23.1205′W，12°58.1135′N)，沉积物为黄褐色，无味，弱黏性，
表层呈半流动状，手搓略有粉砂感。沉积物样品在无菌收集后，经低温保存后运送至实验室
进行下一阶段研究工作。

[0030] 取大洋表层海水用121℃高压蒸汽灭菌20min后加入1％体积的无菌NH4NO3溶液(100g/L)和KH2PO4溶液(10g/L，pH6.7)及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4(0.4g/L)，最后
所得培养基pH值约为7.5。接种前加入1％(V/V)多环芳烃(碳源浓度为40mg/L)和烷烃，培养
物在28℃条件下进行初步富集培养。待富集物中培养基均变浑浊，说明多环芳烃和烷烃部
分被降解。此时转接第二次，第三次转接到30天时准备分离单菌。取第三次转接即第四轮富
集30天时的培养物涂布到HLB平板上，28℃温箱培养一周后从平板上挑出不同形态的菌落，
分离纯化，获得食烷菌的纯菌。

[0031] 提取该菌的基因组DNA并以此为模板采用通用27F，1492R引物扩增16S rDNA片段，并在EZ Biocloud上选取高相似度序列，用MEGA‑X计算出序列的系统进化距离，构建系统发
育树(NJ)，参见图2。

[0032] 实施例3：菌株多环芳烃和烷烃降解能力测定

[0033] 取大洋表层海水用121℃高压蒸汽灭菌20min后加入1％体积的无菌NH4NO3溶液(100g/L)和KH2PO4溶液(10g/L，pH6.7)及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4(0.4g/L)，最后
所得培养基pH值约为7.5。接种前加入1％(V/V)烷烃和多环芳烃(碳源浓度为50mg/L)

[0034] 培养五天后打开瓶口，通过GC‑MS(气相色谱‑质谱联用仪)得到样品的质量谱图，测得菲残余量，得到降解率为50％～60％。测得芘残余量，得到降解率为60％～70％。16烷
降解率10％～20％，12烷降解率15％～25％，柴油降解率10～15％。多环芳烃降解率参见图
3，烷烃降解率参见图4。