一种超高效液相色谱-串联质谱检测血清睾酮激素的试剂盒

摘要

本发明提供了一种超高效液相色谱‑串联质谱检测血清睾酮激素的试剂盒，属于激素检测技术领域，所述试剂盒包括标准品溶液、内标溶液、稀释液、萃取液、解离剂、稳定剂、质控品和色谱柱；所述萃取液包括第一萃取液和第二萃取液；所述第一萃取液为乙酸乙酯与正己烷的混合液；所述第二萃取液为正己烷；所述解离剂为0.4～0.6mol/L的乙酸铵水溶液；所述的稳定剂为0.1～0.3mol/L碳酸钠水溶液。采用本发明所述的试剂盒检测睾酮含量的线性范围、检出限、回收率和精密度均满足要求，灵敏度高、特异性强、准确可靠，可应用于临床血清样本中睾酮激素的定量检测。

权利要求

1.一种高效液相色谱-串联质谱检测血清睾酮激素的试剂盒，其特征在于，包括标准品溶液、内标溶液、稀释液、萃取液、解离剂、稳定剂、质控品和色谱柱；

所述萃取液包括第一萃取液和第二萃取液；所述第一萃取液为乙酸乙酯与正己烷的混合液；所述第二萃取液为正己烷；

所述解离剂为0.4～0.6mol/L的乙酸铵水溶液；

所述的稳定剂为0.1～0.3mol/L碳酸钠水溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述萃取液中乙酸乙酯与正己烷的体积比为(2.5～3.5):2。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品包括第一标准品和第二标准品；所述第一标准品为100ng/mL的睾酮标准溶液；所述第二标准品为10ng/mL的睾酮标准溶液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内标溶液为包括8000～12000pg/mL睾酮-d3的甲醇溶液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内标溶液为包括10000pg/mL睾酮-d3的甲醇溶液。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品为包括睾酮的空白血清基质溶液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品包括第一质控品、第二质控品和第三质控品；所述第一质控品中睾酮的浓度为80～120pg/mL，所述第二质控品中睾酮的浓度为1800～2200pg/mL，所述第三质控品中睾酮的浓度为7500～8500pg/mL。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第一质控品中睾酮的浓度为100pg/mL，所述第二质控品中睾酮的浓度为2000pg/mL，所述第三质控品中睾酮的浓度为8000pg/mL。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述色谱柱为UPLC C18色谱柱；所述色谱柱的内径为1.0～2.1mm，所述色谱柱的长度为30～150mm，所述色谱柱的填料粒径为1.4～2.0μm。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液包括第一稀释液和第二稀释液；所述第一稀释液为空白血清基质溶液，所述第二稀释液为甲醇。

说明书

一种超高效液相色谱-串联质谱检测血清睾酮激素的试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于激素检测技术领域，尤其涉及一种高效液相色谱-串联质谱检测血清睾酮激素的试剂盒。

背景技术

[0002] 睾酮是一种类固醇激素，作为内源性激素及同化激素，具有增强肌肉力量、增强免疫力、对抗骨质疏松等功效。血清中睾酮激素的检测在成人及儿科内分泌学和肿瘤学中具有重要的意义。在男性中，睾酮分析主要用于确诊性腺功能低下，还用于评估青春期延迟或性早熟的男孩并监测睾酮治疗的适当性。在女性中，睾酮分析可用于评估雄激素过多症(例如特发性多毛症，先天性肾上腺皮质增生，多囊卵巢综合征和雄激素分泌型卵巢或肾上腺肿瘤)，以及雄激素缺乏症。睾酮在女性和儿童体内的循环浓度非常低(比正常男性低一个数量级)，对于成年女性通常低于0.5ng/mL，儿童和接受抗雄激素治疗的男性，血清中睾酮的含量一般低于0.1ng/mL。因此，要求睾酮激素的检测方法具有高灵敏度。

[0003] 目前，临床生物样品中内源性激素的测定方法主要采用化学发光免疫法等免疫分析法，但由于免疫分析法中同一抗体可能与多种抗原发生反应，导致其灵敏度与准确度都不足。特别是在儿童和女性的睾酮浓度检测中，免疫分析法结果的准确度与重复性很差。液相色谱串联质谱分析技术因具有高选择性、高准确度和高灵敏度等特点，已经成为了内源性激素检测的重要手段。但目前所开发出来的质谱检测方法的性能仍不足以满足临床检测的需求，对比常规临床质谱分析和检测参考标准的研究表明，方法间的精密度和准确度存在差异，因此，需要开发新的准确性好、灵敏度高基于质谱的通量测量男性、女性和儿童的睾酮激素的检测方法。

[0004] 对于血清中类固醇激素的准确定量检测而言，前处理至关重要，由于血清中的激素含量较低，前处理过程必须能够从血清基质中高效提取目标物，并在保留、浓缩目标物的前提下去除尽可能多的杂质。在LC-MS/MS分析中，血清基质中的酯类等成分的存在会产生离子抑制，进而降低目标离子的信号响应值。现有的检测方法多数均需要使用不低于500μL的样品量来满足血清样品中目标物的信号响应。因此，需要开发一种适用于低样品量且能高效提取目标物和最大化去除多余杂质的前处理方法。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于一种样品提取效率高、杂质去除率高、样品使用量低、操作简便的利用高效液相色谱-串联质谱检测血清睾酮激素的试剂盒。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种高效液相色谱-串联质谱检测血清睾酮激素的试剂盒，包括标准品溶液、内标溶液、稀释液、萃取液、解离剂、稳定剂、质控品和色谱柱；

[0008] 所述萃取液包括第一萃取液和第二萃取液；所述第一萃取液为乙酸乙酯与正己烷的混合液；所述第二萃取液为正己烷；

[0009] 所述解离剂为0.4～0.6mol/L的乙酸铵水溶液；

[0010] 所述的稳定剂为0.1～0.3mol/L碳酸钠水溶液。

[0011] 优选的，所述萃取液中乙酸乙酯与正己烷的体积比为(2.5～3.5):2。

[0012] 优选的，所述标准品包括第一标准品和第二标准品；所述第一标准品为100ng/mL的睾酮标准溶液；所述第二标准品为10ng/mL的睾酮标准溶液。

[0013] 优选的，所述内标溶液为包括8000～12000pg/mL睾酮-d3的甲醇溶液。

[0014] 优选的，所述内标溶液为包括10000pg/mL睾酮-d3的甲醇溶液。

[0015] 优选的，所述质控品为包括睾酮的空白血清基质溶液。

[0016] 优选的，所述质控品包括第一质控品、第二质控品和第三质控品；所述第一质控品中睾酮的浓度为80～120pg/mL，所述第二质控品中睾酮的浓度为1800～2200pg/mL，所述第三质控品中睾酮的浓度为7500～8500pg/mL。

[0017] 优选的，所述第一质控品中睾酮的浓度为100pg/mL，所述第二质控品中睾酮的浓度为2000pg/mL，所述第三质控品中睾酮的浓度为8000pg/mL。

[0018] 优选的，所述色谱柱为UPLC C18色谱柱；所述色谱柱的内径为2.1mm，所述色谱柱的长度为100mm，所述色谱柱的填料粒径为1.7μm。

[0019] 优选的，所述稀释液包括第一稀释液和第二稀释液；所述第一稀释液为空白血清基质溶液，所述第二稀释液为甲醇。

[0020] 本发明的有益效果：本发明提供的试剂盒能够快速准确的对血清中睾酮激素进行检测，具有灵敏度高、特异性好、样品使用量低的优点。本发明中使用乙酸铵作为解离剂，睾酮激素主要与血清蛋白结合，所述解离剂能够将睾酮激素与结合蛋白完全解离，同时也避免了内标与结合蛋白的不完全平衡，从而使分析物回收率趋于一致，提高试剂盒检测的精密度；本发明使用碳酸钠作稳定剂同时使用正己烷萃取，能够大量去除酸性杂质，例如脂肪酸和磷脂，避免极性脂质在色谱柱上聚集，提高分离效果，降低离子抑制，所述试剂盒在使用过程中进行了两次萃取，提高了精密度和色谱分离的一致性。所述试剂盒在使用过程中虽然进行了二次萃取，但萃取效率达到了80％，足以定量测定低浓度的睾酮激素。

[0021] 进一步的本发明采用乙酸乙酯正己烷作为萃取剂，比醚类安全性更高。另外，现有的基于质谱的睾酮检测方法样品使用量多在500μL以上，而本发明所述试剂盒只使用100μL血清样本即可达到低睾酮浓度的检测目的。

[0022] 采用本发明所述试剂盒检测血清中的睾酮，样品前处理更加方便，与现有的检测手段相比，本发明所述试剂盒的检测方法提高了检测灵敏度，增加了方法回收率，所需分析时间更短，更有利于开展大批量的样本检测，适合用于人群中相关疾病的筛查。

附图说明

[0023] 图1为血清中睾酮激素的MRM图；

[0024] 图2为血清中睾酮-d3的MRM图。

具体实施方式

[0025] 本发明提供了一种高效液相色谱-串联质谱检测血清睾酮激素的试剂盒，包括标准品溶液、内标溶液、稀释液、萃取液、解离剂、稳定剂、质控品和色谱柱；所述萃取液包括第一萃取液和第二萃取液；所述第一萃取液为乙酸乙酯与正己烷的混合液；所述第二萃取液为正己烷；所述解离剂为0.4～0.6mol/L的乙酸铵水溶液；所述的稳定剂为0.1～0.3mol/L碳酸钠水溶液。

[0026] 在本发明中，所述试剂盒中包括标准品溶液，所述标准品溶液包括第一标准品和第二标准品；所述第一标准品为100ng/mL的睾酮标准溶液；所述第二标准品为10ng/mL的睾酮标准溶液。在本发明中，所述标准品溶液的溶剂优选为甲醇，所述甲醇优选为色谱纯。本发明中，所述标准品溶液优选的通过以下方法制备获得：将睾酮与甲醇混合，配制成浓度为1.0mg/mL的睾酮标准品母液；然后用甲醇将睾酮的浓度由1.0mg/mL逐级稀释，得到第一标准品和第二标准品。在本发明中，所述第一标准品的作用是稀释获得部分系列浓度校准点，所述第二标准品的作用是作为第一个高值浓度校准点以及配制中、高、低三个浓度的质控品。

[0027] 在本发明中，所述试剂盒中包括内标溶液，所述内标溶液为包括8000～12000pg/mL睾酮-d3的甲醇溶液，优选为包括10000pg/mL睾酮-d3的甲醇溶液；所述甲醇优选为色谱纯。本发明中，所述内标溶液优选的通过以下方法制备获得：将睾酮-d3与甲醇混合制备100μg/mL的母液，然后逐级稀释至10000pg/mL。

[0028] 在本发明中，所述试剂盒包括稀释液；本发明中，所述稀释液优选的包括第一稀释液和第二稀释液；所述第一稀释液为空白血清基质溶液，所述第二稀释液为甲醇。在本发明中，所述第一稀释液的作用是用于系列标准溶液和质控品的配制，所述第二稀释液的作用是用于标准品母液的稀释和样品复溶。

[0029] 在本发明中，所述试剂盒中包括萃取液，所述萃取液包括第一萃取液和第二萃取液；所述第一萃取液为乙酸乙酯与正己烷的混合液，所述第一萃取液中乙酸乙酯与正己烷的体积比优选为(2.5～3.5):2，更优选为3:2；所述第二萃取液为正己烷。本发明能够在两次液液萃取后达到非常理想的睾酮提取率；在本发明中，所述第一萃取液将睾酮最大程度从基质中分离出来，所述第二萃取液将极性脂质很大程度上从样品提取物中去除，从而提高了精确度和色谱分离的一致性。

[0030] 在本发明中，所述试剂盒包括解离剂，所述解离剂为0.4～0.6mol/L的乙酸铵水溶液，优选为0.5mol/L；在本发明中，所述解离剂的作用是将血清中的脂质与极性组分分离，睾酮主要与血清蛋白结合，解离剂能够将睾酮与结合蛋白完全解离，同时也避免了内标溶液与结合蛋白的不完全平衡，从而使分析物回收率趋于一致，提高方法的精密度。

[0031] 在本发明中，所述试剂盒包括稳定剂，所述的稳定剂为0.1～0.3mol/L碳酸钠水溶液，优选为0.2mol/L。本发明中，所述稳定剂的作用是去除酸性杂质，如磷脂和脂肪酸；此类极性脂质通常会聚集在色谱柱上，使分离效果恶化，并增加离子抑制。

[0032] 在本发明中，所述试剂盒包括质控品，所述质控品为包括睾酮的空白血清基质溶液。在本发明中，所述质控品优选的包括第一质控品、第二质控品和第三质控品；所述第一质控品中睾酮的浓度优选为80～120pg/mL，更优选为90～110pg/mL，最优选为100pg/mL。本发明中，所述第二质控品中睾酮的浓度优选为1800～2200pg/mL，更优选为1900～2100pg/mL，最优选为2000pg/mL。在本发明中，所述第三质控品中睾酮的浓度优选为7500～8500pg/mL，更优选为7800～8200pg/mL，最优选为8000pg/mL。所述三个指控品用于评估方法的回收率与精密度。

[0033] 在本发明中，所述试剂盒包括色谱柱，所述色谱柱优选的为UPLC C18色谱柱；所述色谱柱的内径优选为2.1mm，所述色谱柱的长度优选为100mm，所述色谱柱的填料粒径优选为1.7μm。

[0034] 本发明中所述试剂盒的使用方法优选的包括以下步骤：1)将血清样本内标溶液、乙酸铵溶液、第一萃取液混合萃取，收集上清液，氮气吹干获得预处理样品；2)将所述预处理样品用第二萃取液进行第二次萃取，收集上清液，氮气吹干后、用甲醇复溶获得待检测样品；3)将所述待检测样品进行色谱分离和质谱检测，获得血清样本中睾酮的含量。

[0035] 在本发明中，所述色谱分离的进样体积优选为1～10μL，所述色谱分离的流速优选为0.2～0.5mL/min，所述色谱柱的柱温优选为35～40℃，所述色谱分离的样品室温度优选为12～17℃；以梯度洗脱5min；其中流动相A为0.1～0.3％v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈。在本发明中，所述色谱分离的洗脱梯度程序优选的如下：0～0.5min，10％B；0.5～2.5min B相从10％增加至95％；2.5～3.5min，95％B；3.5～3.6min B相从95％降低至10％；3.6～
5.0min，10％B。

[0036] 表1洗脱程序

[0037]

[0038] 在本发明中，所述质谱检测优选的选择ESI负离子模式上样，采用多反应监测技术检测睾酮；本发明中所述质谱参数优选的如下：离子源温度为180℃，脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流量为700L/H，锥孔反吹气流量为140L/H。本发明中，所述多反应监测技术检测睾酮的参数优选的如表2所示。

[0039] 表2多反应监测技术检测睾酮的参数

[0040]

[0041] 在本发明中，利用系列浓度的标准品溶液制备获得的标准曲线；以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算获得血清样本中睾酮的含量。

[0042] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0043] 实施例1

[0044] 本发明的超高效液相色谱-串联质谱检测血清中睾酮激素的一种实施例，采用同位素稀释液相色谱串联质谱检测血清样本中睾酮激素包括如下部分：

[0045] 1.材料

[0046] 本实施例中所涉及样本为新鲜正常人血清，外观澄清，无溶血、黄疸及脂血。

[0047] (1)仪器：超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(UPLC-MS/MS，美国Waters公司)；涡旋混合仪(德国IKA公司)；离心机(美国赛默飞公司)；氮吹仪(博纳艾杰尔公司)；电子分析天平(德国赛多利斯仪器系统有限公司)。

[0048] (2)试剂耗材：甲醇(色谱纯，德国Merck公司)、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)、正己烷(色谱纯，天津康科德科技有限公司)、乙酸乙酯(色谱纯，天津康科德科技有限公司)；甲酸(质谱纯，日本TCI公司)；空白血清基质；UPLC C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；实验用水为MIlli-Q超纯水。

[0049] (3)标准品：睾酮标准品(Testosterone，99.6％，湖南省药用辅料技术研究中心有限公司)；氘代睾酮标准品(Testosterone-D3，100μg/mL，cerilliant标准品)。

[0050] (4)质控品：含有睾酮的空白血清基质溶液，分低中高三个浓度，分别为QC(L)100pg/mL、QC(M)2000pg/mL、QC(H)8000pg/mL。

[0051] 2.方法

[0052] (1)色谱条件：UPLC C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)，流速0.4mL/min，进样量5μL，柱温为40℃，样品室温度为15℃，流动相A为0.1％的甲酸水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱的方式，洗脱程序如表1所示。

[0053] (2)质谱条件：在电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)正离子检测模式下，采用多反应监测(multiple reactionmonitoring，MRM)的质谱扫描模式。离子源温度为180℃，脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流量为700L/H，锥孔反吹气流量为140L/H。监测了目标物睾酮(289.2→97)以及同位素内标睾酮-d3(292.2→97)再分别对目标物的去簇电压(declustering potential，DP)和碰撞电压(collision energy，CE)进行了系统优化(见表
2)，以便达到更高的稳定性和灵敏度。

[0054] (3)标准品配制：准确称取睾酮10.0mg，加入10mL的甲醇溶液，配制成浓度为1.0mg/mL的睾酮标准品母液；然后用甲醇将睾酮激素的浓度由1.0mg/mL逐级稀释至100ng/mL，得到标准溶液A；取100μL标准溶液A，用甲醇定容至1mL，得到浓度为10ng/mL的标准溶液B。

[0055] (4)质控品的配制：取标准溶液B10μL、200μL、800μL，氮气吹干后，分别用空白血清基质溶液定容至1000μL得到。

[0056] (5)样品处理

[0057] 1)标准品处理：将标准溶液B作为第一个高值浓度点，分别移取50、25、10μL标准液A于1.5mL离心管中，氮气吹干后，向其中加入空白血清基质定容至1mL，得到浓度为1000、2500、5000pg/mL的校准浓度点，取其中1000pg/mL的标准溶液为标准溶液C；

[0058] 分别移取500、250、100、50、25、10μL标准溶液C，用空白血清基质定容至1mL，得到其余六个校准浓度点；共得到10个标准品系列校准浓度点。

[0059] 取10只空白1.5mL离心管，分别加入10μL同位素内标溶液，氮气吹干后，接着分别向其中上述10个校准浓度标准品溶液各100μL，再加入100μL乙酸铵室温下解离0.5h；加入400μL乙酸乙酯/正己烷(v/v，3:2)，涡旋混匀5min，离心2min，上清液氮气吹干后，加入100μL碳酸钠和400μL正己烷，涡旋离心后取上清液，重复加入400μL正己烷提取，合并上清液氮吹仪吹干后，以100μL甲醇溶液复溶，再移入色谱瓶中上样进行LC-MS/MS分析。

[0060] 2)血清样品前处理：取1.5mL离心管中加入10μL10000pg/mL内标溶液，氮气吹干后加入100μL血清，再加入100μL乙酸铵室温下解离0.5h；加入400μL乙酸乙酯/正己烷(v/v，3:2)，涡旋混匀5min，离心2min，上清液氮气吹干后，加入100μL碳酸钠和400μL正己烷，涡旋离心后取上清液，重复加入400μL正己烷提取，合并上清液氮吹仪吹干后，以100μL甲醇溶液复溶，移入色谱瓶中上样进行LC-MS/MS分析。

[0061] 3)质控品前处理：取1.5mL离心管中加入10μL10000pg/mL内标溶液，氮气吹干后，分别取质控品溶液QC(L)，QC(M)，QC(H)各100μL于1.5mL离心管，跟血清样品前处理方法一致。

[0062] 分析试剂盒中各组分见表3。

[0063] 表3睾酮激素分析试剂盒组分的制备

[0064]

[0065] 3.方法检测

[0066] 1)总离子流色谱图：睾酮激素的标准品及内标标准品及血清样品的峰型对称，在浓度不大于50pg/mL时基本没有杂质干扰，说明睾酮在此条件下能够得到良好的检测，表明上述条件能够用于血清睾酮激素的定量分析。

[0067] 2)校准曲线：校准曲线采用同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标峰面积比为Y轴，建立曲线，并计算血清中待测物的浓度。睾酮在10～10000pg/mL范围内线性较好，相关系数在0.99以上，且内标峰面积稳定性良好，相对标准偏差小于10％，满足定量要求。线性方程：Y＝0.000436931*X+0.0666518，线性系数(r2)为
0.996。

[0068] 3)检测灵敏度：睾酮激素的检测限(LOD)为5pg/mL，定量限(LOQ)为10pg/mL，重复5次检测CVs分别为8.7％和10.6％，所述LOD满足信噪比(S/N)>3，LOQ满足信噪比(S/N)>10，且重复5次检测CVs<20％。

[0069] 4)精密度实验：取低、中、高三个浓度的睾酮激素质控品，一天内重复处理6批，以同位素内标法定量测定睾酮激素的浓度，批内精密度(n＝6)为：CV:3.16％、3.64％、2.81％；批间精密度每批测定6次，连续测定三天，共18次测定，计算批间精密度(n＝18)为：
CV：6.22％、3.15％、3.60％。

[0070] 5)回收率实验：取空白血清基质，其中一份不加标准品，其余三份分别加入高、中、低3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定3次。检测空白基质的睾酮浓度低于10ppt，结果显示，血清基质中睾酮的加标回收率在89.5％～102.8％之间，3次重复实验的CV在1.72％～5.70％之间。

[0071] 实施例2

[0072] 1.材料

[0073] 本实施例中所涉及样本，均来自天津市某医院门诊及住院患者，样本为新鲜人血清，外观澄清，无溶血、黄疸及脂血。

[0074] (1)仪器：超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(UPLC-MS/MS，美国Waters公司)；涡旋混合仪(MS 3basic，德国IKA公司)；离心机(德国eppendorf公司)；氮吹仪(博纳艾杰尔公司)；万分之一天平(德国赛多利斯仪器系统有限公司)；可调移液器(德国eppendorf公司，0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、烧杯、量筒等。

[0075] (2)试剂耗材：甲醇(色谱纯，德国Merck公司)、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)、正己烷(色谱纯，天津康科德科技有限公司)、乙酸乙酯(色谱纯，天津康科德科技有限公司)；甲酸(质谱纯，美国Waters公司)；空白血清基质；UPLC C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；实验用水为去离子水。

[0076] (3)标准品：睾酮标准品(Testosterone，99.6％，湖南省药用辅料技术研究中心有限公司)；氘代睾酮标准品(Testosterone-D3，100μg/mL，cerilliant标准品)。

[0077] (4)质控品：含有睾酮的空白血清基质溶液，分低中高三个浓度，分别为QC(L)100pg/mL、QC(M)2000pg/mL、QC(H)8000pg/mL。

[0078] 2.方法

[0079] (1)色谱条件：UPLC C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)，流速0.4mL/min，进样量5μL，柱温为40℃，样品室温度为15℃，流动相A为0.1％的甲酸水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱的方式，洗脱程序如表1所示。

[0080] (2)质谱条件：在电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)正离子检测模式下，采用多反应监测(multiple reactionmonitoring，MRM)的质谱扫描模式。离子源温度为180℃，脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流量为700L/H，锥孔反吹气流量为140L/H。监测了目标物睾酮(289.2→97)以及同位素内标睾酮-d3(292.2→97)再分别对目标物的去簇电压(declustering potential，DP)和碰撞电压(collision energy，CE)进行了系统优化(见表
2)，以便达到更高的稳定性和灵敏度。

[0081] (3)标准品配制：准确称取睾酮10.0mg，加入10mL的甲醇溶液，配制成浓度为1.0mg/mL的睾酮标准品母液；然后用甲醇将睾酮激素的浓度由1.0mg/mL逐级稀释至100ng/mL，得到标准溶液A；取100μL标准溶液A，用甲醇定容至1mL，得到浓度为10ng/mL的标准溶液B。

[0082] (4)质控品的配制：取标准溶液B10μL、200μL、800μL，氮气吹干后，分别用空白血清基质溶液定容至1000μL得到。

[0083] (5)样品处理

[0084] 1)标准品处理：将标准溶液B作为第一个高值浓度点，分别移取50、25、10μL标准液A于1.5mL离心管中，氮气吹干后，向其中加入空白血清基质定容至1mL，得到浓度为1000、2500、5000pg/mL的校准浓度点，取其中1000pg/mL的标准溶液为标准溶液C；

[0085] 分别移取500、250、100、50、25、10μL标准溶液C，用空白血清基质定容至1mL，得到其余六个校准浓度点；共得到10个标准品系列校准浓度点。

[0086] 取10只空白1.5mL离心管，分别加入10μL同位素内标溶液，氮气吹干后，接着分别向其中上述10个校准浓度标准品溶液各100μL，再加入100μL乙酸铵室温下解离0.5h；加入400μL乙酸乙酯/正己烷(v/v，1:1)，涡旋混匀5min，离心2min，上清液氮气吹干后，加入100μL碳酸钠和400μL正己烷，涡旋离心后取上清液，重复加入400μL正己烷提取，合并上清液氮吹仪吹干后，以100μL甲醇溶液复溶，再移入色谱瓶中上样进行LC-MS/MS分析。

[0087] 2)血清样品前处理：取1.5mL离心管中加入10μL10000pg/mL内标溶液，氮气吹干后加入100μL血清，再加入100μL乙酸铵室温下解离0.5h；加入400μL乙酸乙酯/正己烷(v/v，1:1)，涡旋混匀5min，离心2min，上清液氮气吹干后，加入100μL碳酸钠和400μL正己烷，涡旋离心后取上清液，重复加入400μL正己烷提取，合并上清液氮吹仪吹干后，以100μL甲醇溶液复溶，移入色谱瓶中上样进行LC-MS/MS分析。

[0088] 3)质控品前处理：取1.5mL离心管中加入10μL10000pg/mL内标溶液，氮气吹干后，分别取质控品溶液QC(L)，QC(M)，QC(H)各100μL于1.5mL离心管，跟血清样品前处理方法一致。

[0089] 分析试剂盒中各组分见表3。

[0090] 3.方法检测

[0091] 1)总离子流色谱图：睾酮激素的标准品及内标标准品及血清样品的峰型对称，在浓度不大于50pg/mL时基本没有杂质干扰，说明睾酮在此条件下能够得到良好的检测，表明上述条件能够用于血清睾酮激素的定量分析。

[0092] 2)校准曲线：校准曲线采用同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标峰面积比为Y轴，建立曲线，并计算血清中待测物的浓度。睾酮在10～10000pg/mL范围内线性较好，相关系数在0.99以上，且内标峰面积稳定性良好，相对标准偏差小于10％，满足定量要求。线性方程：Y＝0.000458751*X+0.514436，线性系数(r2)为
0.999。

[0093] 3)检测灵敏度：睾酮激素的检测限(LOD)为5pg/mL，定量限(LOQ)为10pg/mL，重复5次检测CVs分别为7.9％和11.2％，所述LOD满足信噪比(S/N)>3，LOQ满足信噪比(S/N)>10，且重复5次检测CVs<20％。

[0094] 4)精密度实验：取低、中、高三个浓度的睾酮激素质控品，一天内重复处理6批，以同位素内标法定量测定睾酮激素的浓度，批内精密度(n＝6)为：CV:5.53％、1.92％、3.43％；批间精密度每批测定6次，连续测定三天，共18次测定，计算批间精密度(n＝18)为：
CV：5.01％、3.04％、3.53％。

[0095] 5)回收率实验：取空白血清基质，其中一份不加标准品，其余三份分别加入高、中、低3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定3次。检测空白基质的睾酮浓度低于10ppt，结果显示，血清基质中睾酮的加标回收率在88.1％～105.5％之间，3次重复实验的CV在3.15％～6.22％之间。

[0096] 由以上实施例可知，采用本发明提供的试剂盒进行睾酮检测的方法弥补了化学免疫法中存在的交叉反应和基质干扰所造成的特异性缺乏、灵敏度不足的问题，采用同位素内标法极大的消除了基体的干扰，很大程度上排除了预处理过程、上样体积以及流动相等条件的影响，从而达到了准确定量的目的。通过实施例1中的方法学研究表明，采用本发明所述的试剂盒检测睾酮含量的线性范围、检出限、回收率和精密度均满足要求，灵敏度高、特异性强、准确可靠，可应用于临床血清样本中睾酮激素的定量检测。

[0097] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。