一种检测生物标志物的微生物传感器及检测方法、培养与检测芯片和检测系统转让专利
申请号 : CN201911099404.X
文献号 : CN110714049B
文献日 : 2021-07-02
发明人 : 吕雪飞 , 赵毅蒙 , 杨元展 , 邓玉林 , 李晓琼
申请人 : 北京理工大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种检测生物标志物的微生物传感器,其特征在于,由组分A和组分B组成,所述组分A为磁珠与核酸适配体的偶联物,所述核酸适配体能够与蛋白生物标志物肌酸激酶同工酶CK‑MB特异性结合;所述组分B为转化荧光蛋白并表达抗性的基因工程菌液,在基因工程菌株上修饰核酸探针,所述核酸探针的核酸序列为5’‑HS‑CCCAACCCCCTAAAA‑3’,所述核酸探针的核酸序列与所述核酸适配体互补,所述核酸适配体的核酸序列为5’‑biotin‑GGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG‑3’, 所述CK‑MB与所述核酸探针竞争结合核酸适配体的结合位点,通过荧光强度来检测蛋白生物标志物CK‑MB的含量。
2.根据权利要求1所述的检测生物标志物的微生物传感器,其特征在于,所述荧光蛋白为绿色、红色或黄色荧光蛋白中的一种,表达抗性为氯霉素抗性、氨苄霉素抗性或卡那霉素抗性。
3.根据权利要求1所述的检测生物标志物的微生物传感器,其特征在于,所述基因工程菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。
4.根据权利要求1所述的检测生物标志物的微生物传感器,其特征在于,在基因工程菌株上修饰核酸探针以双功能蛋白交联试剂SMPB为交联剂。
5.一种包含权利要求1所述检测生物标志物的微生物传感器的培养与检测芯片,其特征在于,所述芯片从上至下设置为四层结构,第一层结构为覆盖层,第二层结构为通道层,所述通道层设有若干通道,第三层为培养层,在培养层设有若干培养区,不同的通道与培养区分别对应,用于不同培养液的分区培养,第四层为基底层,所述组分A与组分B孵育后再添加含有CK‑MB的检测液,接种到含有抗性筛选试剂的培养液中形成接种液,通过通道将接种液通入培养层的培养区,在培养区进行接种液的培养。
6.根据权利要求5所述的培养与检测芯片,其特征在于,所述芯片各层均采用聚甲基丙烯酸甲酯PMMA材质,热键合而成。
7.一种包括权利要求5‑6任一项所述培养与检测芯片的检测系统,其特征在于,所述系统包括微控制器、温度控制模块、双光路共焦检测器、培养与检测芯片和蠕动泵,微控制器与蠕动泵互联,由蠕动泵产生负压驱动注入芯片的接种液流动;微控制器与温度控制模块互联,温度控制模块调节培养与检测芯片培养区的温度;微控制器与双光路共焦检测器互联,双光路共焦检测器测定培养区的荧光强度。
8.根据权利要求7所述的培养与检测芯片的检测系统,其特征在于,所述光路双光路共焦检测器包括发出峰值为490 nm 3W和585 nm 2W的激光LED,四个滤光片,五个会聚透镜,三个长形双色透镜和两个光电传感器。
说明书 :
一种检测生物标志物的微生物传感器及检测方法、培养与检
测芯片和检测系统
技术领域
背景技术
发展准确灵敏的生物标志物定量检测技术不仅对疾病的早期诊断具有重要意义,还能实时
监控疾病的进程,以便作出及时治疗。
大多方法是基于抗原抗体之间的免疫反应实现的,而抗体具有稳定性差、修饰难、成本较高
等缺点。核酸适配体作为一种新型识别分子,具有易修饰、成本低、化学性质稳定以及配体
范围更广等优势,目前在部分研究中替代了抗体进行生物标志物的检测。因此,以核酸适配
体为特异性识别分子,发展准确灵敏的生物标志物定量检测新技术,对于疾病的早期诊断
具有重要的意义。
体与微生物荧光探针的诸多优点为发展新型准确灵敏的生物标志物定量检技术提供了一
种新思路,将二者相结合构建的新型微生物荧光探针能够在高度特异性识别生物标志物的
同时,产生效果显著的信号放大作用,极大的提高了检测灵敏度,对生物标志物的痕量检测
与疾病的早期诊断有着十分重要的意义。
的疾病的早期诊断提供更加可靠、准确的检测结果,以便进行针对性的治疗。不仅如此,将
基于相关设备的荧光检测系统引入该研究中能够更加方便直观的获得检测结果,最终建立
起方便快捷的多种生物标志物同时检测的新型检测方法。
发明内容
间竞争反应体系的基础上,建立了生物标志物定量检测技术,减少检测样品的用量,同时还
能够实现多种生物标志物的联合检测,为一些引起多生物标志物发生变化的疾病的早期诊
断提供更加可靠、准确的检测结果,有利于针对性的治疗。
化荧光蛋白并表达抗性的基因工程菌株,并在基因工程菌株上修饰核酸探针。所述核酸探
针的核酸序列与所述核酸适配体序列互补,目标生物标志物与所述核酸探针竞争结合核酸
适配体的结合位点,通过荧光强度来检测目标生物标志物的含量。
转化荧光蛋白并表达抗性的基因工程菌液,并在基因工程菌株上修饰核酸探针。所述核酸
探针的核酸序列与所述核酸适配体互补,所述核酸适配体的核酸序列为5’‑biotin‑GGGGG
GTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG,通过荧光强度来检测蛋白生物标志物CK‑
MB的含量。
志物、核酸适配体与核酸探针之间的竞争结合反应。
酸适配体,以验证基因工程菌能够适用于所述微生物传感器。
中所述的培养液通入培养层的培养区,第三层为培养层,在培养层设有培养区,在培养区进
行接种液的培养,第四层为基底层,该芯片为培养与检测芯片。
动注入芯片的接种液流动;微控制器与温度控制模块互联,温度控制模块调节培养与检测
芯片培养区的温度;微控制器与双光路共焦检测器互联,双光路共焦检测器测定培养区的
荧光强度。
生物荧光探针的生物标志物定量检测新技术;
附图说明
具体实施方式
发明,并不用于限定本发明。
化荧光蛋白并表达抗性的基因工程菌液,并以SMPB为交联剂,在基因工程菌株上修饰核酸
探针。核酸探针的核酸序列与核酸适配体互补,优选地,核酸探针的全部核酸序列与核酸适
配体部分序列互补。目标生物标志物与核酸探针竞争结合核酸适配体的结合位点,核酸探
针从核酸适配体上脱落下来,通过检测荧光探针的荧光强度,可以用来检测目标生物标志
物的含量。
达红色荧光蛋白的工程菌作为后续实验用菌。
不是致病株,也不产内毒素;4、代谢控制容易进行;5、能进行适当的DNA重组,并且稳定。一
般常用大肠杆菌。
酸适配体与互补探针偶联结束后的洗涤次数为5次;核酸适配体与互补探针的偶联时间为
1h;蛋白生物标志物CK‑MB与核酸适配体的竞争孵育的时间为1h。在此最佳条件下实现目标
生物标志物与核酸适配体及互补核酸探针的竞争结合反应。
B为转化荧光蛋白并表达抗性的基因工程菌液,并在基因工程菌株上修饰核酸探针。核酸适
配体核酸序列为5’‑biotin‑GGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG,经过多
轮筛选,该核酸适配体可以高效结合CK‑MB。当核酸适配体互补探针长度为15bp时,竞争反
应上清液的荧光值较高,表明蛋白生物标志物CK‑MB与核酸适配体的竞争反应的效果最为
明显,故选用该适配体互补核酸探针作为修饰核酸探针,其核酸序列为:5’‑HS‑
CCCAACCCCCTAAAA。
取上清液,并接种到含有抗性筛选试剂的培养液中进行培养,记录基因工程菌表达的荧光
强度,绘制荧光强度与待测蛋白浓度之间的关系曲线。
洗涤。
标志物、核酸适配体与核酸探针之间的竞争结合反应。
核酸适配体,以验证基因工程菌能够适用于微生物传感器。
道将步骤3中的培养液通入培养层的培养区,第三层为培养层,在培养层设有培养区,在培
养区进行接种液的培养,第四层为基底层,该芯片为培养与检测芯片。芯片各层均采用PMMA
材质,热键合而成,这种材料具有良好的生物相容性,经过简单的灭菌处理即可用于大肠杆
菌的培养及其荧光蛋白的表达。
层利用激光雕刻机雕刻出培养区;第四层基底层,不需要进行雕刻。可以培养区设计的是半
径为4mm的圆形,共有六个,可实现不同浓度菌液的同时培养,亦可实现多种菌液的同时培
养。培养腔室的厚度为第二层芯片与第三层芯片的叠加高度,为3mm,培养腔室的设计体积
约为150.72μL。
联,由蠕动泵产生负压驱动注入芯片的接种液流动;微控制器与温度控制模块互联,调节培
养与检测芯片培养区的温度;微控制器与双光路共焦检测器互联,双光路共焦检测器测定
培养液的荧光强度。
测试结果,并提供人机交互平台。培养与检测芯片作为整个反应的平台。温度控制模块和蠕
动泵辅助培养与检测芯片实现其功能,共聚焦使用光路检测来检测荧光强度。
(PBS溶液)。
关,并进行检测成像。
在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范
围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。