一种香蕉枯萎病抗性相关的SCAR分子标记及其检测方法和应用

摘要

本发明公开了一种香蕉枯萎病抗性相关的SCAR分子标记及其检测方法和应用。所述SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具有251bp。所述检测鉴定香蕉枯萎病抗性的方法，是以待测香蕉样品DNA为模板，采用SCAR分子标记检测引物进行PCR扩增反应并检测扩增产物，若扩增出251bp的特异性条带则表明待测香蕉样品不具有蕉枯萎病抗性，为香蕉枯萎病感病品种；反之则表明待测香蕉样品具有蕉枯萎病抗性，为香蕉枯萎病抗性品种。本发明提供的SCAR分子标记，为香蕉抗病新品种选育提供分子辅助技术，进一步可用于以香蕉组培苗、香蕉田间变异株系以及物理化学诱变后代等为筛选群体的香蕉新品种(系)的辅助筛选。

权利要求

1.一种香蕉枯萎病4号生理小种抗性相关的SCAR分子标记，其特征在于，所述SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种用于扩增权利要求1所述SCAR分子标记的引物，其特征在于，所述引物分别如SEQ ID NO:2～3所示。

3.权利要求1所述的SCAR分子标记或权利要求2所述的引物在鉴定香蕉枯萎病4号生理小种抗性或筛选抗香蕉枯萎病4号生理小种的香蕉品种或在制备香蕉枯萎病4号生理小种抗性检测试剂盒中的应用。

4.一种鉴定香蕉枯萎病4号生理小种抗性或筛选抗香蕉枯萎病4号生理小种的香蕉品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.提取待测香蕉样品基因组DNA；

S2.以步骤S1的DNA为模板，利用权利要求2所述引物进行PCR扩增反应；

S3.将S2的PCR扩增产物进行电泳检测，若扩增出251 bp的特异性条带则表明待测香蕉样品不具有香蕉枯萎病4号生理小种抗性，为香蕉枯萎病4号生理小种感病品种；反之则表明待测香蕉样品具有香蕉枯萎病4号生理小种抗性，为香蕉枯萎病4号生理小种抗性品种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的反应程序为：预变性94℃ 5min；变性94℃ 30s，退火60℃ 30s，延伸72℃ 45s，30个循环；终延伸72℃，

10min。

6.一种用于鉴定香蕉枯萎病4号生理小种抗性或筛选抗香蕉枯萎病4号生理小种的香蕉品种的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还含有PCR扩增反应所需试剂和香蕉样品基因组DNA提取所需试剂。

8.权利要求6或7所述的试剂盒在鉴定香蕉枯萎病4号生理小种抗性或筛选抗香蕉枯萎病4号生理小种的香蕉品种的应用。

说明书

一种香蕉枯萎病抗性相关的SCAR分子标记及其检测方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物抗病育种分子标记技术领域，更具体地，涉及一种香蕉枯萎病抗性相关的SCAR分子标记及其检测方法和应用。

背景技术

[0002] 香蕉(Musa spp)是世界贸易的大宗水果，也是仅次于水稻(Oryza sativa L.)、小麦(Triticum aestivum L.)和玉米(Zea mays L.)的第四大粮食作物。香蕉在生产上常常
受到病虫害的威胁和台风、冷害的破坏，严重制约了香蕉产业的发展。所以培育和栽培抗逆
性好的优质香蕉新品种被认为是解决以上问题的最经济、有效的方法。

[0003] 香蕉枯萎病，又称为巴拿马病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense,Foc)侵染引起的维管束系统性病害，是一种具有毁灭性的土传真
菌病害。香蕉枯萎病是在世界范围内分布最广、毁灭性最强的植物病害之一，已成为香蕉产
业发展的最大障碍。据报道，香蕉枯萎病菌目前有4个生理小种，其中4号生理小种是危害最
大的一种，几乎能侵染所有的香蕉种类。1976年，我国在台湾地区的香牙蕉上首次发现香蕉
枯萎病4号生理小种，随后在广东、福建、海南等香蕉主产区迅速蔓延，严重威胁着我国的香
蕉产业。目前仍无有效的防治措施，已成为香蕉产业发展的最大障碍之一。因此，选育和栽
培香蕉抗枯萎病抗病是控制该病害的有效途径。

[0004] 然而传统的育种手段效率低下且选育周期长，耗费大量的人力物力。分子标记辅助选择可以对潜在的抗性资源进行早期筛选，缩短抗病育种的进程，提高育种效率。但目前
国内外有关分子标记辅助香蕉抗病育种的报道还比较少，仅有Wang等(2012)利用抗病香蕉
品种筛选出了两对与抗病相关的RAPD引物，并成功开发了两个SCAR标记；Cunha等(2015)开
发了一个用于鉴定不同基因型香蕉对香蕉枯萎病的抗/感性的SCAR标记；王芳等(2018)利
用SRAP分子标记技术筛选出两对与香蕉枯萎病相关的SRAP引物，并成功开发出两个SCAR标
记；专利CN201610508539.7、201711087768.7公开的香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记；由于
香蕉的枯萎病抗病机理较为复杂，抗病相关的基因较多，目前能够直接有效的用于香蕉育
种中分子手段还比较少，因此急需对香蕉抗病机理进行多方面研究，开发多种抗枯萎病香
蕉的鉴定方法，这方面的研究对香蕉的抗病育种具有重要意义。另一方面，现有的香蕉枯萎
病抗性分子标记较少，且现有的香蕉枯萎病抗性分子标记无法达到100％的准确性，因此可
以尝试提供更多不同的抗性分子标记，这样在实际检测时就可以同时利用多种分子标记进
行检测，相互验证，从而提高准确性。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种香蕉枯萎病抗性相关的SCAR分子标记。

[0006] 本发明的另一目的在于提供所述香蕉枯萎病抗性分子标记的检测方法。

[0007] 本发明的再一目的在于提供所述香蕉枯萎病抗性分子标记的应用。

[0008] 本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

[0009] 一种香蕉枯萎病抗性相关的SCAR分子标记，所述SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0010] 所述SCAR分子标记具有251bp的特异性条带，所述特异性条带的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该SCAR分子标记来源于SRAP分子标记Me1-Em2扩增的一条813bp的特异条带
(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)。本发明所述SCAR分子标记在NCBI核酸数据库和香蕉
基因组数据库中均未发现与其具有较高同源性的已知序列，表明所述SCAR分子标记为全新
发现的。该SCAR分子标记扩增出的目的条带为单条带，条带稳定性好，重现性高，分析简单
快速，且其核苷酸序列较短，PCR扩增所需时间更少，操作更加简单，可更快速、更高效地实
现对香蕉枯萎病抗性的鉴定。

[0011] 本发明还提供一种用于扩增上述SCAR分子标记的引物。

[0012] 优选地，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2～3所示。

[0013] 上述的SCAR分子标记或任一所述的引物在鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病香蕉品种或在制备香蕉枯萎病抗性检测试剂盒中的应用。

[0014] 一种鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病香蕉品种的方法，包括如下步骤：

[0015] S1.提取待测香蕉样品基因组DNA；

[0016] S2.以步骤S1所示的DNA为模板，利用上述任一所述SCAR分子标记引物进行PCR扩增反应；

[0017] S3.将S2的PCR扩增产物进行电泳检测，若扩增出251bp的特异性条带则表明待测香蕉样品不具有蕉枯萎病抗性，为香蕉枯萎病感病品种；反之则表明待测香蕉样品具有蕉
枯萎病抗性，为香蕉枯萎病抗性品种。

[0018] 优选地，步骤S2所述PCR扩增反应的反应体系为：50ng/μL模板DNA 1μL，10mM引物1 1μL，10mM引物2 1μL，Mg2+Free 10×Taq buffer 2.5μL，25mM MgCl2 1.5μL，2.5mM dNTP 2μ
L，5U/μL Taq DNA Polymerase 0.2μL，ddH2O 15.8μL，总体积25μL。

[0019] 优选地，步骤S2所述PCR扩增反应的反应程序为：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃45s，30个循环；终延伸72℃，10min。

[0020] 一种用于鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病香蕉品种的试剂盒，所述试剂盒含有上述任一所述检测SCAR分子标记的引物。

[0021] 优选地，所述试剂盒还含有PCR扩增反应所需试剂和香蕉样品基因组DNA提取所需试剂。

[0022] 本发明还请求保护所述试剂盒在鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病的香蕉中的应用。

[0023] 优选地，所述香蕉为香牙蕉。

[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0025] 本发明提供了一种与香蕉枯萎病抗性相关的SCAR分子标记，为全新发现的，在NCBI核酸数据库和香蕉基因组数据库中均未发现与其具有较高的同源性的已知序列，可用
于研究香蕉枯萎病抗病相关的基因，研究香蕉的枯萎病抗病机理。本发明提供的香蕉枯萎
病抗性的相关的SCAR分子标记扩增出的目的条带为单条带，表现为目的条带的有无，具有
分析简单，扩增的稳定性好，重现性高等优点；且本发明提供的SCAR分子标记核苷酸序列
短，PCR程序简单，扩增所需时间更少，操作更加简单。利用本发明的SCAR分子标记，可以对
不同的靶基因进行检测，在实际检测时与现有的分子标记配合，从而相互验证，从而提高准
确性。本发明的SCAR分子标记为香蕉抗病新品种选育提供分子辅助技术，进一步可用于以
香蕉组培苗、香蕉田间变异株系以及物理化学诱变后代等为筛选群体的香蕉新品种(系)的
辅助筛选，具有较大的应用前景。

附图说明

[0026] 图1为改良CTAB法提取的部分香蕉(Musa spp.)样品的DNA电泳图。1：‘农科1号’；2：‘南天黄’；3：‘东蕉1号’；4：BXM51；5：‘抗枯1号’；6：‘北大矮蕉’；7：‘东莞中把’；8：‘齐
尾’；9：‘巴西蕉’；10：G30。

[0027] 图2为SRAP引物Me1-Em2对10个香牙蕉(Musa spp.AAA)样品的PCR扩增电泳图。M：DL 2000marker；1：‘农科1号’；2：‘南天黄’；3：‘东蕉1号’；4：BXM51；5：‘抗枯1号’；6：G30；7：
‘东莞中把’；8：‘齐尾’；9：‘巴西蕉’；10：‘北大矮蕉’。

[0028] 图3为SRAP引物Me9-Em1对10个香牙蕉(Musa spp.AAA)样品的PCR扩增电泳图。M：DL 2000marker；1：‘农科1号’；2：‘南天黄’；3：‘东蕉1号’；4：BXM51；5：‘抗枯1号’；6：G30；7：
‘东莞中把’；8：‘齐尾’；9：‘巴西蕉’；10：‘北大矮蕉’。

[0029] 图4为Me9-Em1引物扩增的与香蕉枯萎病抗性相关的SRAP标记序列。

[0030] 图5为Me9-Em1的SCAR标记部分PCR扩增电泳图。M：DL 2000marker；1：‘农科1号’；2：‘南天黄’；3：‘东蕉1号’；4：BXM51；5：‘抗枯1号’；6：G30；7：‘东莞中把’；8：‘齐尾’；9：‘巴
西蕉’；10：‘北大矮蕉’。

[0031] 图6为Me1-Em2的SCAR标记引物筛选结果。A：引物1；B：引物2；C：引物3；D：引物4。M：DL 2000marker；1：‘农科1号’；2：‘南天黄’；3：‘东蕉1号’；4：BXM51；5：‘东莞中把’；6：‘齐
尾’；7：‘巴西蕉’；8：‘北大矮蕉’。

[0032] 图7为Me1-Em2引物扩增的与香蕉枯萎病抗性相关的SCAR标记序列。

[0033] 图8为SCAR标记对23个抗感病香牙蕉(Musa spp.AAA)品种/系的扩增电泳图。M：DL 2000marker；1：G6-1；2：‘南天青’；3：‘农科1号’；4：‘抗枯1号’；5：‘索马里香蕉’；6：‘荷兰香
蕉’；7：‘龙州中把’；8：L1N1；9：‘那坡高把’；10：‘天宝矮蕉’；11：‘墨西哥香蕉’；12：‘漳蕉8-
2’；13：Ke2；14:WS2；15:‘广东2号’；16：G20；17：‘河口高把’；18：‘红河矮蕉’；19：‘那龙中
把’；20：‘浦北矮蕉’；21：‘定安高芽’；22：G30；23：‘抗枯5号’。

[0034] 图9为SCAR标记对未知抗/感性的香牙蕉(Musa spp.AAA)新品系的扩增电泳图。M：DL 2000marker；1：NK1；2：NK2；3：HNAJ0202；4：YYK1；5：‘北大矮蕉’；6：HNAJ0212；7：
HNAJ0219；8：HNAJ0301。

具体实施方式

[0035] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试
剂、方法和设备。

[0036] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0037] 香蕉枯萎病抗性分子标记筛选供试材料，于2018年10月采样于东莞市香蕉蔬菜研究所香蕉种质资源圃。选用对香蕉枯萎病具有不同抗/感性的香牙蕉(Musa spp.AAA)品种/
系共计30份(表1)，包含了一部分东莞市香蕉蔬菜研究所培育的新品种/系和中国多个香蕉
产区地方品种以及大面积推广的品种。

[0038] 表1供试30份香牙蕉(Musa spp.AAA)品种及对香蕉枯萎病4号小种的抗性

[0039]

[0040]

[0041] 实施例1香蕉全基因组DNA提取

[0042] 一、方法

[0043] 1、选取香蕉枯萎病抗性不同的香牙蕉品种(表1)分别进行DNA提取。DNA提取方法采用改良十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)：

[0044] (1)于2mL离心管中加入1mL改良CTAB提取液(3％CTAB，100mmol/L Tris-HCl pH8.0，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％PVP，4％β-巯基乙醇)在65℃水浴中预
热。

[0045] (2)称取0.2～0.5g香蕉嫩叶于研钵中，加入少量PVP，在液氮中迅速研磨成粉末。

[0046] (3)粉末转入预热的CTAB提取液中，充分混匀后65℃保温60min，每隔10～15min摇匀一次，使粉末与提取液充分混匀。

[0047] (4)室温下冷却至常温，8000rpm，离心6min，取上清液，转入新的2mL离心管中。

[0048] (5)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻混匀，12000rpm，离心10min。

[0049] (6)吸取上清液于2mL离心管中，加入30％体积的无水乙醇和等体积的DNA提取酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分混匀后静置片刻，12000rpm，离心10min。

[0050] (7)吸取上清液转入新的2mL离心管中，加入1/10体积3M醋酸钠和等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，-20℃静置2h以上。

[0051] (8)12000rpm，离心10min，倒出上清液，用75％乙醇洗涤DNA 2～3次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA，再用适量的RNase A消化(37℃水浴1～2h)，-20℃保存
备用。

[0052] 2、DNA浓度和纯度检测

[0053] (1)电泳检测：取2μL DNA母液，加入1μL 6×Loading Bμffer和4μL ddH2O，点样于1％琼脂糖凝胶，120V电泳15～20min左右，在凝胶成像系统下观察、拍照，检测基因组DNA片
段大小和完整性。

[0054] (2)核酸蛋白仪检测：吸取1μL DNA样品，利用核酸蛋白测定仪(Eppendorf BioPhotometer Plus)测定DNA的质量浓度，以及在波长260nm 280nm处的吸收值A260和A280，
并计算A260/A280以判断DNA的纯度。并根据以下依据判断DNA的质量：OD260/OD280应在1.6～
1.9之间，大于1.9说明有RNA污染，小于1.6说明有蛋白质污染；OD260/OD230应大于2.0，小于
2.0则表明溶液中残有盐和小分子杂质。

[0055] 二、结果

[0056] 采用CTAB改良法提取香蕉基因组DNA，所提取样品的DNA母液浓度均可达到400ng/μL以上，OD260/280＝1.8左右，质量较好，符合试验要求，可用于后续的SRAP分子标记及SCAR
分子标记筛选。图1为该方法提取的部分香蕉样品的基因组DNA电泳图。

[0057] 实施例2香蕉枯萎病抗性相关的SRAP分子标记筛选

[0058] 一、方法

[0059] 选取‘农科1号’、‘南天黄’、‘东蕉1号’、BMX51、‘抗枯1号’、G30、‘东莞中把’、‘齐尾’、‘巴西蕉’、‘北大矮蕉’等10个品种，用于SRAP特异条带的筛选。SRAP引物序列见表2，由
上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

[0060] PCR扩增反应在PCR instrument(Bio-rad T100，Bio-Rad/USA)上进行，PCR反应体系如表3所示，PCR反应条件如表4所示。

[0061] 表2 SRAP标记引物及序列

[0062]

[0063]

[0064] 表3 PCR反应体系

[0065]

[0066] 表4 PCR反应条件

[0067]

[0068] 扩增产物加入4μL的6×Loading buffer后，取8～10μL在1.8％琼脂糖凝胶中电泳，电压120V，电泳40min左右，在紫外凝胶成像仪中进行观察与分析，记录结果。

[0069] 二、结果

[0070] 通过合成正向引物10条，反向引物10条，组合100对SRAP引物(表2)。以5个抗病品种/系(‘农科1号’、‘南天黄’、‘东蕉1号’、BXM51、‘抗枯1号’)和5个感病品种/系(G30、‘东莞
中把’、‘齐尾’、‘巴西蕉’、‘北大矮蕉’)作为供试材料，筛选出2对与香蕉枯萎病抗感病性相
关的SRAP分子标记，分别为Me1-Em2和Me9-Em1。Me1-Em2在5个感病品种/系中均扩增出
900bp左右的特异性条带(图2)，Me9-Em1在5个感病品种/系中均扩增出400bp左右的特异性
条带(图3)。两对SRAP标记在抗病品种/系中均没有特异性条带的扩增(图2，图3)

[0071] 实施例3香蕉枯萎病抗性SCAR分子标记特异性引物设计及鉴定

[0072] 1、香蕉枯萎病抗性SCAR分子标记引物筛选

[0073] 对实施例2中的2个SRAP标记的5个感病品种/系(G30、‘东莞中把’、‘齐尾’、‘巴西蕉’、‘北大矮蕉’)扩增出的特异性条带分别进行切胶回收，并送至上海生工生物工程技术
服务有限公司进行测序。将测序结果在BioXM2.7软件上进行比对分析，不同品种/系之间的
DNA序列基本一致。Me1-Em2这对引物获得了一段813bp的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID 
NO：4所示，Me9-Em1获得一段400bp的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。将获得的
两段DNA序列分别在NCBI核酸数据库和香蕉基因组数据库(http://banana-genome-
hub.southgreen.fr/blast)上进行BLAST分析，均未发现与已有的序列具有较高的同源性，
其原因可能是因为该特异片段为香蕉基因组中DNA的基因间区域或基因内含子序列。

[0074] 利用Primer3在线引物设计工具对Me9-Em1获得的标记序列设计出多对SCAR标记引物，但均无法扩增出理想的条带，具体序列如图4所示，部分结果如图5所示。因此，此SRAP
标记无法转化为SCAR标记。出现了Me9-Em1这一对SRAP标记无法转化为SCAR标记的现象。这
有可能是由于DNA中存在着引物设计不合理、序列相似或多拷贝现象引起的。针对这些情况
对SCAR引物的设计进行一定的优化，亦无法成功转化成SCAR标记。

[0075] 利用Primer3在线引物设计工具对Me1-Em2获得的标记序列进行SCAR引物的设计，具体序列如表5所示：

[0076] 表5 SCAR标记引物序列

[0077]

[0078] 选取4个抗病品种/系(‘农科1号’、‘南天黄’、‘东蕉1号’、BXM51)和4个感病品种/系(‘东莞中把’、‘齐尾’、‘巴西蕉’、‘北大矮蕉’)作为供试材料，以上述表11开发的SCAR分
子标记的引物进行PCR扩增，进行SCAR标记引物筛选。PCR反应体系同上述的表3所示，PCR反
应程序如表6所示：

[0079] 表6 PCR反应程序

[0080]

[0081] 扩增产物加入4μL的6×Loading buffer后，取8～10μL在1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电压为110V，电泳25min左右，在紫外凝胶成像仪中进行观察与分析，记录结果。

[0082] 从图6(D)可以看出，用引物4(SC4-F/SC4-R)的扩增效果最好，在4个感病品种/系均扩增出251bp的条带，且无其他杂带。而在4个抗病品种/系中没有该条带的扩增。因此，
SC4-F/SC4-R这对引物符合SCAR分子标记的要求，经比对发现该条带是位于原SRAP特异条
带的第72～322bp(图7)。而其他3对引物在8个品种/系中均扩增出相应大小的条带，但在抗
病品种/系中条带较弱，推测其原因是可能在扩增过程中出现了部分错配。

[0083] 2、香蕉枯萎病抗性SCAR分子标记准确性验证

[0084] 为了进一步验证上述SCAR标记的准确性，选取‘南天青’、‘广东2号’、‘那龙中把’、‘河口高把’等23个已知其抗感性的香牙蕉品种/系作为供试材料，采用SC4-F/SC4-R这对
SCAR引物进行扩增检测。扩增结果如图8所示，所有的感病品种/系均扩增出251bp的特异性
条带，而G6-1、南天青、农科1号、抗枯1这4个抗病香蕉品种没有扩增出该特异性条带。扩增
结果与品种田间种植的香蕉枯萎病抗性是一致的。但是抗枯5号作为抗病品种，田间表现为
对枯萎病具有高抗性，也扩增出了251bp的特异性条带条带，与田间表现不一致。同时ke2这
个感病品种/系扩增出的条带比其他供试的感病品种弱，这与其对枯萎病有一定抗病性也
是一致的。因此，本次试验的SCAR分子标记的准确率达到96.67％，且多次重复实验结果一
致。

[0085] 实施例4香蕉枯萎病抗性SCAR分子标记SCAR分子标记的应用

[0086] 用实施例3开发出的SCAR标记(SC4-F/SC4-R)对未知品系：HNAJ0212、HNAJ0219、HNAJ0301、HNAJ0202、‘农科1号’的2个突变体(NK1、NK2)和‘粤优抗1号’共7份待测资源进行
筛选。扩增结果如图9所示，HNAJ0212、HNAJ0219、HNAJ0301和HNAJ0202均扩增出251bp的特
异性条带，这4个为感病品系，而‘农科1号’的2个突变体(NK1、NK2)和‘粤优抗1号’的1个突
变体(YYK1)没有扩增出该特异性条带的扩增，为抗病品系。表明本发明的香蕉枯萎病抗性
SCAR分子标记具有一定的应用价值。