一株所产内毒素蛋白对7种血清型菌株具有免疫保护作用的铜绿假单胞菌及其应用转让专利
申请号 : CN201810783424.8
文献号 : CN110724647B
文献日 : 2022-11-04
发明人 : 曲晓军 , 于德水 , 王金英 , 于冲 , 夏海华
申请人 : 黑龙江省科学院微生物研究所
摘要 :
本发明公开了一株所产内毒素蛋白对7种血清型菌株具有免疫保护作用的铜绿假单胞菌及其应用，属于免疫技术领域。该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017，保藏编号为CGMCC NO.11268。该菌株产生的内毒素蛋白对7种血清型的铜绿假单胞菌株具有免疫保护作用。本发明还提供了该菌株以及该菌株所产生的内毒素蛋白在制备预防或治疗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用，尤其是在制备铜绿假单胞菌疫苗中的应用。本发明还提供一种内毒素蛋白的制备方法和含有该内毒素蛋白的铜绿假单胞菌疫苗。本发明提供的铜绿假单胞菌PA‑017和其生产的内毒素蛋白可应用于防治铜绿假单胞菌感染的免疫领域。
权利要求 :
1.一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）PA‑017，保藏编号为：CGMCC NO.11268。
2.一种如权利要求1所述的铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）PA‑017所产生的内毒素蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：（1）取铜绿假单胞菌PA‑017菌株，接种于琼脂斜面培养基上，37℃培养18h，将菌体洗8
下，接种至内毒素蛋白生产培养基，接种量为3.0×10 CFU/mL，在37℃、175转/min下振荡培养22h，获得培养物；
（2）将步骤（1）所得培养物的pH校正至8.5，37℃甲苯重层自溶48h，暗视野镜检自溶完全后，将自溶液校正pH至7.2，抽滤得到棕色透明液体，用50%ZnCl2沉淀蛋白，4℃、离心后弃掉上清，沉淀用20% Na2HPO4·7H2O溶液溶解，37℃静置2h，4℃冰箱过夜保存；
（3）4℃离心后收集上清液，校正pH至7.0～7.2，利用截留分子量为8000～14000的透析袋流水透析48h后，电扇吹风浓缩至体积50～80mL；
（4）浓缩液校正pH至7.0～7.2，按照浓缩液体积：冷丙酮体积=1：2用冷丙酮沉淀浓缩液，4℃离心后弃掉上清，沉淀用ddH2O溶解，浓缩后真空冷冻干燥，获得内毒素蛋白。
说明书 :
一株所产内毒素蛋白对7种血清型菌株具有免疫保护作用的
铜绿假单胞菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株所产内毒素蛋白对7种血清型菌株具有免疫保护作用的铜绿假单胞菌及其应用，属于免疫技术领域。
背景技术
[0002] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)又称绿脓杆菌，是一种革兰氏阴性杆菌，属于γ‑变形菌纲假单胞菌科。铜绿假单胞菌是一种无处不在的微生物，能够在无生命的或有生命的环境中生存，在人体中，它是一种机会致病菌，只是定值于健康个体很少引起疾病，在免疫系统功能受损时感染患者，例如，患有慢性疾病的患者，如囊性纤维化、癌症、烧伤后急性免疫力低下、创伤或危重病。使用破坏物理防御的侵入性装置，如泌尿和血管导管，也会增加铜绿假单胞菌感染的风险。铜绿假单胞菌已成为医院内感染的重要病原菌之一，亦是战伤感染的常见致病菌。铜绿假单胞菌还可引起禽畜败血性死亡等，对人体健康和养殖业造成了较大的危害和经济损失。
[0003] 内毒素蛋白(endotoxin protein)是铜绿假单胞菌的主要免疫源性物质，可刺激机体产生体液性抗体，具有激发机体网状内皮系统细胞的活力和增强巨噬细胞吞噬功能的作用。然而目前研究表明，已发现的菌株所产内毒素蛋白对同一血清型菌株的免疫保护作用很好，但对其他血清型铜绿假单胞菌的保护作用不强，由于铜绿假单胞菌血清型众多，已达十余种，用十余种血清型菌株的内毒素蛋白制备疫苗，不仅繁琐、工作量大，且每种血清型内毒素蛋白的含量只能很低，因为总蛋白含量过高会引起机体很强的副作用，很难达到激发出机体免疫反应的最低剂量。因此，筛选到所产内毒素蛋白对多种血清型菌株有免疫保护作用的铜绿假单胞菌是十分有意义的。
发明内容
[0004] 为解决已发现的菌株所产内毒素蛋白对同一血清型菌株的免疫保护作用很好，但对其他血清型铜绿假单胞菌的保护作用不强的问题，本发明提供了一株所产内毒素蛋白对7种血清型菌株有免疫保护作用的铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017菌株，采用的技术方案如下：
[0005] 本发明的目的是提供一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017，保藏编号为：CGMCC NO.11268。该铜绿假单胞菌PA‑017菌株已于2015年08月24日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0006] 本发明的铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017所产生的内毒素蛋白对7种血清型的铜绿假单胞菌株的攻毒具有免疫保护作用，7种血清型分别为血清型为II型、IV型、V型、VIII型、IX型、X型和XI型。
[0007] 本发明的铜绿假单胞菌PA‑017菌株筛选自哈尔滨医科大学附属第二医院住院患者的痰液中。
[0008] 本发明的铜绿假单胞菌PA‑017菌株具有下述性质：
[0009] 1.菌落形态：血液琼脂平板培养基上37℃培养18～24h，肉眼观察，菌落为光滑微隆起、边缘整齐、灰色、表面湿润、不透明、直径约1.5～2.5mm；镜检为革兰氏阴性短杆状。
[0010] 2.培养特性：血液琼脂平板培养基上37℃培养18～24h，有溶血圈出现；内毒素蛋白生产培养基中37℃培养18～24h，产绿色色素，培养基均匀混浊，呈黄绿色。
[0011] 3.生理生化特征：氧化酶实验阳性，MR试验和VP试验阴性，甘露醇试验阴性，能分解葡萄糖产酸不产气，能液化明胶和利用枸橼酸盐，不产硫化氢。
[0012] 4.免疫学特性：所述铜绿假单胞菌PA‑017菌株所产内毒素蛋白对血清型II型、IV型、V型、VIII型、IX型、X型和XI型铜绿假单胞菌菌株有很好的免疫保护作用，保护率在80％以上。
[0013] 本发明的另一目的是提供铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017的应用，具体地涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017在制备预防或治疗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用；铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017在制备铜绿假单胞菌疫苗中的应用。
[0014] 本发明的另一目的是提供一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017所产生的内毒素蛋白。
[0015] 本发明的另一目的是提供铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017所产生的内毒素蛋白的应用，具体地涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017所产生的内毒素蛋白在制备预防或治疗铜绿假单胞菌感染药物中的应用；铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017所产生的内毒素蛋白在制备铜绿假单胞菌疫苗中的应用。
[0016] 本发明的另一目的是提供一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017所产生的内毒素蛋白的制备方法：
[0017] (1)取铜绿假单胞菌PA‑017菌株，接种于琼脂斜面培养基上，37℃培养18h，将菌体8
洗下，接种至内毒素蛋白生产培养基，接种量为3.0×10CFU/mL，在37℃、175转/min下振荡培养22h，获得培养物；
洗下，接种至内毒素蛋白生产培养基，接种量为3.0×10CFU/mL，在37℃、175转/min下振荡培养22h，获得培养物；
[0018] (2)将步骤(1)所得培养物的pH校正至8.5，37℃甲苯重层自溶48h，暗视野镜检自溶完全后，将自溶液校正pH至7.2，抽滤得到棕色透明液体，用50％ZnCl2沉淀蛋白，4℃、离心后弃掉上清，沉淀用20％Na2HPO4·7H2O溶液溶解，37℃静置2h，4℃冰箱过夜保存；
[0019] (3)4℃离心后收集上清液，校正pH至7.0～7.2，利用截留分子量为8000～14000的透析袋流水透析48h后，电扇吹风浓缩至体积50～80mL；
[0020] (4)浓缩液校正pH至7.0～7.2，按照浓缩液体积：冷丙酮体积＝1：2用冷丙酮沉淀浓缩液，4℃离心后弃掉上清，沉淀用ddH2O溶解，浓缩后真空冷冻干燥，获得内毒素蛋白。
[0021] 本发明的另一目的是提供含有铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017所产生的内毒素蛋白的铜绿假单胞菌疫苗。
[0022] 本发明有益效果：
[0023] 本发明提供了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA‑017菌株，该菌株所产内毒素蛋白对血清型II型、IV型、V型、VIII型、IX型、X型和XI型铜绿假单胞菌菌株有很好的免疫保护作用，保护率在80％以上。
[0024] 本发明提供的利用铜绿假单胞菌PA‑017菌株生产的内毒素蛋白，可应用于制备防治铜绿假单胞菌感染的药物。
附图说明
[0025] 图1为PA‑017菌株的菌落形态图(血液琼脂平板培养基)。
[0026] 图2为PA‑017菌株的革兰氏染色镜检图。
[0027] 图3为PA‑017菌株在内毒素蛋白生产培养基中产绿色色素图。
具体实施方式
[0028] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中涉及的培养基组成如下：
[0030] 1、血液琼脂平板培养基：
[0031] 每1000mL培养基含：酪蛋白胰酶消化物10.0g，心胰酶消化物3.0g，玉米淀粉1.0g，琼脂14.0g，肉胃酶消化物5.0g，酵母浸出粉5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，无菌脱纤维羊血60mL，校正PH值至7.2～7.4。
[0032] 2、营养琼脂斜面培养基：
[0033] 每1000mL培养基含：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，最终pH7.3±0.2。
[0034] 3、普通肉汤培养基：
[0035] 每1000mL培养基含：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，最终pH7.4±0.2。
[0036] 4、内毒素蛋白生产培养基：谷氨酸钠20.0g，葡萄糖7.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，Ca(NO3)20.01g，FeSO4·7H2O 0.00005g，KH2PO4 0.252g，Na2HPO4·12H2O 5.63g，溶于1000mL蒸馏水中，校正pH至7.2～7.4，115℃25min高压蒸汽灭菌。
[0037] 实施例1：铜绿假单胞菌PA‑017菌株的分离与鉴定
[0038] 1、铜绿假单胞菌PA‑017菌株的分离：
[0039] (1)菌株分离样品为从哈尔滨医科大学附属第二医院采集的住院患者的痰液。
[0040] (2)痰液样品加适量无菌双蒸水充分混匀后，用无菌加样枪吸取30uL，均匀涂布接种于血液琼脂平板培养基中，37℃培养24h。用接种环挑取平板上溶血圈大的典型单菌落，在血液琼脂平板培养基上进行分区划线接种，37℃培养22h。血液琼脂平板培养基纯化2代后，获得铜绿假单胞菌菌株，菌株命名为PA‑017，于营养琼脂斜面培养基保藏并进行鉴定。
[0041] 2、铜绿假单胞菌PA‑017菌株的鉴定：
[0042] (1)菌落形态特征：
[0043] 将PA‑017菌株在血液琼脂平板培养基上37℃培养18～24h，其菌体形态如图1所示，菌落为光滑微隆起、边缘整齐、灰色、表面湿润、不透明、直径约1.5～2.5mm，溶血。
[0044] PA‑017菌株镜检结果如图2所示，镜检为革兰氏阴性短杆状。
[0045] 将PA‑017菌株接种到内毒素蛋白生产培养基中37℃发酵18～24h，产绿色色素，培养基均匀混浊，呈黄绿色，如图3所示。
[0046] (2)生化鉴定：PA‑017菌株氧化酶实验阳性，MR试验和VP试验阴性，甘露醇试验阴性，能分解葡萄糖，产酸不产气，能液化明胶和利用枸橼酸盐，不产硫化氢，因此鉴定证实该PA‑017菌株为铜绿假单胞菌，如表1所示。
[0047] 表1 PA‑017菌株的主要生化特征
[0048]
[0049] 注：“+”：阳性；“‑”：阴性。
[0050] 实施例2：PA‑017菌株发酵制备内毒素蛋白试验
[0051] 1.生产菌株准备：
[0052] 将PA‑017菌株冻干管无菌开启，接入普通肉汤培养基中，37℃静置培养22h。用无菌加样枪吸取30uL，均匀涂布接种于血液琼脂平板培养基中，37℃培养24h。用接种环挑取平板上溶血圈大的典型单菌落，在血液琼脂平板上进行分区划线接种，37℃培养22h。选取平板上溶血圈大、典型的单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上，37℃培养24h。镜检，确定为铜绿假单胞菌。
[0053] 2.内毒素蛋白制备：
[0054] (1)取PA‑017菌株，接种于普通琼脂斜面培养基上，37℃培养18h，然后用内毒素蛋白生产培养基把菌体洗下，接入装有800～1000mL内毒素蛋白生产培养基的三角瓶中，接种8
量为3.0×10 CFU/mL(细菌浊度计TA‑2XJ，北京天安联合科技有限公司)，旋转摇床(175转/min)37℃振荡培养22h。
量为3.0×10 CFU/mL(细菌浊度计TA‑2XJ，北京天安联合科技有限公司)，旋转摇床(175转/min)37℃振荡培养22h。
[0055] (2)培养物校正pH至8.5，37℃甲苯重层自溶48h。暗视野镜检自溶完全后，将自溶液校正pH至7.2，G5砂芯漏斗抽滤，得到棕色透明液体，用50％ZnCl2沉淀蛋白(3.2mL 50％ZnCl2/100mL抽滤液)，4℃，4000rpm离心20min，弃掉上清。沉淀用适量20％Na2HPO4·7H2O溶液溶解，37℃静置2h，4℃冰箱过夜保存。
[0056] (3)4℃，4000rpm离心20min，收集上清液，校正pH至7.0～7.2，装入透析袋(截留分子量：8000～14000)流水透析48h后，电扇吹风浓缩至体积50～80mL。
[0057] (4)浓缩液校正pH至7.0～7.2，冷丙酮沉淀(浓缩液体积：冷丙酮体积＝1：2)，4℃，4000rpm离心20min，弃掉上清，沉淀加少量ddH2O溶解，电扇吹风浓缩，真空冷冻干燥，获得内毒素蛋白。
[0058] 实施例3：内毒素蛋白免疫保护试验
[0059] 1、攻毒菌株准备:
[0060] 铜绿假单胞菌PA‑393株(血清型I型)、PA‑251株(血清型II型)、PA‑526株(血清型III型)、PA‑182株(血清型IV型)、PA‑109株(血清型V型)、PA‑189株(血清型VI型)、PA‑894株(血清型VII型)、PA‑1537株(血清型VIII型)、PA‑025株(血清型IX型)、PA‑261株(血清型X型)和PA‑1206株(血清型XI型)为中国医学细菌保藏管理中心铜绿假单胞菌专业实验室提供。
[0061] 将上述各菌株冻干管无菌开启，接入普通肉汤培养基中，37℃静置培养22h。用无菌加样枪吸取30uL，均匀涂布接种于血液琼脂平板培养基中，37℃培养24h。用接种环挑取平板上溶血圈大的典型单菌落，在血液琼脂平板上进行分区划线接种，37℃培养22h。选取平板上溶血圈大、典型的单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上，37℃培养24h。镜检，确定为铜绿假单胞菌。
[0062] 2、攻毒菌株最小致死量测定：
[0063] 无菌操作，取上述菌株37℃培养12～16h的营养琼脂培养物，用氯化钠注射液洗下8 8 8
菌体，稀释，充分混匀，用细菌浊度计稀释成含菌4.0×10 /mL、3.6×10/mL、3.2×10/mL、
8 8 8 8 8 7
2.8×10/mL、2.4×10 /mL、2.0×10/mL、1.6×10/mL、1.2×10 /mL、8.0×10/mL、4.0×
7 7
10/mL、2.0×10/mL等浓度的菌悬液，用每一稀释度的菌悬液，腹腔注射5只体重为14～16g小鼠，每只小鼠注射量为0.5mL，观察3天，使小鼠于感染后3天内全部死亡的最小剂量为1个最小致死量(MLD)。如上述攻毒剂量未出现全部死亡或出现所有剂量组均全部死亡的现象，则重新向上或向下摸索使小鼠全部死亡的攻毒最小剂量并细化。测得上述11个血清型菌株的MLD，如表2所示。
菌体，稀释，充分混匀，用细菌浊度计稀释成含菌4.0×10 /mL、3.6×10/mL、3.2×10/mL、
8 8 8 8 8 7
2.8×10/mL、2.4×10 /mL、2.0×10/mL、1.6×10/mL、1.2×10 /mL、8.0×10/mL、4.0×
7 7
10/mL、2.0×10/mL等浓度的菌悬液，用每一稀释度的菌悬液，腹腔注射5只体重为14～16g小鼠，每只小鼠注射量为0.5mL，观察3天，使小鼠于感染后3天内全部死亡的最小剂量为1个最小致死量(MLD)。如上述攻毒剂量未出现全部死亡或出现所有剂量组均全部死亡的现象，则重新向上或向下摸索使小鼠全部死亡的攻毒最小剂量并细化。测得上述11个血清型菌株的MLD，如表2所示。
[0064] 表2 11个血清型铜绿假单胞菌MLD测定结果
[0065]
[0066] 3、免疫力试验:
[0067] (1)选用体重14～16g的清洁级小鼠，分成11组，每组32只。上述11组小鼠均用内毒素蛋白免疫，共免疫3次，首免每只小鼠皮下注射40μg；间隔3天进行二免，每只小鼠皮下注射80μg；间隔3天进行三免，每只小鼠皮下注射120μg。
[0068] (2)于第三次免疫结束后第7天，上述11个免疫组，每组分别对应1个血清型菌株，每只小鼠腹腔分别注射1MLD的新鲜菌悬液，上述1MLD的毒菌均含于0.5mL中。
[0069] (3)同时用同批饲养的、体重与免疫组相同的清洁级小鼠165只作对照，分成11组，每组15只，每组再分成2MLD、1MLD及1/2MLD 3个小组，每小组5只小鼠；分别于腹腔注射2MLD、1MLD及1/2MLD的上述11个血清型的新鲜菌悬液(含于0.5mL中)，观察3天，进行结果判定：对照组小鼠感染2MLD及1MLD者应全部死亡，感染1/2MLD者应有部分死亡，计算免疫组小鼠保护率。
[0070] 表3内毒素蛋白对11个血清型铜绿假单胞菌菌株免疫力试验结果
[0071]
[0072] 结果表明，铜绿假单胞菌PA‑017菌株制备的内毒素蛋白，对血清型II型、IV型、V型、VIII型、IX型、X型和XI型铜绿假单胞菌菌株有很好的免疫保护作用，保护率均在80％以上，如表3所示。可见PA‑017菌株所产的内毒素蛋白，可应用于制备铜绿假单胞菌疫苗。
[0073] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。