基于重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原在水体雌激素污染检测方法及应用

摘要

基于重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原在水体雌激素污染检测方法及应用，涉及环境污染检测和免疫学领域，公开了一种基于重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原(Vitellongenin,VTG)，利用重组蛋白作为抗原制备多克隆抗体。建立检测VTG快速准确的免疫检测方法。利用该方法检测被17‑β雌二醇(E2)诱导的雄性青鳉鱼，发现被E2诱导的雄鱼VTG水平比未诱导雄鱼VTG水平明显升高，利用该方法鉴定雌雄鱼发现雌鱼体内VTG明显高于雄鱼。差异极显著，该技术可以用于环境雌激素污染的监测和雌雄鱼的鉴别。

权利要求

1.中华乌塘鳢卵黄蛋白原的水体雌激素污染的检测方法，其特征在于所述卵黄蛋白原为重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原或中华乌塘鳢血液、肝脏提取获得的卵黄蛋白原，检测方法包括以下步骤：（1）应用基因工程原理克隆中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因，选择其中一段819bp核苷酸序列进行克隆和原核表达，819bp核苷酸序列如SEQ NO 3所示，经纯化和浓缩获得融合蛋白；

（2）制备中华乌塘鳢卵黄蛋白原多克隆抗体，包括以下步骤：

1）制备完全和不完全福氏佐剂，重组卵黄蛋白原溶液用PBS稀释至卵黄蛋白原浓度为

0.1mg/mL，加入等体积完全福氏佐剂，用1mL注射器充分乳化，制成完全福氏佐剂；抗原溶液等体积与不完全福氏佐剂充分乳化后制成不完全福氏佐剂，采用皮下多点注射的方式进行注射；

2）注射佐剂前，先用卡介苗刺激BalB/C小鼠的腘窝和足掌，激活小鼠免疫功能，一周后开始免疫完全福氏佐剂；

3）第一次采用重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原融合蛋白完全福氏佐剂免疫BalB/C小鼠；间隔10天后采用不完全福氏佐剂免疫小鼠，共免疫4次；

4）最后一次免疫7天后尾部取血ELISA检测抗体效价，符合要求后部分小鼠眼眶取全血，静止4小时后离心获得抗血清，即小鼠抗中华乌塘鳢卵黄蛋白原多克隆抗体；

（3）检测鉴定中华乌塘鳢卵黄蛋白原多克隆抗体，检测鉴定包括斑点杂交、ELISA方法检测抗体效价和DOT-blotting方法鉴定多克隆抗体；

（4）多克隆抗体在卵黄蛋白原测定实验中的应用。

2.根据权利要求1所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原的水体雌激素污染的检测方法，其特征在于，在步骤（3）中所述ELISA方法检测抗体效价步骤包括：

1）向酶标板凹孔中加入100 μL 卵黄蛋白原纯化蛋白标准品，在4℃条件下孵育16 h；

2）倒掉酶标板凹孔中的残余液体，晾干后每孔加入300 μL PBST-20，放置于摇床上振摇5 min，每次静置5 min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

3）向酶标板凹孔中加入250 μL 5 %脱脂牛奶，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500 rpm条件下震荡温育1.5 h；

4）倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300 μL PBST-20，放置于摇床上振摇5 min，每次静置5 min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

5）向酶标板凹孔中加入100 μL鼠抗卵黄蛋白原多克隆抗体，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500 rpm条件下震荡温育1.5 h；

6）倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300 μL PBST-20，放置于摇床上振摇5 min，每次静置5 min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

7）向酶标板凹孔中加入100 μL按1︰2000比例稀释的羊抗鼠IgG-HRP，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500 rpm条件下震荡温育1.5 h；

8）倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300 μL PBST-20，放置于摇床上振摇5 min，每次静置5 min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

9）将酶标板移入光线较弱的条件下，每孔中加入显色液100 μL，以封口膜密封酶标板，而后将酶标板以铝箔层层包裹，置于全温振荡培养箱中在温37℃、500 rpm条件下震荡温育 

45 min，取出后向孔内加入50 μL 0.5M硫酸，使反应停止；将板置于酶标仪下，于波长450 nm处读取数据，计算卵黄蛋白原含量，获得小鼠抗卵黄蛋白原抗体与抗体稀释度的量效关系。

3.根据权利要求1所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原的水体雌激素污染的检测方法，其特征在于，在步骤（3）中所述DOT-blotting方法鉴定多克隆抗体步骤包括：

1）用铅笔在硝酸纤维素膜上画取1×1 cm方格；

2）在方格上点滴5 μL 卵黄蛋白原纯化蛋白标准品，梯度稀释；在相邻方格滴加牛血清白蛋白BSA，阴性对照滴加PBS；放置于培养皿中，在4 ℃冰箱过夜；

3）加入用PBS配制15 mL 5%脱脂牛奶，在室温下封闭1 h；

4）加入15 mL PBST-20，放置于摇床上振摇5 min，每次静置5 min后倒去溶液，晾干；重复进行3次；

5）用上述PBS配制15 mL 5%的脱脂牛奶1︰1000稀释一抗浸没硝酸纤维素膜，反应1 h；

另一份前步骤同1）-4），但不加免疫一抗，而加阴性小鼠血清做对照；

6）加入15 mL PBST-20，放置于摇床上振摇5 min，每次静置5 min后倒去溶液，晾干；重复进行3次；

7）用上述PBS配制15 mL 5%的脱脂牛奶1︰1000稀释二抗浸没硝酸纤维素膜，反应1 h；

8）加入15 mL PBST-20，放置于摇床上振摇5 min，每次静置5 min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

9）加入5 mL DAB显色液，以封口膜密封培养皿，并用铝箔层层包裹，取出后用水冲洗并记录实验现象。

4.根据权利要求1所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原的水体雌激素污染的检测方法在水体雌激素污染检测中的应用。

5.根据权利要求1所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原的水体雌激素污染的检测方法在监测水体环境雌激素污染中的应用。

6.根据权利要求1所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原的水体雌激素污染的检测方法在雌雄鱼的鉴别中的应用。

说明书

基于重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原在水体雌激素污染检测方法

及应用

技术领域

[0001] 本发明属于环境污染检测和免疫学领域，特别涉及一种基于重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原在水体雌激素污染检测方法及应用。

背景技术

[0002] 随着工业技术的发展，尤其是化学合成技术的突飞猛进，各种化学合成产品在人类生活中得到大量使用，而且这些化学物质在自然条件下很难降解。其中一类化学物质通过水，气，土壤进入环境，其化学性质与动物激素有相似的功能，进入生物体后能够与正常激素进行竞争，从而打乱人体正常生理功能，甚至造成性发育，性比混乱，有的则可能引起癌变。目前公认的环境雌激素主要包括：农药类物质，主要的具有雌激素活性的农药,除了硫丹、乙基对硫磷以及马拉硫磷等少数几种外，大部分是有机氯农药；添加剂，主要有食品添加剂、塑料制品添加剂(存在于塑料食品器具中尤甚)；二恶英(dioxin)、多氯联苯(PCBs)类:二恶英是人类生产活动产生的副产品,多氯联苯(PCBs)是由209种同类物组成的一组氯代芳烃化合物,具有潜在的致癌生物效应。多氯联苯曾经普遍用在工业和生活上，比如广泛用于电容器和变压器中的绝缘油、耐火增塑剂和液压油，以及润滑剂、密封剂、油漆涂料的添加剂、染料、杀虫剂等的生产，这种物质进入食物链后，多存积在动物脂肪中。多环芳烃(PAHs)也是典型的有机污染物，主要产生于有机物的不完全燃烧过程,在石油产品以及木材处理过程中的化学混合物中都含有这类物质。许多证据显示它可诱发啮齿类动物乳腺肿瘤的发生。人工合成的雌激素主要有雌二醇(E2),已烯雌酚(DES),以及一些口服避孕药等。除了有可能导致性别改变，上述环境雌激素均有三致作用，致癌致畸致突变。因此，开展有效快速检测水体环境环境激素的检测对于及时采取有效措施进行干预制止对于避免环境激素危害生物及人体健康至关重要。目前关于环境激素的检测主要有物理化学方法，这类方法主要能够快速定量定性检测到某种化学物质，但是该类方法往往需要特殊昂贵的仪器设备，试剂以及专业的人员，样品往往需要特殊的前处理，处理检测时间长，费用高。此外，所检测到的往往是某种化学物质的浓度，环境因素的影响常常往往比较复杂，很少只有一类物质其作用，有时是几种物质共同作用的结果，这中间就包括几种物质协调促进作用，也有相互拮抗作用。所以检测到一种物质不能够反应对生物的综合作用，所以，应用生物监测的方法则能够比较客观反应环境对生物的综合影响。目前采用生物标记物的形式监测环境污染是一个重要的趋势。卵黄蛋白原(vitellogenin,VTG)是一种卵生生物雌性个体在生殖期间由肝细胞在雌激素诱导下表达后通过血淋巴进入卵巢，入卵后加工成为卵黄蛋白，主要用于卵子的后期发育提供营养。以鱼类为例，雄鱼体内和雌雄幼体一般没有或很少存在VTG，但它们的肝脏存在这个基因，因此，在雌激素或者类似物的诱导下能够诱导产生VTG进入血液，由于雄鱼没有卵巢，因此无法对血液中的VTG进行灭活，因此，雄鱼体内一直存在着比较高水平的VTG，通过检测雄鱼体内的VTG就可以间接反应所生存的水体环境是否收到环境激素的污染。

[0003] 目前国际上对生物体内卵黄蛋白原的检测主要采用免疫学方法，其中最常用的是基于酶联免疫吸附原理的检测方法，该方法根据抗原-抗体特异性结合的机制，通过酶标HRP等发达技术生成可检测的有色产物。产物显现的颜色与抗原或抗体的浓度呈现正相关或负相关，据此可以定量计算出抗原或抗体的浓度。目前报道的鱼类主要是淡水鱼，海水鱼与淡水鱼生存环境还是由明显差别，因此应用海水鱼能够更客观反应海洋环境的污染情况，专利描述了海水岸边滩涂生存的弹涂鱼的VTG，本发明涉及的与弹涂鱼生存环境类似的中华乌塘鳢，中华乌塘鳢，塘鳢科乌塘鳢属的一种鱼类。栖息于浅海、内湾和河口咸淡水水域，亦进入淡水，冬季潜在泥砂底中越冬。其性凶猛，摄食小鱼、虾蟹类、水生昆虫和贝类。和同样生存环境的弹涂鱼相比，中华乌塘鳢还有一个优势，它属于肉食性，因此在食物链环节属于较高位置，食物链长。而弹涂鱼主要以底栖藻类，饶足类为食，食物链短。经过生物富集作用，中华乌塘鳢可能比弹涂鱼摄入更高浓度的污染物，环境对它的影响和反应会更明显。此外，据洪万树研究发现，中华乌塘鳢对环境激素反应敏感，种群中可以发现12％的个体是雌雄同体。另外中华乌塘鳢作为近年来水产养殖的重要品种，如果作为一种生物标记物鱼类，所取得的研究成果可以直接用于近岸养殖和水体质量评估【李生,肖锦平,佘忠明.中华乌塘鳢的育苗技术[J].上海水产大学学报,1999,8(1):48-52.】。

[0004] 本发明涉及中华乌塘鳢多克隆抗体的制备并应用抗体建立斑点杂交，ELISA和Western-blot系列免疫检测方法。目前还没有关于应用重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原制备相应多克隆和单克隆抗体以及利用这些抗体开展环境雌激素污染监测的文献和发明的相关报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于为了获得一种更能够有效反映和检测环境雌激素类污染的途径，提供以保证中华乌塘鳢卵黄蛋白原快速定性和准确定量，确保检测的准确度和灵敏度，从而更加有效地定性和/或定量检测环境中的雌激素的一种中华乌塘鳢卵黄蛋白原在水体雌激素污染检测方法及应用。

[0006] 本发明包括以下步骤：

[0007] 1)应用基因工程原理克隆中华乌塘鳢VTG全长基因，选择其中一段816bp核苷酸序列进行克隆和原核表达，经纯化和浓缩获得融合蛋白；

[0008] 2)制备中华乌塘鳢VTG多克隆抗体；

[0009] 在步骤2)中，所述制备中华乌塘鳢VTG多克隆抗体的具体方法可为：

[0010] (1)制备完全和不完全福氏佐剂，重组VTG溶液用PBS稀释至VTG浓度为0.1mg/mL，加入等体积完全福氏佐剂，用1mL注射器充分乳化，制成完全福氏佐剂；抗原溶液等体积与不完全福氏佐剂充分乳化后制成不完全福氏佐剂，采用皮下多点注射的方式0.2mL/点进行注射；(2)注射佐剂前，先用卡介苗刺激BalB/C小鼠的腘窝和足掌，激活小鼠免疫功能，一周后开始免疫完全福氏佐剂；

[0011] (3)第一次采用重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原融合蛋白完全福氏佐剂免疫BalB/C小鼠；间隔10天后采用不完全福氏佐剂免疫小鼠，共免疫4次；

[0012] (4)最后一次免疫7天后尾部取血ELISA检测抗体效价，符合要求后部分小鼠眼眶取全血，静止4h后离心获得抗血清，即小鼠抗中华乌塘鳢卵黄蛋白原多克隆抗体。

[0013] 3)检测鉴定中华乌塘鳢卵黄蛋白原多克隆抗体。

[0014] 在步骤3)中，所述卵黄蛋白原可为重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原或中华乌塘鳢血液、肝脏等其他组织提取获得的卵黄蛋白原；

[0015] 所述检测鉴定可包括ELISA(酶联免疫吸附剂测定)方法检测抗体效价、DOT-blotting(斑点杂交)方法鉴定多克隆抗体等；

[0016] 所述ELISA方法检测抗体效价的具体方法可为：

[0017] (1)向酶标板凹孔中加入100μL VTG纯化蛋白标准品，在4℃条件下孵育16h；

[0018] (2)倒掉酶标板凹孔中的残余液体，晾干后每孔加入300μL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

[0019] (3)向酶标板凹孔中加入250μL 5％脱脂牛奶，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500rpm条件下震荡温育1.5h；

[0020] (4)倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300μL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

[0021] (5)向酶标板凹孔中加入100μL鼠抗VTG多克隆抗体，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500rpm条件下震荡温育1.5h；

[0022] (6)倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300μL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

[0023] (7)向酶标板凹孔中加入100μL按1：2000比例稀释的羊抗鼠IgG-HRP，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500rpm条件下震荡温育1.5h；

[0024] (8)倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300μL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

[0025] (9)将酶标板移入光线较弱的条件下，每孔中加入显色液100μL，以封口膜密封酶标板，而后将酶标板以铝箔层层包裹，置于全温振荡培养箱中在温37℃、500rpm条件下震荡温育45min，取出后向孔内加入50μL 0.5M硫酸，使反应停止；将板置于酶标仪下，于波长450nm处读取数据，计算VTG含量，获得小鼠抗VTG抗体与抗体稀释度的量效关系。

[0026] 所述DOT-blotting方法鉴定多克隆抗体的具体方法可为：

[0027] (1)用铅笔在硝酸纤维素NC膜上画取1×1cm方格；

[0028] (2)在方格上点滴5μL VTG纯化蛋白标准品，梯度稀释；在相邻方格滴加牛血清白蛋白BSA，阴性对照滴加PBS；放置于培养皿中，在4℃冰箱过夜；

[0029] (3)加入15mL 5％脱脂牛奶(用PBS配制)，在室温下封闭1h；

[0030] (4)加入15mL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干；重复进行3次；

[0031] (5)用一抗(上述脱脂牛奶1：1000稀释)浸没硝酸纤维素NC膜，反应1h；另一份与步骤(1)～(4)相同，但不加免疫一抗，而加阴性小鼠血清做对照；

[0032] (6)加入15mL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干；重复进行3次；

[0033] (7)用二抗(上述脱脂牛奶1：1000稀释)浸没NC膜，反应1h；

[0034] (8)加入15mL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

[0035] (9)加入5mL DAB显色液，以封口膜密封培养皿，并用铝箔层层包裹，取出后用水冲洗并记录实验现象。

[0036] 所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原的水体雌激素污染的检测方法在水体雌激素污染检测中的应用。

[0037] 所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原的水体雌激素污染的检测方法在监测水体环境雌激素污染中的应用。

[0038] 所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原的水体雌激素污染的检测方法在雌雄鱼的鉴别中的应用。

[0039] 所述应用的范围可包括所有鱼类和所有卵生生物。

[0040] 本发明具体包括提供了一种中华乌塘鳢卵黄蛋白原小鼠抗VTG多克隆抗体。多克隆抗体通过制备完全和不完全VTG-福氏佐剂免疫Balb/C小鼠，结束后取血清获得小鼠抗VTG多克隆抗体。利用制备的多克隆和单克隆抗体建立了一系列免疫学检测方法。借助这些技术开展雌雄鱼检测和环境雌激素污染的间接检测。利用该方法检测被17-β雌二醇(E2)诱导的雄性青鳉鱼，发现被E2诱导的雄鱼VTG水平比未诱导雄鱼VTG水平明显升高，利用该方法鉴定雌雄鱼发现雌鱼体内VTG明显高于雄鱼。差异极显著，该技术可以用于环境雌激素污染的监测和雌雄鱼的鉴别。

附图说明

[0041] 图1为重组VTG表达纯化SDS-PAGE分析图；在图1中，1：Marker；2：诱导表达；3：过柱；4：富集；5：纯化；70KD代表分子量大小。

[0042] 图2为VTG多克隆抗体效价ELISA结果图；在图2中，曲线a为阳性血清，b为阴性血清。

[0043] 图3为VTG多克隆抗体特异性Dot Blot检测结果分析图；在图3中，a为阳性血清结果；b为阴性血清结果，1：PBS对照，2：7μg/L VTG，3：3μg/L VTG，4：1μg/L VTG，5：0.5μg/L VTG，6：0.2μg/L VTG，7：0.1μg/L VTG，8：7μg/L BSA，9：3μg/L BSA，10：1μg/L BSA。

[0044] 图4为中华乌塘鳢雌、雄鱼组织VTG水平ELISA检测结果图；图中a、b代表之间有显著性差异。

[0045] 图5为雄性青鳉鱼在E2暴露21天体内VTG水平变化ELISA检测结果分析图。

具体实施方式

[0046] 下面通过实施例结合附图对本发明所提供的中华乌塘鳢卵黄蛋白原多克隆抗体及其应用进行详细说明。

[0047] 实施例1

[0048] 重组中华乌塘鳢VTG的制备，应用基因工程原理克隆中华乌塘鳢VTG全长基因，选择其中一段816bp核苷酸序列进行克隆和原核表达，克隆表达纯化获得重组中华乌塘鳢VTG。从SDS-PAGE图可以看出，重组表达在70KD位置有一个明显的条带，为标签MNP(40KD)和目的蛋白VTG(30KD)的融合表达区域，经过纯化和浓缩融合蛋白明显，杂带较少，参见图1。

[0049] 实施例2

[0050] 中华乌塘鳢VTG多克隆抗体的制备，制备方法包括以下步骤：

[0051] (1)制备完全和不完全福氏佐剂。取适量重组VTG溶液用PBS稀释至VTG浓度为0.1mg/mL，加入等体积完全福氏佐剂。用1mL注射器充分乳化，制成完全福氏佐剂。抗原溶液等体积与不完全福氏佐剂充分乳化后制成不完全福氏佐剂。采用皮下多点注射的方式(0.2mL/点)进行注射。

[0052] (2)注射佐剂前，先用卡介苗刺激BalB/C小鼠的腘窝和足掌，激活小鼠免疫功能。一周后开始免疫完全福氏佐剂。

[0053] (3)第一次采用重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原融合蛋白完全福氏佐剂免疫BalB/C小鼠；间隔10天后采用不完全福氏佐剂免疫小鼠，共免疫4次。

[0054] 最后一次免疫7天后尾部取血ELISA检测抗体效价。符合要求后部分小鼠眼眶取全血，静止4h后离心获得抗血清，即小鼠抗中华乌塘鳢卵黄蛋白原多克隆抗体。

[0055] 应用多克隆和单克隆抗体建立检测卵黄蛋白原标准品、雌雄鱼体内卵黄蛋白原水平以及被雌激素诱导及环境水体污染的鱼类体内卵黄蛋白原的免疫检测方法，包括斑点杂交、ELISA和Western-blot技术。

[0056] 实施例3

[0057] 中华乌塘鳢卵黄蛋白原多克隆抗体的检测鉴定

[0058] 应用ELISA方法检测抗体效价

[0059] 具体方法如下：

[0060] (1)向酶标板凹孔中加入100μL VTG纯化蛋白标准品，在4℃条件下孵育16h。

[0061] (2)倒掉酶标板凹孔中的残余液体，晾干后每孔加入300μL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干。重复进行3次。

[0062] (3)向酶标板凹孔中加入250μL 5％脱脂牛奶，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500rpm条件下震荡温育1.5h。

[0063] (4)倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300μL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干。重复进行3次。

[0064] (5)向酶标板凹孔中加入100μL鼠抗VTG多克隆抗体，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500rpm条件下震荡温育1.5h。

[0065] (6)倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300μL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干。重复进行3次。

[0066] (7)向酶标板凹孔中加入100μL按1︰2000比例稀释的羊抗鼠IgG-HRP，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500rpm条件下震荡温育1.5h。

[0067] (8)倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300μL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干。重复进行3次。

[0068] (9)将酶标板移入光线较弱的条件下，每孔中加入显色液100μL，以封口膜密封酶标板，而后将酶标板以铝箔层层包裹，置于全温振荡培养箱中在温37℃、500rpm条件下震荡温育45min，取出后向孔内加入50μL 0.5M硫酸，使反应停止。将板置于酶标仪下，于波长450nm处读取数据，计算VTG含量，结果证明所制备的小鼠抗VTG抗体效价高，并且随着抗体稀释度增加不断下降，有明显的量效关系。结果见图2。

[0069] 应用DOT-blotting方法鉴定多克隆抗体，具体步骤如下：

[0070] (1)用铅笔在硝酸纤维素NC膜上画取1×1cm方格；

[0071] (2)在方格上点滴5μL VTG纯化蛋白标准品，梯度稀释；在相邻方格滴加牛血清白蛋白BSA，阴性对照滴加PBS；放置于培养皿中，在4℃冰箱过夜；

[0072] (3)加入15ml 5％脱脂牛奶(用PBS配制)，在室温下封闭1h；

[0073] (4)加入15ml PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干。重复进行3次；

[0074] (5)用一抗(上述脱脂牛奶1︰1000稀释)浸没硝酸纤维素NC膜，反应1h；另外一份与前面步骤(1)～(4)一样，但是不加免疫一抗，而加阴性小鼠血清做对照。

[0075] (6)加入15ml PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干。重复进行3次；

[0076] (7)用二抗(上述脱脂牛奶1︰1000稀释)浸没NC膜，反应1h；

[0077] (8)加入15ml PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5min后倒去溶液，晾干。重复进行3次；

[0078] (9)加入5ml DAB显色液(显色液需避光冷藏)，以封口膜密封培养皿，并用铝箔层层包裹(不可透光)，取出后用水冲洗并记录实验现象。结果发现，该抗体能够识别重组蛋白的标准品VTG，显示棕黄色反应，并且随着VTG浓度的下降，显示逐渐变淡。有量效关系，而阴性对照PBS和其他蛋白BSA则无明显阳性反应。说明抗体具有特异性，与其他蛋白无交叉反应。结果见图3。

[0079] 实施例4

[0080] 小鼠抗中华乌塘鳢VTG多克隆抗体的应用

[0081] 1.中华乌塘鳢雌、雄鱼组织VTG测定实验

[0082] (1)在厦门市新店镇新店市场购买中华乌塘鳢雄鱼、雌鱼各10条，在人工配制的海水中养殖；

[0083] (2)从鱼侧面线下方约1cm下针，直到针头碰到脊柱，抽取约2ml血液，放置4℃冰箱过夜后取出，1500rpm离心10min后，取上清；

[0084] (3)解剖中华乌塘鳢，并取脾脏、肝脏、心脏、性腺、眼睛等组织，用锡箔纸包裹，保存于-4℃冰箱中；

[0085] (4)称组织重量，每100mg组织中加入1ml NC-Buffer A和10μL PMSF，用匀浆器在冰上充分匀浆，放置冰上孵育20min；

[0086] (5)加入加入55μL NC-Buffer B，混匀后放置在冰上孵育1min；

[0087] (6)在4℃，900rpm条件下离心30min，收集上清液在-20℃冰箱中保存。

[0088] (7)按实施例3进行Dot Blot与ELISA，记录结果并用SSPS 20.0统计分析软件进行单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)。从实验数据可以看出，雌鱼组织中的VTG水平明显比雄鱼组织VTG高，各个组织相比，血清，肝脏中的VTG水平最高，其次是心脏，脾脏，而肌肉和性腺中的VTG水平则较低。结果见图4，a、b代表之间有显著性差异。

[0089] 2青鳉鱼E2暴露诱导后体内VTG水平变化实验

[0090] (1)选取70尾雄性青鳉鱼在10L玻璃缸中驯化3天。

[0091] (2)将雌二醇溶于0.05％的DMSO溶液中，配制成1μg/L的雌二醇溶液。

[0092] (3)将上述青鳉鱼分为4组：对照组和E2100暴露组(5ng/L、50ng/L、500ng/L)，在2L玻璃缸中进行暴露。其中对照组投放10尾，暴露组每组各投放20尾。每24h更换1L染毒液。

[0093] (4)在暴露21天后停止暴露并进行称重。

[0094] (5)将青鳉鱼放入离心管中，加入适量PBS，在-80℃条件下保存。

[0095] (6)取经E2暴露21d的雄鱼。取暴露组和对照组雄鱼。每条鱼分别进行处理。

[0096] (7)在2ml的冷裂解液中各加入20μL的磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和PMSF，混匀，放置在冰上备用。

[0097] (8)将青鳉鱼放置于玻璃匀浆器的入口缓冲处，用眼科剪尽可能的剪碎，然后加入1ml上述裂解液，研磨至没有明显的组织块(该过程在冰上操作)。

[0098] (9)将组织匀浆液移入2ml的塑料离心管中，在4℃、900rpm条件下离心60min。

[0099] (10)吸取上清液至新的管中，在-20℃条件下保存备用。

[0100] (11)按照实施例3进行ELISA检测，记录结果并用SSPS 20.0统计分析软件进行单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)。从数据可以看出，经过E2诱导的雄青鳉鱼体内VTG水平明显比对照组高，而且E2浓度越高，体内VTG水平越高，有明显的量效关系，说明雄性青鳉鱼在E2处理下能够显著诱导体内VTG水平。可以通过检测体内VTG水平有效判断所在水环境是否收到环境雌激素的污染。结果见图5。

[0101] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明保护范围为准。