刺芒柄花素在制备预防和治疗周围神经病变药物中的应用

摘要

本发明公开了刺芒柄花素在制备预防和治疗化疗药物引发的周围神经病变的药物中的应用，进一步实验发现刺芒柄花素对奥沙利铂诱导的ND7/23细胞的神经毒性的有保护作用；在动物模型上，刺芒柄花素对奥沙利铂诱导的小鼠周围神经毒性有保护作用。本发明的药物刺芒柄花素可以作为化疗药的佐剂用于癌症治疗，并且对化疗所致的神经毒性有缓解作用。

权利要求

1.刺芒柄花素在制备预防和治疗化疗药物引发的周围神经病变的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化疗药物为癌症化疗药。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述癌症化疗药选自奥沙利铂、顺铂、卡铂、紫杉醇、长春新碱、长春碱中一种或多种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述周围神经病变的症状包括以下一种或多种：肢体末端皮肤麻木、手套、袜套样感觉、皮肤发冷、蚁走感、持物无力、走路踩棉花感、烧样疼痛、闪痛和刀割样疼痛。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化疗药物为奥沙利铂。

说明书

刺芒柄花素在制备预防和治疗周围神经病变药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明药物医药应用技术，特别是涉及刺芒柄花素在制备治疗周围神经病变药物中的应用。

背景技术

[0002] CIPN(chemotherapy‑induced peripheral neuropathy,CIPN)是一种常见的由抗肿瘤药物引起的运动、感觉和自主神经损伤引起的限药不良反应，其中以感觉功能障碍最为突出，典型的症状包括四肢对称性麻木、本体感觉丧失、针刺感明显、手脚痛觉过敏或异[1]位痛等 。2014年美国临床肿瘤学会(American society of clinical oncology,ASCO)针[2,3]
对性地发布了化疗诱发的周围神经病变CIPN的防治指南 ，指出“CIPN是一种非常重要需[4]
要引起我们重视的不良反应事件，然而现今针对CIPN并无有效的治疗手段” 。CIPN相关的抗肿瘤药物包括铂类药物 (如:卡铂、顺铂和奥沙利铂)、紫杉烷类药物(如:紫杉醇和多西他赛)、埃波西酮类药物(如:伊沙白酮)、长春新碱类生物碱(如:长春新碱和长春碱)、硼替佐米和沙利度胺等，CIPN在一定程度上限制了化疗药物剂量和疗效的提高,为化疗药物的[5‑8]
主要剂量限制性毒性 。

[0003] 近年来，如何预防和减轻化疗药物诱发的神经毒性已成为癌症药物治疗领域的共识难题。基于CIPN的发病机制，人们开发了大量的化合物通过阻断离子通道、靶向炎性细胞因子和抗氧化应激来预防或治疗CIPN。谷胱甘肽、锰福地吡有希望用于预防CIPN，度洛西汀[9‑12]预计对CIPN干预有效，但是这些药物预防和干预CIPN的机制还未被阐明 ；而钙镁注射[13‑15]
液、文拉法辛、盐酸米诺环素和加巴喷丁等药物预防和减轻CIPN的疗效有限 ；促红细[16]
胞生成素、薄荷醇和氨福斯汀在使用中伴随着多种不良反应 。由于化疗药物致周围神经毒性的机制尚未明确，在药物治疗上无针对的靶点，在动物实验上以已证明有应用前景的
17]
药物在大规模临床试验中也未取得预期疗效[ ，故至今未找到CIPN的特效药，临床以防治为主，药物治疗尚存争议。

[0004] 中医药是中华民族的瑰宝，具有得天独厚的中草药资源，对重大疾病慢性并发症的防治具有独特的优势。因此，发挥中医药的优势，从天然药物资源中开发可用于防治CIPN的草药具有巨大的潜力。

[0005] 参考文献：

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发明内容

[0023] 发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种刺芒柄花素在制备预防和治疗周围神经病变药物中的应用。

[0024] 技术方案：本发明公开了刺芒柄花素在制备预防和治疗周围神经病变药物中的应用。

[0025] 特别是所述刺芒柄花素在制备预防和治疗化疗药物引发的周围神经病变的药物中的应用。

[0026] 所述化疗药物为癌症化疗药。

[0027] 所述癌症化疗药包括但不局限于奥沙利铂、顺铂、卡铂、紫杉醇、长春新碱、长春碱、及其衍生物中的一种或多种。

[0028] 进一步的，所述化疗药物引发的周围神经病变的症状包括以下一种或多种：肢体末端皮肤麻术、疼痛，手套、袜套样感觉、皮肤发冷、感觉异常、蚁走感、持物无力、走路踩棉花感、烧样疼痛、闪痛和刀割样疼痛。

[0029] 本发明所述的刺芒柄花素(Formononetin)，CAS No.:85‑72‑3，其结构如下式 I所示：

[0030]

[0031] 有益效果：本发明提出了刺芒柄花素在制备预防和治疗化疗药物引发的周围神经病变的药物中的应用，进一步实验发现刺芒柄花素对奥沙利铂诱导的 ND7/23细胞的神经毒性的有保护作用；在动物模型上，刺芒柄花素对奥沙利铂诱导的小鼠周围神经毒性有保护作用。本发明的药物刺芒柄花素可以作为化疗药的佐剂用于癌症治疗，并且对化疗所致的神经毒性有缓解作用。

附图说明

[0032] 图1为刺芒柄花素和奥沙利铂对神经元细胞活力的影响；

[0033] 图2为刺芒柄花素和奥沙利铂对细胞内超氧阴离子的影响；

[0034] 图3为刺芒柄花素和奥沙利铂对神经元细胞线粒体内超氧阴离子的影响；

[0035] 图4为刺芒柄花素和奥沙利铂对神经元细胞线粒体膜电位的影响；

[0036] 图5为刺芒柄花素对OIPN模型小鼠体重的影响；

[0037] 图6为刺芒柄花素对OIPN小鼠机械疼痛阈值的影响；

[0038] 图7为刺芒柄花素对OIPN小鼠冷痛觉评分的影响。

[0039] 注：数据以均数±标准差(n＝3)表示。图1‑4采用单因素方差分析(one‑way ANOVA)，然后进行Tukey的事后比较。与对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与奥沙利铂组比较，#P<0.05，##P<0.01。图5‑7采用双因素方差分析(Two‑way ANOVA)，然后进行Tukey的事后比较。模型组与对照组比较*P<0.05，**P< 0.01；刺芒柄花素组与奥沙利铂组比较，#P<0.05，##P<0.01。

具体实施方式

[0040] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细介绍。

[0041] 实施例1：刺芒柄花素对奥沙利铂诱导的ND7/23细胞损伤有保护作用。

[0042] 1.实验材料：

[0043] 刺芒柄花素(CAS No.:85‑72‑3)和奥沙利铂(CAS No.:61825‑94‑3)均购自 MCE公司，储存液浓度均为10mM(溶于DMSO)，使用时直接稀释于培养基中。

[0044] ND7/23细胞是购自中国科学院上海细胞库的大鼠/小鼠神经元融合细胞，细胞培养于DMEM培养基(含10％胎牛血清，1％青霉素‑链霉素)，置于37℃、 5℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至70％‑80％汇合程度可用于实验。

[0045] 2.实验方法：

[0046] 将ND7/23细胞消化接种于96孔板上，每孔加入100uL细胞悬液，置于培养箱中培养过夜。第二天先用不同浓度(1μM、10μM)的刺芒柄花素处理ND7/23 细胞2小时，随后加入2.5μM奥沙利铂预共处理细胞。刺芒柄花素和奥沙利铂共处理细胞24小时后，每孔加入10μL的CCK‑8(Cat.No.:HY‑K0301,购自中国MCE公司)，培养箱孵育2小时后使用全波长多功能酶标仪(型号：Varioskan flash，购自美国Thermo Scientific公司)测定吸光度。

[0047] 3.实验结果：

[0048] 结果如图1所示，根据图示可见单独给药奥沙利铂导致细胞活力显著降低，奥沙利铂与10μM刺芒柄花素共处理时细胞活力升高，这表明刺芒柄花素对奥沙利铂造成的细胞活力降低有保护作用。采用单因素方差分析(One‑way ANOVA)，然后进行Tukey的事后比较。与对照组比较*P<0.05、**P<0.01；与奥沙利铂组比较，#P<0.05，##P<0.01。

[0049] 实施例2：刺芒柄花素能降低奥沙利铂诱导的ND7/23细胞ROS水平升高。

[0050] 1.实验方法：

[0051] 取处于对数生长期的ND7/23细胞消化后接种于96孔板上，于培养箱中孵育过夜。给药时先用不同浓度(1μM、10μM)的刺芒柄花素处理ND7/23细胞2 小时，随后加入2.5μM奥沙利铂预共处理细胞24小时。培养时间到后，弃去培养基，每孔加入100μL的ROS探针(用无血清培养基将探针DHE配置成12.5μM 溶液，将探针MitoSox red配置成5μM溶液)，避光37℃孵育30分钟。然后弃去探针溶液，用PBS清洗两遍，加入0.25％胰蛋白酶消化并吸掉胰酶，每孔加入100μL的PBS重悬细胞，用微毛细管式细胞分析计数仪进行测定(Guava easyCyte HT Flow Cytometry，购自美国Merck Millipore)(Dihydroethidium(DHE) 是一种最常用的超氧化物阴离子荧光检测探针,能有效检测细胞内超氧化物阴离子水平(CAS No.:38483‑26‑
0，购自美国Sigma Aldrich公司)。MitoSOX Red 是一种新型线粒体荧光探针，可特异性靶向线粒体，从而选择性检测活细胞线粒体释放的超氧化物(CAS No.:M36008，购自美国Thermo Scientific公司)) 。

[0052] 2.实验结果：

[0053] 结果如图2、图3所示，根据图示可见奥沙利铂单独处理ND7/23会导致细胞内和线粒体内的超氧阴离子水平显著增加，经过刺芒柄花素预处理的组别超氧阴离子水平显著低于奥沙利铂单独处理组。采用单因素方差分析(One‑way ANOVA)，然后进行Tukey的事后比较。与对照组比较*P<0.05、**P<0.01；与奥沙利铂组比较，#P<0.05，##P<0.01。

[0054] 实施例3：刺芒柄花素能改善奥沙利铂诱导的线粒体膜电位变化。

[0055] 1.实验方法：

[0056] 取处于对数生长期的ND7/23细胞消化后接种于96孔板上，于培养箱中孵育过夜。给药时先用不同浓度(1μM、10μM)的刺芒柄花素处理ND7/23细胞2 小时，随后加入2.5μM奥沙利铂预共处理细胞24小时。培养时间到后，弃去培养基，每孔加入100μL的JC‑1探针(用无血清培养基将探针JC‑1配置成10μg/ml 溶液)，避光37℃孵育30分钟。然后弃去探针溶液，用PBS清洗两遍，加入 0.25％胰蛋白酶消化并吸掉胰酶，每孔加入100μL的PBS重悬细胞，用微毛细管式细胞分析计数仪进行测定(Guava easyCyte HT Flow Cytometry，购自美国 Merck Millipore)。(JC‑1是一种广泛用于检测线粒体膜电位Ψm△的理想荧光探针(CAS No.:T3168，购自美国Thermo Scientific公司)) 。

[0057] 2.实验结果：

[0058] 结果如图4所示，根据图示可见奥沙利铂单独处理ND7/23会导致线粒体内膜电位(红色荧光/绿色荧光)显著变化，经过刺芒柄花素预处理后线粒体膜电位变化减小，10μM刺芒柄花素预处理组的线粒体膜电位比值趋于对照组的比值。采用单因素方差分析(One‑way ANOVA)，然后进行Tukey的事后比较。与对照组比较*P<0.05、**P<0.01；与奥沙利铂组比较，#P<0.05，##P<0.01。

[0059] 实施例4：刺芒柄花素对奥沙利铂诱导的小鼠周围神经病变有保护作用。

[0060] 1.实验材料：

[0061] 实验药物：奥沙利铂(CAS No.:61825‑94‑3)，刺芒柄花素(CAS No.:485‑72‑3) 均购自MCE公司。奥沙利铂用5％葡萄糖溶液配置，刺芒柄花素用2％DMSO的玉米油溶液配置。

[0062] 仪器：电子von Frey测痛仪、Plantar Test(Hargreaves method)Glass stands、 Hot Cold Plate Analgesia Meter for Mice and Rats均购自IITC(IITC Inc.Life Science,Woodland Hills,CA,USA)。

[0063] 实验动物：雄性C57BL/6小鼠，体重20‑24g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物中心，并饲养于江苏省中医药研究所SPF级实验动物房。实验温度控制在 25±1℃，自由饮水和食用动物饲料。饲养一周后开始实验。

[0064] 2.实验方法：

[0065] (1)将实验动物随机分为三组：正常组、模型组和刺芒柄花素组。

[0066] 正常组：腹腔注射溶剂；

[0067] 模型组：以5ml/kg剂量腹腔注射3mg/kg奥沙利铂5％葡萄糖溶液，给药5 天停药5天，共两个循环20天；以4ml/kg剂量腹腔注射2％DMSO的玉米油溶液，连续每天给药。

[0068] 刺芒柄花素组：预先以4ml/kg剂量腹腔注射10mg/kg刺芒柄花素溶液2小时，再以5ml/kg剂量腹腔注射3mg/kg奥沙利铂5％葡萄糖溶液。刺芒柄花素每天需要给药，奥沙利铂给药5天停药5天，共两个循环20天。

[0069] (2)将进行药物治疗的第一天定为Day1,分别在第0,6,11,16,21天进行小鼠体重和行为学测定(小鼠机械痛觉实验测定和小鼠冷痛觉实验测定)。

[0070] (A)体重：每天在同一时间点测定小鼠体重。

[0071] (B)小鼠机械痛觉实验测定：参照Meng Zhao等的方法(K.I.Meng Zhao,Saki Nakamura,TakayuK1 nakagawa,Shuji Kaneko,Acute cold hypersensitivity characteristically induced  by oxaliplatin is caused by the enhanced responsiveness of TRPA1 in mice,Molecular Pain.8(2012)55)，以机械性缩足阈值(von Frey试验) 来评估小鼠的机械性痛觉超敏。小鼠被置于(20*17*13cm)的有机玻璃方盒中，底部小鼠脚趾接触面为金属筛网。待小鼠适应测量方盒环境15分钟后处于静止时，用von Frey纤维细丝垂直刺激小鼠的足心部位，小鼠出现缩足反应后，记录电子显示应力值。每只小鼠测定10次。

[0072] (C)小鼠冷痛觉实验测定：测量前小鼠置于测量环境中适应30分钟，检测时小鼠被置于5℃的冷板上，外罩透明的有机玻璃方盒。测量时间为60s，在测量时间内记录小鼠的逃逸行为并进行评分：0分＝没有反应；1分＝轻微的冷逃逸反应，如抬起后足或倒走；2分＝强烈的冷逃逸反应，如跳起等。记录测量时间 60s内的评分总和，每只老鼠测量3次，取平均值。

[0073] 3.实验结果：

[0074] 结果如图5、图6、图7所示，根据图示可见：

[0075] (A)对小鼠体重的影响：如图5所示，对照组小鼠体重随时间呈增长趋势，模型组小鼠由于给予奥沙利铂刺激，引发胃肠道不良反应，出现明显的体重下降的现象，停药奥沙利铂期间，小鼠体重呈现缓慢增长的趋势。刺芒柄花素组小鼠在给药奥沙利铂期间体重也呈现明显降低，奥沙利铂停药后小鼠体重有所上升。刺芒柄花素组小鼠体重与模型组小鼠体重相比无显著性变化。

[0076] (B)对小鼠机械痛觉的影响：如图6所示，在测量期间，对照组小鼠的机械性缩足阈值趋于稳定。模型组小鼠的机械性缩足阈值与对照组比较显著下降；与模型组相比，刺芒柄花素组小鼠的机械痛阈值明显增高。说明刺芒柄花素能降低奥沙利铂造成的小鼠机械痛敏感。

[0077] (C)对小鼠冷痛觉的影响：实验之前每组小鼠对于冷痛觉均不敏感。如图 7所示，实验进行11天后，模型组小鼠的冷痛评分相较于对照组显著增加；第 16天和第21天测定时，相对于对照组小鼠，模型组小鼠表现出明显的冷痛敏感。从11天至21天测定时，刺芒柄花素组小鼠的冷痛评分均低于模型组，且具有显著性差异。说明刺芒柄花素能降低奥沙利铂造成的小鼠冷痛觉敏感。

[0078] 综上所述，在奥沙利铂造成的周围神经损伤模型中，小鼠对机械痛觉和冷痛觉敏感，而刺芒柄花素预给药减轻了小鼠的机械痛和冷痛觉敏感，刺芒柄花素对奥沙利铂造成的小鼠周围神经损伤有保护作用。采用双因素方差分析(Two‑way ANOVA)，然后进行Tukey的事后比较。模型组与对照组比较*P<0.05、**P< 0.01；刺芒柄花素组与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。