一种靶向半乳糖凝集素-1的放射性药物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种靶向半乳糖凝集素‑1的放射性药物及其制备方法，该药物为放射性核素、双功能螯合剂、以及PEG4‑TDGd三者的偶联物，放射性核素通过双功能螯合剂标记PEG4‑TDGd。该放射性药物在体内通过TDGd对半乳糖凝集素‑1的特异性识别以及PEG4对药代动力学的修饰，将放射性核素递送至高表达半乳糖凝集素‑1的肿瘤细胞表面或肿瘤乏氧部位，从而实现对肿瘤以及肿瘤乏氧区域的特异性核医学正电子发射计算机断层显像以及对肿瘤放射治疗等干预治疗手段疗效的监测。

权利要求

1.一种靶向半乳糖凝集素-1的放射性药物在制备用于肿瘤乏氧显像药物中的应用，其中，所述放射性药物为放射性核素、双功能螯合剂以及PEG4-TDGd三者的偶联物，所述放射性核素通过双功能螯合剂标记PEG4-TDGd；所述PEG4-TDGd的结构如式(1)所示：其中，所述放射性核素为68Ga、64Cu或18F；所述双功能螯合剂为DOTA或NOTA。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述靶向半乳糖凝集素-1的放射性药物为无色透明液体针剂。

说明书

一种靶向半乳糖凝集素-1的放射性药物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及疾病尤其是肿瘤显像诊断的放射性药物技术领域，特别涉及用于肿瘤乏氧的核医学正电子发射计算机断层(PET)显像诊断的新型小分子放射性药物及其制备方
法。

背景技术

[0002] 放疗是目前临床上对多种恶性肿瘤的重要治疗手段。在世界范围内，放疗通常应用于50％～60％肿瘤患者的治疗。放疗在早、中期的肿瘤中有较好的疗效，但在IV期肿瘤等
中，可观察到明显的耐受现象。放疗耐受削弱了放疗在治疗中的有效性，导致治疗失败、复
发等较差的预后。目前已有充足的证据证明，放疗耐受与肿瘤乏氧密切相关。在乏氧肿瘤
中，需要约三倍的辐照剂量才能达到正常氧水平肿瘤组织的治疗效果。因此，乏氧水平是预
测放疗疗效的一项重要指标。鉴于肿瘤乏氧在放疗耐受中的关键作用，如果能够对肿瘤乏
氧进行精确、无创、定量、动态地监控，将可能为肿瘤放疗疗耐受或放疗后肿瘤复发的早期
预警，并有针对性地制订或修改患者个性化治疗方案提供有效的手段。从而使得延长患者
生存期、改善预后成为可能。

[0003] 半乳糖凝集素(galectin)是糖结合凝集素大家族的一员，其特征是能通过一个保守的糖识别域(Carbohydrate recognition domain,CRD)与β-半乳糖苷紧密结合。在人类
中，半乳糖凝集素家族主要包括半乳糖凝集素-1、-2、-3、-4、-7、-8、-9、-10、-12、-13等亚
型。其中，半乳糖凝集素-1是一种14.5kD的分泌型蛋白，它在乳腺癌、肺癌、结直肠癌和神经
胶质瘤等多种肿瘤中呈现显著的高表达，并参与到血管生成、免疫抑制和肿瘤转移等多项
肿瘤恶性化进程中。

[0004] 肿瘤乏氧条件能诱导半乳糖凝集素-1的分泌，在乏氧条件下，半乳糖凝集素-1表达水平的升高在多种肿瘤(直肠癌、前列腺癌、Kaposi肉瘤、急性髓性粒细胞性白血病细胞
等)中均被发现。乏氧肿瘤细胞中半乳糖凝集素-1的表达主要受HIF-1α调控，该调控依赖于
位于Lgals1 gene转录起始位点上游441-423bp处的缺氧反应元件(HREs)的作用。针对在乏
氧区域高表达的半乳糖凝集素-1设计其特异性靶向的小分子放射性药物将会对肿瘤乏氧
的早期显像诊断以及指导监测肿瘤放疗疗效等起到重要作用。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种用于半乳糖凝集素-1特异性核医学显像的放射性药物及其制备方法，该药物制备成本低、在体内稳定性好，具有良好的肿瘤显像以及肿瘤乏氧显
像效果。

[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

[0007] 一种靶向半乳糖凝集素-1的放射性药物，所述药物为放射性核素、双功能螯合剂、以及PEG4-TDGd三者的偶联物，放射性核素通过双功能螯合剂标记PEG4-TDGd；所述PEG4-
TDGd结构如式(1)：

[0008]

[0009] 所述PEG4-TDGd为PEG4修饰的TDGd，所述TDGd为硫代二半乳糖苷(thiodigalactoside，TDG)衍生物，TDGd结构式如式(2)，所述PEG4为聚合度为4的聚乙二
醇。对于TDGd，C3位修饰三唑苯环用于增强半乳糖凝集素-1的结合特异性，C3’位修饰叠氮
基用于与炔基发生环加成反应得到三唑，用于连接PEG4。TDGd为实现半乳糖凝集素-1靶向
的分子。

[0010]

[0011] 进一步的，所述双功能螯合剂为DOTA、NOTA或二者的衍生物中的任意一种。

[0012] 进一步的，所述放射性核素为68Ga、64Cu或18F。

[0013] 进一步的，所述放射性药物为无色透明液体针剂。

[0014] 所述的用于靶向半乳糖凝集素-1的放射性药物的制备方法，包括以下步骤：

[0015] a、PEG4-TDGd的制备：将TDGd溶于PBS缓冲液中，加入炔基修饰的PEG4(Alkyne-PEG4-NH2)，再加入一价铜离子催化剂，混匀后室温反应3～5h，将反应混合液过滤后通过半
制备HPLC进行分离纯化，收集产物峰产物，冻干得白色粉末即NH2-PEG4-TDGd；

[0016] b、双功能螯合剂-PEG4-TDGd的制备：NH2-PEG4-TDGd溶于碱性缓冲液中，加入双功能螯合剂DOTA或NOTA，混匀后室温反应5h，将反应混合液通过半制备HPLC分离纯化，收集产
物峰产物，冻干得白色粉末即DOTA-PEG4-TDGd或NOTA-PEG4-TDGd；

[0017] c、放射性核素-双功能螯合剂-PEG4-TDGd的制备：将步骤b所得的DOTA-PEG4-TDGd或NOTA-PEG4-TDGd溶于弱酸性缓冲液中，加入放射性核素68Ga、64Cu或18F，其中18F标记只能
与NOTA-PEG4-TDGd反应且需要加入AlCl3，80～120℃水浴加热10～20min，制成68Ga/64Cu/
18F-NOTA-PEG4-TDGd或68Ga/64Cu-DOTA-PEG4-TDGd。

[0018] 本发明药物由半乳糖凝集素-1靶向的连接PEG4的硫代二半乳糖苷衍生物(PEG4-68 64 18
TDGd)、双功能螯合剂(DOTA或NOTA)和放射性核素( Ga、Cu或 F)构成。其中，TDGd是在硫
代二半乳糖苷(TDG)的基础上在C3位连接三唑苯环，以提高对半乳糖凝集素-1的靶向亲和
力，在C3’位增加叠氮基通过与炔基发生环加成反应连接Alkyne-PEG4-NH2合成NH2-PEG4-
TDGd。NH2-PEG4-TDGd与双功能螯合剂DOTA、NOTA或其衍生物偶联后将放射性核素68Ga、64Cu
18
或 F标记到PEG4-TDGd上，从而在体内通过TDGd与半乳糖凝集素-1的特异性识别，将放射性
核素载带到高表达半乳糖凝集素-1的肿瘤细胞或肿瘤乏氧部位，利用核医学正电子发射计
算机断层(PET)对肿瘤或肿瘤乏氧进行无创的显像诊断与指导放射治疗。

[0019] 本发明的有益效果：

[0020] 1、本发明通过对TDGd进行连接修饰，获得了放射性核素、双功能螯合剂、以及PEG4-TDGd三者的偶联物，即所述靶向半乳糖凝集素-1的放射性药物。该药物是单一的化合
物成份，与人半乳糖凝集素-1和小鼠半乳糖凝集素-1均能特异性结合。该药物在体内正常
组织(如肝脏等)及血液清除快，可以实现对肿瘤细胞或肿瘤组织的乏氧区域进行高对比度
的PET显像。

[0021] 2、本发明的半乳糖凝集素-1靶向TDGd为C3位置三唑修饰的硫代二半乳糖苷结构，C3位置连接的三唑苯环增加了对半乳糖凝集素-1的亲和力，以及体内稳定性，从而达到更
好的体内半乳糖凝集素-1靶向性。C3’连接叠氮基，可与炔基发生环加成反应得到三唑，用
于连接PEG4。

[0022] 3、TDGd连接PEG的数量为4(即PEG4)，可增加TDG小分子水溶性，延长血液循环时间，改善体内代谢情况。

[0023] 4、利用本发明的制备方法，通过双功能螯合剂(DOTA或NOTA)将放射性核素68Ga、64Cu或18F，标记到PEG4-TDGd，通过TDGd对半乳糖凝集素-1的特异性识别，将放射性核素载
带到肿瘤部位，利用无创、高灵敏、高特异、准确定量的核医学正电子发射计算机断层(PET)
对肿瘤以及肿瘤等疾病引起的乏氧进行无创的实时动态诊断显像以及指导肿瘤的放射治
疗。

[0024] 以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

[0025] 图1、放射性核素-NOTA-PEG4-TDGd结构式(其中放射性核素为68Ga、64Cu或18F)；

[0026] 图2、放射性核素-DOTA-PEG4-TDGd结构式(其中放射性核素为68Ga或64Cu)；

[0027] 图3、68Ga-NOTA-PEG4-TDGd的合成路径；

[0028] 图4、TDGd的合成路径；

[0029] 图5、18F-NOTA-PEG4-TDGd的合成路径；

[0030] 图6、68Ga-NOTA-PEG4-TDGd(68Ga-NOTA-PTDGd)与(A)小鼠半乳糖凝集素-1(mGal-1)以及(B)人半乳糖凝集素-1(hGal-1)的结合特异性；*,P<0.05；**,P<0.01；

[0031] 图7、68Ga-NOTA-PEG4-TDGd在索拉非尼(sorafenib)诱导的4T1小鼠乳腺癌乏氧模型中的生物分布(n＝4)；*,P<0.05；

[0032] 图8、68Ga-NOTA-PEG4-TDGd与乏氧显像剂18F-FMISO在索拉非尼诱导的4T1小鼠乳腺癌乏氧模型中的PET显像比较(n＝4)；箭头指示的是乏氧肿瘤部位；

[0033] 图9、68Ga-NOTA-PEG4-TDGd在荷4T1乳腺癌小鼠模型中的PET显像预测放疗疗效。

具体实施方式

[0034] 本发明实施例中所采用的材料：Alkyne-PEG4-NH2购买自西安瑞禧生物科技有限公司；1,4,7,10-tetraazadodecane-N,N′,N″,N″′-tetraacetic acid-N-
hydroxysuccinimide(DOTA-NHS)以及S-2-(4-Isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-
triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid(p-SCN-Bn-NOTA)购自美国Macrocyclics公
司；Sep-Pak C18柱购自美国Waters公司。放射性核素64Cu产于北京大学肿瘤医院核医学科；
放射性核素68Ga由68Ge-68Ga发生器淋洗获得；放射性核素18F由医用加速器生产；其他常规化
学试剂购自美国Sigma-Aldrich公司；重组小鼠半乳糖凝集素-1和人半乳糖凝集素-1购自
美国R&D Systems公司。

[0035] 实施例1：

[0036] 本实施例以放射性核素68Ga标记的NOTA-PEG4-TDGd为例。68Ga-NOTA-PEG4-TDGd放射性药物由TDGd、聚乙二醇PEG4、双功能螯合剂NOTA和放射性核素68Ga构成。其中，双功能螯
合剂NOTA可以换成DOTA，68Ga放射性核素可以换成64Cu或18F(图1和图2所示)。以68Ga-NOTA-
PEG4-TDGd为例，其制备方法如图3所示，包括以下步骤：

[0037] a、NH2-PEG4-TDGd的制备：取6μmol的TDGd溶于500μL PBS中，然后加入36μmol的Alkyne-PEG4-NH2，0.6μmol当量的CuSO4，3μmol的维C酸钠，混匀后置室温反应3～5h，然后将
反应混合液使微孔滤膜过滤后注入半制备HPLC进行分离纯化。将产物峰收集，旋蒸除去乙
腈后，经冻干机冻干成白色粉末。获得产物NH2-PEG4-TDGd共2.8mg。MALDI-TOF-MS质谱分析
结果为m/z＝742.3[MH]+(C31H47N7O12S理论值741.8)。

[0038] b、双功能螯合剂-PEG4-TDGd的制备：取2μmol的NH2-PEG4-TDGd，将其溶于500μL的0.1mol/L的NaHCO3缓冲液(pH＝8.5～9.0)中，然后加入6μmol的p-SCN-Bn-NOTA(溶于DMF)。
混匀后置室温反应5h，然后将反应混合液注入半制备HPLC进行分离纯化。将产物峰收集，旋
蒸除去乙腈后，经冻干机冻干成白色粉末。获得产物NOTA-PEG4-TDGd共1.5mg。MALDI-TOF-
MS质谱分析结果为m/z＝1192.57[MH]+(C51H73N11O18S2理论值1192.3)。

[0039] c、68Ga放射性核素-双功能螯合剂-PEG4-TDGd的制备：将20μg的NOTA-PEG4-TDGd溶于500μL的0.1M NaOAc缓冲液(pH＝5.5)中，然后向其中加入10mCi的68GaCl3淋洗液，100℃
水浴加热15min，制成本发明的68Ga-NOTA-PEG4-TDGd放射性药物。

[0040] 其中TDGd为人工制备的，不限于一种制备方法，本实施例中采用的制备方法如图4所示：

[0041] 先合成化合物1，分别转化成糖基卤化物(化合物3)和三异丙基硅硫苷(化合物4)两个结构单元后，化合物4再经脱硅活化后取代化合物2的异构溴基，得到化合物5，再除去
乙酰保护基与纯化后得到目标产物化合物6。

[0042] 步骤如下:

[0043] a、称取n当量的化合物1溶于乙腈中，加入1.5n当量的乙炔苯，1.5n当量的DIPEA，1.5n当量的CuI。反应混合物在30℃下搅拌16h。然后减压下过滤浓缩并通过柱层析进行纯
化。将n当量的中间产物溶于DCM溶液中，加入14n当量的HBr。混合物在25℃下搅拌4小时。加
入NaHCO3水溶液至无气泡，用DCM提取。有机层减压下浓缩并通过柱层析进行纯化，得到化
合物3。

[0044] b、称取n当量的化合物1溶于DCM与EtOAc 1：1溶液中，加入2n当量的TiBr4。反应混合物在30℃下搅拌12h。加入NaHCO3水溶液至无气泡，用DCM提取。有机层减压下浓缩并通过
柱层析得到化合物2。

[0045] c、在n当量的化合物2CH3CN溶液中，加入3n当量的K2CO3和1.5n当量的TIPSSH。反应混合物在25℃下搅拌2h。将反应混合物减压浓缩并通过柱层析进行纯化，得到化合物4。

[0046] d、将n当量化合物3和n当量的化合物4分别溶于在CH3CN中，加入1.5n当量的TBAF。混合物在30℃下搅拌0.1h。然后反应混合物减压下浓缩并通过柱层析进行纯化，得到化合
物5。

[0047] e、n当量的化合物5溶于在甲醇溶液中，加入5.6n当量的NaOME。混合物在30℃下搅拌3小时。加入H+树脂调节pH＝7，采用Prep-HPLC(流动相：[水(0.04％NH3H2O+10mM 
NH4HCO3)-ACN]，B％：10％～40％，10.5min)对反应液进行纯化。将纯化好的液体放入冻干机
中进行浓缩，冻干成白色粉末，得到目标产物(化合物6)。

[0048] 实施例2：

[0049] 本实施例以放射性核素18F标记的NOTA-PEG4-TDGd为例。18F-NOTA-PEG4-TDGd放射18 18
性药物由TDGd、聚乙二醇PEG4、双功能螯合剂NOTA和放射性核素 F构成。其中 F与NOTA-
PEG4-TDGd的放射性标记通过AlCl3实现，其制备方法如图5所示，包括以下步骤：

[0050] a、NOTA-PEG4-TDGd的制备同实施例1。

[0051] b、18F放射性核素-双功能螯合剂-PEG4-TDGd的制备：将20μg的NOTA-PEG4-TDGd溶于含有2mM AlCl3的0.1M NaOAc缓冲液(pH＝4.0)中，然后向其中加入150μL的乙腈以及
20mCi的18F，110℃水浴加热15min。待反应混合物冷却至室温后，用5mL的纯水稀释后通过
Sep-Pak C18柱纯化获得发明的18F-NOTA-PEG4-TDGd放射性药物。

[0052] 实施例3：

[0053] 本实施例以68Ga-NOTA-PEG4-TDGd为例，举例半乳糖凝集素-1靶向放射性药物的体内、外结合特异性鉴定及其PET显像应用。其中，68Ga-NOTA-PEG4-TDGd也可以是68Ga-DOTA-
PEG4-TDGd、64Cu-NOTA-PEG4-TDGd、64Cu-DOTA-PEG4-TDGd或18F-NOTA-PEG4-TDGd。68Ga-NOTA-
PEG4-TDGd与半乳糖凝集素-1的结合特异性：

[0054] 将重组小鼠半乳糖凝集素-1或人半乳糖凝集素-1包被到高吸附ELISA板后，将68Ga-NOTA-PEG4-TDGd加入实施放射性结合实验，其中封闭组加入过量的未标记的TDG，以检
测68Ga-NOTA-PEG4-TDGd与半乳糖凝集素-1的结合特异性。实验结果显示经TDG封闭后68Ga-
NOTA-PEG4-TDGd与小鼠半乳糖凝集素-1或人半乳糖凝集素-1的结合均显著降低(参见图
6)，证明其与小鼠半乳糖凝集素-1以及人半乳糖凝集素-1具有特异性结合。

[0055] 68Ga-NOTA-PEG4-TDGd在乏氧小鼠模型中的生物分布：

[0056] 将荷4T1小鼠乳腺癌的BALB/c小鼠分成2组，每组4只。其中一组小鼠经索拉非尼(sorafenib)灌胃诱导肿瘤乏氧，另外一组小鼠给予空白载体对照。随后各组小鼠经尾静脉
注射68Ga-NOTA-PEG4-TDGd，于注射后1h，将小鼠处死，取血、肿瘤及主要脏器，称重并测量其
放射性计数，经衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量(％ID/g)。结果显示，68Ga-NOTA-
PEG4-TDGd在索拉非尼诱导的乏氧肿瘤的摄取显著高于对照肿瘤(参见图7)。实验结果表
明，68Ga-NOTA-PEG4-TDGd在乏氧肿瘤具有特异性的高摄取。

[0057] 68Ga-NOTA-PEG4-TDGd在乏氧小鼠肿瘤模型的PET显像：

[0058] 在索拉非尼诱导乏氧的荷4T1乳腺癌BALB/c小鼠模型中，分别注射乏氧显像剂18F-FMISO以及68Ga-NOTA-PEG4-TDGd。于注射后的最佳显像时间由NanoScan PET/CT显像仪
(Mediso,匈牙利)扫描采集PET图像，比较二者的肿瘤乏氧显像特性。如图8所示，与目前临
床使用的乏氧显像剂18F-FMISO相比，68Ga-NOTA-PEG4-TDGd在腹腔的背景较低，乏氧肿瘤显
像对比度高。

[0059] 68Ga-NOTA-PEG4-TDGd小鼠PET显像预测放疗疗效：

[0060] 将19只经索拉非尼诱导乏氧的荷4T1乳腺癌BALB/c小鼠分成2组，分别为对照组和放射治疗组。其中空白对照组6只小鼠，放射治疗组13只小鼠。在第3天，放射治疗组小鼠经
尾静脉注射68Ga-NOTA-PEG4-TDGd，于注射后1h由NanoScan PET/CT显像仪扫描采集PET图
像，并对肿瘤摄取进行定量分析。根据定量的68Ga-NOTA-PEG4-TDGd在肿瘤摄取的SUV值分为
SUV>0.15(高摄取)和SUV<0.15(低摄取)组。然后，分别在第6天、8天和10天，通过X射线辐照
仪(RS2000 PRO，Radsource，美国)对放射治疗组小鼠肿瘤进行局部放疗。观察经68Ga-NOTA-
PEG4-TDGd区分的高肿瘤摄取(乏氧程度高)和低肿瘤摄取(乏氧程度低)的肿瘤放疗疗效。
实验结果可见，68Ga-NOTA-PEG4-TDGd低摄取放疗组的肿瘤治疗效果显著高于68Ga-NOTA-
68
PEG4-TDGd高摄取放疗组的肿瘤治疗效果(参见图9)。结果提示，可以通过 Ga-NOTA-PEG4-
TDGd无创PET显像评价肿瘤乏氧状态，从而早期预测放疗的疗效。

[0061] 本实施例中，本发明的半乳糖凝集素-1靶向放射性药物可以用于肿瘤的乏氧显像以及预判肿瘤放射治疗的疗效。由于本发明的放射性药物特异性结合乏氧部位的半乳糖凝
集素-1，其在其他乏氧相关疾病如脑卒中等亦可实现特异性PET显像诊断。