一株耐盐的产甲烷古菌及其应用

摘要

本发明属于微生物领域，具体涉及一株耐盐的产甲烷古菌及其应用。产甲烷古菌Methanobacterium sp.strain YSL，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.18876。该菌株是目前报道的首例能利用甲酸但不能利用氢气的产甲烷古菌，可以提高沼气池中的产甲烷效率，在生物能源方面具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一株耐盐的产甲烷古菌，其特征在于：产甲烷古菌（Methanobacterium sp. strain）YSL，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC NO. 

18876。

2.一种权利要求1所述的耐盐的产甲烷古菌的应用，其特征在于：所述菌株在以甲酸为底物产生可再生清洁能源甲烷中的应用。

3.一种权利要求1所述的耐盐的产甲烷古菌的应用，其特征在于：所述菌株胞外接受电子产生可再生清洁能源甲烷中的应用。

4.如权利要求2所述的耐盐的产甲烷古菌的应用，其特征在于：所述菌株YSL在30°C厌氧条件下，利用甲酸底物产生可再生清洁能源甲烷。

说明书

一株耐盐的产甲烷古菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一株耐盐的产甲烷古菌及其应用。

背景技术

[0002] 产甲烷杆菌YSL是一种严格厌氧的产甲烷古菌，可以利用甲酸为底物产生甲烷，革兰氏染色为阴性。

[0003] 甲烷是引起温室效应的重要气体成分。温室效应是全球变化的重要表现形式之一，而甲烷是一种强效应的温室气体，其产生的增温潜势是二氧化碳的25倍，对大气增温贡献率为14.3％，在全球碳循环过程中起着不可忽视的作用。微生物产甲烷是甲烷的主要来源，每年全球甲烷的排放量大约是500吨，其中74％是由产甲烷菌代谢产生的。产甲烷菌不仅是温室气体的贡献者也是可再生性生物能源的生产者，在有机质废弃物处理和沼气发酵等过程中都发挥着关键作用。产甲烷菌广泛分布于各种环境中，并与其它微生物协同合作产生甲烷。因此，产甲烷菌株的分离并对其开展产甲烷过程的微观机制的研究，将为合理利用产甲烷过程开发更高效的生物能源生产方式提供帮助，为预测全球气候变化提供依据。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一株耐盐的产甲烷古菌及其应用。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

[0006] 一株耐盐的产甲烷古菌，产甲烷古菌Methanobacterium sp.strain YSL，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.18876。

[0007] 所述菌株培养为每升基础培养基中加入20-30ml混合液；其中，混合液为混合液A和混合液B，混合液A为矿物质溶液、维生素溶液和微量元素按体积比为40-50:1:1的比例混合，混合液B为Na2S和L-半胱氨酸盐溶液按体积比为1:40-50的比例混合。

[0008] 所述混合液A和混合液B按体积比为1:1的比例混合；所述基础培养基为(Mineral Salt，MS)每升中包括L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；二氢磷酸钾(0.2mol/L)，20mL；磷酸氢二钾(0.2mol/L)46mL；胰蛋白胨，0.5g；大豆蛋白胨，0.5g；氧气指示剂(刃天青)，1mL；溶解后，除气(N2/CO2,80/20)灭菌，灭菌后培养基呈无色。

[0009] 一种耐盐的产甲烷古菌的应用，所述菌株在以甲酸为底物或胞外接受电子产生可再生清洁能源甲烷中的应用。

[0010] 所述菌株Methanobacterium sp.strain YSL在30℃厌氧条件下，利用甲酸底物产生可再生清洁能源甲烷。

[0011] 所述菌株Methanobacterium sp.strain YSL在30℃厌氧条件下，培养基中加入终浓度2mg/ml的万古霉素或氨苄青霉素抗生素，并添加40mmol/L甲酸钠为底物产生可再生清洁能源甲烷。

[0012] 一种耐盐的产甲烷古菌的应用，所述菌株作为耐盐的产甲烷古菌中的应用。

[0013] 本发明所具有的优点

[0014] 本发明通过分离得到的产甲烷古菌，Methanobacterium sp.strain YSL，通过鉴定和检测发现，该菌不仅能利用甲酸产甲烷，具有很强的盐和高pH适应性，同时还能直接接受胞外电子产甲烷，可以提高沼气池中的产甲烷效率，在生物能源方面具有广阔的应用前景。

附图说明

[0015] 图1为本发明实施例提供的产甲烷古菌YSL在透射电子显微镜下形态特征图；

[0016] 图2为本发明实施例提供的产甲烷古菌YSL在扫描电子显微镜下形态特征图；

[0017] 图3为本发明实施例提供的产甲烷古菌YSL16S rRNA基因系统进化树；

[0018] 图4为本发明实施例提供的产甲烷古菌YSL的生长曲线(OD600)；

[0019] 图5为本发明实施例提供的产甲烷古菌YSL不同盐度下的产甲烷量；

[0020] 图6为本发明实施例提供的产甲烷古菌YSL不同pH下的产甲烷量。

具体实施方式

[0021] 通过附图说明和具体实施例对本发明的内容作进一步详细说明。

[0022] 本发明菌株不能以氢气，乙醇和乙酸为底物生长。可以直接接受胞外电子，产甲烷菌参与有机物厌氧降解的最后一步，其能量代谢的终产物主要为甲烷，是一类严格厌氧的古菌群，其广泛分布在海水及淡水沉积物、水稻田、动物胃肠道等环境中。由于产甲烷古菌对氧气异常敏感，特别难以纯化和培养，极大地限制了对其生理特性的研究。在本发明中，产甲烷杆菌YSL菌株是从已成功建立共培养的产甲烷团聚体中获得，利用甲酸底物产生可再生清洁能源甲烷，提高了产甲烷效率，为可再生能源的研发提供了思路。

[0023] 实施例1

[0024] 产甲烷杆菌Methanobacterium sp.strain YSL的分离鉴定：

[0025] 1)取富集的产甲烷团聚体，按101～109倍梯度稀释，取稀释109倍的产甲烷团聚体接种于含有2wt％琼脂MS厌氧管中，利用亨盖特方法进行冰上滚管，30℃厌氧培养箱中培养2个星期，得到单菌落。将单菌落接种于液体MS厌氧管中，30℃厌氧培养箱中培养30天。

[0026] 2)收集厌氧管中菌株细胞，细胞通过2％磷钨酸负染后，用透射电子显微镜JEM-1400(Joel,日本)观察。细胞在2.5％戊二醛固定液中4℃固定过夜。磷酸盐洗涤细胞后，用一系列乙醇溶液(30％、50％，70％，90％和100％)梯度脱水，冷冻干燥机中干燥喷金，扫描电子显微镜(S-4800，日本日立)下形态观察如图1和图2。由图1和2可见菌株YSL为杆状，长度为1.0-2.5μm，宽为0.4μm。

[0027] 3)厌氧培养箱中取2μL菌液用于PCR扩增。PCR体系(25μL)：2.5μL Taqbuffer缓冲液；2μL dNTP底物；0.3μL Taq酶；0.5μL Ar915r反向引物；0.5μL Ar109f正向引物；2μL菌液模板；17.2μL无菌水。

[0028] PCR程序：94℃预变性，5min，细菌裂解；94℃变性，30s，DNA解链；55℃退火，30s，引物及酶结合；72℃延伸，1min；循环30次。

[0029] 引物：Ar109f(5’-ACK GCT CAG TAA CAC GT-3’)；Ar915r(5’-GTG CTC CCCCGC CAA TTC CTT TA-3’)。

[0030] 4)16S rRNA测序，测序结果在Greengens上进行序列比对，鉴定结果显示该菌与Methanobacterium subterraneum strain A8p同源性有100％的相似性，进化分析如图3所示。

[0031] 5)生理生化特征鉴定

[0032] 分别选取乙酸(20mmol/L)、乙醇(20mmol/L)、氢气(12mL/25mL厌氧管,1.01×105Pa)和甲酸(40mmol/L)为底物，产甲烷菌以10％的接菌量接种于厌氧管中培养，气相色谱(GC)检测产甲烷菌是否利用这些底物产甲烷。研究表明Methanobacterium sp.strain YSL只能利用底物甲酸生长，不能利用乙酸、乙醇及氢气底物生长。

[0033] 上述菌株保藏说明:产甲烷杆菌YSL株，Methanobacterium sp.strain YSL，由中国科学院烟海岸带研究所分离自富集界河沉积物后获取的产甲烷团聚体，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)进行保藏，保藏日期：2019年10月28日，保藏编号：CGMCC NO.18876。

[0034] 实施例2

[0035] 产甲烷杆菌Methanobacterium sp.strain YSL生长状况：

[0036] 1)培养基(Mineral Salt，MS)成分(1L)包括以下成分：配制1L基础培养基包括L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；二氢磷酸钾(0.2mol/L)，20mL；磷酸氢二钾(0.2mol/L)46mL；胰蛋白胨，0.5g；大豆蛋白胨，0.5g；氧气指示剂(刃天青)，1mL；溶解后，分装于25mL厌氧管中8mL，除氧：抽真空1min，冲N2/CO2(V/V，80/20)30s；5次循环。平衡气压后，121℃，20min高压蒸汽灭菌，灭菌后培养基呈无色。培养菌株前向上述基础培养基中每8ml加入0.2mL混合液A(矿物质溶液：维生素溶液：微量元素＝48:1:1，体积比)和0.2mL混合液B(242g/L Na2S:L-半胱氨酸盐溶液＝1:49(体积比)。底物为40mmol/L甲酸钠(0.4mL)；抗生素为终浓度2mg/ml的万古霉素或氨苄青霉素(0.2mL)，30℃培养。

[0037] 2)利用除氧注射器接种，以每管10％(1mL)的接种量接入菌液，进行紫外可见分光光度计检测生长情况，结果如图4所示。

[0038] 由图4可见Methanobacterium sp.strain YSL随着时间的培养，细胞不断地进行繁殖生长。

[0039] 实施例3

[0040] 产甲烷杆菌Methanobacterium sp.strain YSL对盐度和pH的适应性：

[0041] 将产甲烷菌接种于不同盐度(0％,0.2％,0.5％,1.0％,1.5％,2.0％,2.5％,3.0％,5.0％,10.0％)和pH(3.0,5.0,7.0,8.0,10.0)的液体厌氧管中，接种量为10％，培养过程中每5天取200μL厌氧管上空气体GC检测最大产甲烷量，不同盐度和PH下菌株产甲烷量如图5和图6所示。

[0042] 由图5和图6可见适当增加盐度(0.5-1.5％)和pH(8-10)可以加快甲烷的产生，Methanobacterium sp.strain YSL表现出很强的盐(2.5-3％)和高pH(8-10)适应性。