一种斜生栅藻叶绿体同源重组空载体及其应用

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种斜生栅藻叶绿体同源重组空载体及其应用。载体包括上下游同源臂，以及同源臂间设启动子和终止子，启动子和终止子之间插入与至少一个外源基因构成的多顺反子结构的SEQ ID NO:6所示的碱基序列；其中，上游同源臂含SEQ ID NO:1所示碱基序列，下游同源臂含SEQ ID NO:2所示碱基序列。采用本发明的斜生栅藻叶绿体同源重组空载体可实现多个外源基因在叶绿体中稳定表达。

权利要求

1.一种斜生栅藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：包括上下游同源臂，以及同源臂间设启动子和终止子，启动子和终止子之间插入与至少一个外源基因构成的多顺反子结构的SEQ ID NO:6所示的碱基序列；其中，上游同源臂为SEQ ID NO:1 所示碱基序列，下游同源臂为SEQ ID NO:2所示碱基序列；

所述同源臂间插入选择标记基因。

2.按权利要求1所述的斜生栅藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：所述上游同源臂与下游同源臂间插入至少一个启动子和终止子。

3.按权利要求1或2所述的斜生栅藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：所述重组空载体依次含上游同源臂、至少一个启动子、选择标记基因、与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:6所示的碱基序列、终止子、和下游同源臂。

4.按权利要求3所述的斜生栅藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：所述启动子为调控外源基因的启动子；或，启动子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的启动子；

其中，启动子为SEQ ID NO:3所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:4所示的碱基序列。

5.按权利要求3所述的斜生栅藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：所述终止子为调控外源基因的终止子；或，终止子为调控外源基因的终止子和调控选择标记基因的终止子；

其中，终止子为SEQ ID NO:5所示的碱基序列所示的碱基序列。

6.一种权利要求1所述的斜生栅藻叶绿体同源重组空载体在斜生栅藻叶绿体转化中的应用。

7.按权利要求6所述的应用，其特征在于：将外源基因导入至所述同源重组空载体再导入斜生栅藻细胞，经培养筛选获得转基因斜生栅藻。

说明书

一种斜生栅藻叶绿体同源重组空载体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种斜生栅藻叶绿体同源重组空载体及其应用。

背景技术

[0002] 斜生栅藻 (Scenedesmus obliquus)是淡水单细胞真核绿藻，属于绿藻门、绿液纲、绿球藻目栅藻科，通常由2或4个细胞组成定形群体。该藻细胞呈纺锤形或椭圆形，两端尖细；群体两外侧细胞的游离面有时凹入，有时降起；细胞壁平整；细胞宽3-6 µm，长13-16 µm；4个细胞组成的群体宽为12-24 µm。细胞含内有一个核蛋白和一个周生色素体。光合作用色素主要为叶绿素a、叶绿素b、叶黄素以及类胡萝卜素。正常悄况下，藻细胞呈草绿色，在营养丰富的静水屮以似亲袍子的方式进行繁殖。

[0003] 斜生栅藻应用范围非常广泛。斜生栅藻广泛分布于温暖地区池塘、沟渠及河流中，不仅在水生生态系占有重要的地位,而且在人工环境中也极易培养，因此被广泛用作轮虫、草食性鱼类、甲壳类及软体动物的饲料饵料。由于斜生栅藻对有机污染物具有较强的耐受性,因此被用作水质评价的指示生物,是甲型中污带的指示种。斜生栅藻一方面通过光合作用为细菌分解有机质提供氧气,同时还可以直接利用水体中的氮 等物质进行生长，降低水体中有机物、氮 含量，从而达到净化水质的效果。受能源危机的影响，斜生栅藻因油脂含量高且有良好的脂肪酸组成,富含亚麻酸和其他多不饱和脂肪酸，在生产生物能源方面的潜力备受关注。斜生栅藻不但可用于生产生物柴油,而且还有生产氢气和乙醇的潜能。

[0004] 利用斜生栅藻生产油脂等生物能源产品可以实现C02减排、废水净化和资源能源生产的高度稱合，不但不与人争粮争地争水；而且还能改善环境，获得“环境增值能源”以及其它高附加值产品，对社会的可持续发展具有靈大意义，但目前对斜生栅藻的分子遗传学研究还很少，为更好地调控斜生栅藻的油脂代谢和生物量积累，需从基因水平对其进行深层次的研究。

[0005] 斜生栅藻的遗传转化研究起步较晚，目前已经建立了细胞核转化系统，即利用电击转化法实现了绿色荧光蛋白的稳定表达。但是细胞核表达系统存在其固有的问题，如核基因组结构功能复杂，难以实现定向重组、定点突变；外源基因表达效率低，且表达不稳定。作为能够进行光合作用的真核生物，斜生栅藻具有叶绿体和线粒体两种具有相对独立遗传物质的细胞器。其中叶绿体遗传转化相较于细胞核转化具有以下优点：原核表达系统、叶绿体基因组定点转化、无基因沉默、外源基因表达效率高且变异小等。因此开发斜生栅藻的叶绿体遗传转化系统，对于斜生栅藻的基础研究和应用开发具有重要价值。目前尚没有专门针对斜生栅藻的叶绿体转化系统的研究，这严重阻碍了该藻的基础研究和应用开发的进展。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种斜生栅藻叶绿体同源重组空载体及其应用。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0008] 一种斜生栅藻叶绿体同源重组空载体，包括上下游同源臂，以及同源臂间设启动子和终止子，启动子和终止子之间插入与至少一个外源基因构成的多顺反子结构的SEQ ID NO:6所示的碱基序列；其中，上游同源臂含SEQ ID NO:1 所示碱基序列，下游同源臂含SEQ ID NO:2所示碱基序列。

[0009] 所述同源臂间插入选择标记基因。

[0010] 所述上游同源臂与下游同源臂间插入至少一个启动子和终止子。

[0011] 所述重组空载体依次含上游同源臂、至少一个启动子、选择标记基因、与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:6所示的碱基序列、终止子、和下游同源臂。

[0012] 所述启动子为调控外源基因的启动子；或，启动子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的启动子；其中，启动子为SEQ ID NO:3所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:4所示的碱基序列。

[0013] 所述终止子为调控外源基因的终止子；或，终止子为调控外源基因的终止子和调控选择标记基因的终止子；其中，终止子为SEQ ID NO:5所示的碱基序列所示的碱基序列。

[0014] 所述上游同源臂为SEQ ID NO:1所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:1所示的序列3’端开始，向5’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段；

[0015] 所述下游同源臂为SEQ ID NO:2所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:2所示的序列5’端开始，向3’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段。

[0016] 所述外源基因为功能蛋白基因、结构性蛋白基因以及营养型蛋白基因等；其中，功能蛋白基因如脂肪酸合成蛋白基因、光合作用相关蛋白基因等，结构性蛋白基因如细胞膜蛋白基因钙调蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等。

[0017] 一种斜生栅藻叶绿体同源重组空载体在斜生栅藻叶绿体转化中的应用。

[0018] 将外源基因导入至所述构建的同源重组空载体再导入斜生栅藻细胞，经培养筛选获得转基因斜生栅藻。

[0019] 本发明所具有的优点：

[0020] 本发明成功构建了斜生栅藻的叶绿体稳定表达系统。通过本发明能够有效地将多个外源基因重组到斜生栅藻的叶绿体基因组中，并通过筛选获得转基因藻株。与现有技术相比，本发明实现了斜生栅藻基因工程技术的重点突破，具有如下有益效果：

[0021] 1.本发明提供用于斜生栅藻叶绿体转化的叶绿体基因组同源重组位点，改位点能够保证外源基因插入和稳定遗传的同时,不影响叶绿体基因组任何基因的功能,从而不影响藻细胞的生长和生理功能等。

[0022] 2.本发明提供串联多个外源基因构成多顺反子的斜生栅藻叶绿体内源序列RBS,可保证功能相关的多个外源基因共表达。

[0023] 3.本发明提供高效的斜生栅藻内源调控序列，保证外源基因的高效转录，并适应多顺反子中多个基因的转录。

[0024] 4. 本发明提供的斜生栅藻叶绿体转化的叶绿体基因组同源重组载体，可将外源基因导入斜生栅藻中表达从而提高该藻的性能，如提高蛋白含量，增加免疫性能，提高多不和脂肪酸等含量，以及增强其固碳性能等。

[0025] 5．利用本发明提供的斜生栅藻叶绿体转化的叶绿体基因组同源重组载体，可以将高附加值次生代谢产物的代谢途径在斜生栅藻中重构从而获得光驱动的细胞工厂，拓宽斜生栅藻的应用范围。

附图说明

[0026] 图1为本发明实施例提供的斜生栅藻叶绿体同源重组空载体图谱。

[0027] 图2为本发明实施例提供的斜生栅藻叶绿体同源重组表达图谱。

[0028] 图3为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL2000;泳道Wild为野生株；泳道Mutants为阳性转基因藻株）。

[0029] 图4为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL5000;泳道Wild为野生株；泳道Mutant为阳性转基因藻株）。

[0030] 图5为本发明实施例提供的转基因斜生栅藻southern杂交图（其中泳道Wild为野生株；泳道Mutant为阳性转基因藻株）。

[0031] 图6为本发明实施例提供的转基因斜生栅藻western杂交图（其中泳道Wild为野生株；泳道Mutant为阳性转基因藻株）。

具体实施方式

[0032] 以下结合附图和实施例对本发明做进一步描述。

[0033] 实施例1 斜生栅藻叶绿体内源性片段的克隆

[0034] 设计并合成如下引物：

[0035] SEQ1-for：5’- TGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAG-3’

[0036] SEQ1-rev：5’- TTAAAAAAGCTGGACCATACTGGACTTG-3’

[0037] SEQ2-for：5’- AGGTAAAAAAGGGAATATAGCTC -3’

[0038] SEQ2-rev：5’- TCGCCGGCTCATTCTTCAACAG -3’

[0039] SEQ3-for：5’- ATAAAAATTTTAAGTTTCAAATTTTTA-3’

[0040] SEQ3-rev：5’- AATATAAAAAAATAAAAATTTAAAATTCTCC -3’

[0041] SEQ4-for：5’-ATCAAAAAAAATGTTTTTTTTTGA-3’

[0042] SEQ4-rev：5’- ATAAAAAATAAAAAAAGTATT-3’

[0043] SEQ5-for：5’-TTTTTTTTTAAAATACTTCCTCTTTAAAG-3’

[0044] SEQ5-rev：5’-CAGGTCTCTTCCCAAAATTGCG-3’

[0045] 其中引物SEQ1-for和SEQ1-rev的扩增产物是SEQ ID NO:1；引物SEQ2-for和SEQ2-rev的扩增产物是SEQ ID NO:2；引物SEQ3-for和SEQ3-rev的扩增产物是SEQ ID NO:3；引物SEQ4-for和SEQ4-rev的扩增产物是SEQ ID NO:4；引物SEQ5-for和SEQ5-rev的扩增产物是SEQ ID NO:5。

[0046] 以斜生栅藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ1-for和SEQ1-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 56℃ 30 sec, 72℃ 70 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是斜生栅藻叶绿体基因组16SrDNA-trnI序列，为1101bp，即为片段SEQ ID NO: 1。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。

[0047] 以斜生栅藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ2-for和SEQ2-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 50℃ 30 sec, 72℃ 70 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是斜生栅藻叶绿体基因组trnA-23S rDNA序列，为1071 bp，即为片段SEQ ID NO: 2。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:2的重组质粒pMD- SEQ2。

[0048] 以斜生栅藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ3-for和SEQ3-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 45℃ 30 sec, 72℃ 40 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是斜生栅藻叶绿体基因组psbA启动子，为634 bp，即为片段SEQ ID NO: 3。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO: 3的重组质粒pMD-SEQ3。

[0049] 以斜生栅藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ4-for和SEQ4-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 45℃ 20 sec, 72℃ 40 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是斜生栅藻叶绿体基因组atpA启动子，为501 bp，即为片段SEQ ID NO: 4。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。

[0050] 以斜生栅藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ5-for和SEQ5-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 45℃ 30 sec, 72℃ 30 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是斜生栅藻叶绿体基因组rbcL终止子，为340 bp，即为片段SEQ ID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:5的重组质粒pMD-SEQ5。

[0051] 实施例2：斜生栅藻叶绿体转化空载体的构建

[0052] bar-for: 5’-ATGAGCCCAGAACGACGCC-3’

[0053] bar-rev: 5’-TCATCAAATCTCGGTGACGGG-3’

[0054] 以载体pSVB为模版，经引物bar-for和bar-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min， 54℃ 30 sec，72℃ 40 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为555 bp，即为除草剂抗性基因bar。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。

[0055] 以上述产物为基础，pMD18T为出发载体通过同源重组方法构建斜生栅藻叶绿体同源重组空载体。其中pMD-SEQ2、pMD-SEQ3、pMD-SEQ5需要先利用PCR在序列5’端或3’端添加接头和酶切位点，SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、bar无须添加接头或酶切位点。

[0056] 设计并合成如下引物:

[0057] L1-for：5’- AGTATGGTCCAGCTTTTTTAAATAAAAATTTTAAGTTTCAAATT-3’[0058] L1-rev：5’-GGCGTCGTTCTGGGCTCATAATATAAAAAAATAAAAATTTAAA-3’[0059] L2-for：

[0060] 5’- CCCGTCACCGAGATTTGATGATTTTTTTTTAAAATACTTCCTCTTTAA-3’

[0061] L2-rev：5’- TCAAAAAAAAACATTTTTTTTGATCAGGTCTCTTCCCAAAATTGCG-3’[0062] L3-for：5’- CGAGCTCAGGTAAAAAAGGGAATATAGCTC -3’

[0063] L3-rev：5’- GGAATCCTCGCCGGCTCATTCTTCAACAG -3’

[0064] 以pMD-SEQ3为模版，经引物L1-for及L1-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 56℃ 30 sec, 72℃ 50 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为670 bp，即为两端含接头的SEQ ID NO: 3。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 3-1备用。

[0065] 以pMD-SEQ5为模版，经引物L2-for及L2-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，45℃ 30 sec，72℃ 40 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为380 bp，即为两端含接头的SEQ ID NO: 6。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 5-1备用。

[0066] 以pMD-SEQ2为模板，经引物L3-for及L3-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min， 55℃ 30 sec，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为1080 bp，即为5’端含SacI酶切位点，3’端含EcoRI酶切位点的SEQ ID NO: 2。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 2-1备用。

[0067] 将相同浓度（20-100ng/mL）的SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3-1、bar基因片段、SEQ ID NO: 5-1和SEQ ID NO: 4混合为模板，利用融合PCR试剂盒依次连接并通过TA克隆方法插入pMD18T载体上，命名为pMD18T-1。

[0068] 将SEQ ID NO: 2-1和pMD18T-1经过SacI和EcoRI两个酶酶切后，利用T4连接酶连接，构成斜生栅藻叶绿体同源重组空载体，命名为pSo/ch/bar。载体结构见附图1。

[0069] 1个外源基因或两个以上外源基因通过SEQ ID NO:7连接后可以通过酶切连接的方式插入pSo/ch/bar载体，从而构建斜生栅藻叶绿体表达载体，导入斜生栅藻后可实现外源基因在叶绿体中的表达。外源基因可以是功能蛋白基因如催化各种酶促反应的蛋白基因、光合作用相关蛋白基因，结构性蛋白基因如细胞膜蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等等，以及营养型蛋白基因如神经肽、抗菌肽基因等。

[0070] 下面将具有抗菌活性的两个抗菌肽基因（GenBank No.6K50_A；GenBank No. AKA60777.2）插入该载体而后导入斜生栅藻中, 通过检测这两个外源基因的表达来检测该载体的性能。

[0071] 实施例3 按照上述实施例获得的载体在斜生栅藻叶绿体转化中的应用[0072] 1．表达载体的构建

[0073] 设计并合成如下引物：

[0074] F1-for: 5’-CCTCTAGAATGCATCATCACCATCACCATGGTTTCGGTTGCAACGGTCCCTGG-3’[0075] F1-rev: 5’-TTAGTAGCACTTGCAGACGAATAAATTTTGAAATGGTGATGGTGATGGTGCAT-3’[0076] F2-for: 5’-ATGCACCATCACCATCACCATTTCTTCTTCCACATCATCAAGGG-3’[0077] F2-rev: 5’-GGGATCCTTACTTCCAGACGAGACCGTGGAT-3’

[0078] 其中，F1-for携带XbaI酶切位点及6×His标签，F1-rev的下划线序列片段为SEQ ID NO:6，斜体部分为接头；F2-for中的下划线序列为6×His标签，F2-rev携带BamHI酶切位点。

[0079] 以人工合成的抗菌肽基因1为模板，经引物F1-for及F1-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5 min预变性;94℃ 1 min, 55℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为220 bp，即为5’端含XbaI酶切位点的抗菌肽序列。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为F1。

[0080] 以人工合成的抗菌肽基因2为模板，经引物F2-for及F2-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5 min预变性;94℃ 1 min, 52℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为240 bp，即为3’端含BamHI酶切位点的抗菌肽序列。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为F2。

[0081] 将相同浓度（20-100ng/mL）的F1和F2混合，利用融合PCR试剂盒连接，而后通过XbaI和BamHI酶切连接的方式，将融合片段连接到空载体pTl/ch/bar上。获得的载体经测序验证序列准确，命名为pSo/ch/bar-anti2，其载体结构如附图2所示。

[0082] 2. 斜生栅藻的转化

[0083] 取培养至指数生长末期的藻液,6000 rpm离心lOmim收集细胞，用预冷的渗透液洗漆藻体3次，将藻细胞重悬于30mL预冷的渗透液（0.2 mol/L甘露醇），冰上放置1 h；6000 8
rpm离心10 min，收集细胞,用滲透缓冲液调整细胞数至10 个/mL；42℃热击10 min，冰浴5 min，沿管壁加入50 ug/ml质粒DNA与12.5 2 mg/mL的鲑精DNA(鲑精DNA终浓度25ug/mL)，轻轻吹打均匀，冰上放置10 min。

[0084] 将处理好的细胞混合液转移到燥预冷电击杯中，设定电击条件为电压2kv，脉冲时间3ms。转化过的藻细胞用新鲜培养液清洗两次,将藻液转移到10 mL 新鲜液体培养基的试管中，22-25℃黑暗培养18-24 h。

[0085] 3. 转化后斜生栅藻的筛选和鉴定

[0086] 将复苏培养的藻液离心浓缩后涂布于含有10 ug ml-1草丁膦固体培养平板上，使抗性的藻细胞分散生长，得到抗性单藻落。约培养20d后，平板上长出单藻落。再将单藻落挑出，并划线到含有5 ug ml-1草丁嶙的固体培养平板上，使抗性藻落进一步纯化并增强抗性。20d后，挑取单藻落至培养液中继续培养约20d，6000g离心5min，收集藻体，每个藻体湿重≥ 
100mg，然后置于液氮中冷冻备用。

[0087] 提取转基因斜生栅藻的基因组总DNA，用以进行分子鉴定。首先用PCR方法来鉴定质粒的整合情况。PCR中使用的上游引物为bar for，下游引物为bar rev，产物为bar基因，反应程序如前所述。在一部分抗性斜生栅藻基因组中扩增到了这个片段，在未转化的斜生栅藻中均未发现该片段，参见附图3。

[0088] 然后在SEQ ID NO:1 5’端上游和SEQ ID NO:2 3’端下游分别设计并合成引物，引物序列如下:

[0089] con-F for: 5’-CGATGGATACTAAGTGCTGTC-3’

[0090] con-F rev: 5’-CGCTTTCGCTTGGGCTCCGGA-3’

[0091] 这对引物con-F for和con-F rev在野生型斜生栅藻基因组总DNA中扩增到包括同源臂的片段，长度约为2300 bp；在实现同质化的转基因斜生栅藻基因组总DNA中，扩增到同源臂及全部基因表达框的片段，长度约为4300bp.

[0092] 以阳性转基因藻的全基因组DNA为模板，以引物con-F for和con-F rev进行PCR扩增。PCR反应程序为: 94℃ 1min, 59℃ 30 sec, 72℃ 50 sec，共30个循环;72℃ 5min延伸。PCR产物经电泳分离有两条带，一条2300 bp，一条4300 bp (参见附图4)，说明外源基因已插入斜生栅藻叶绿体基因组中，但并未实现全质化。

[0093] PCR有阳性结果的转基因斜生栅藻样品，要继续进行Southern杂交鉴定。以bar、抗菌肽1、抗菌肽2基因PCR产物为模板制备地高辛标记的探针，每个样品的基因组总DNA不少于4ug。利用罗氏的地高辛标记Southern杂交试剂盒进行杂交等过程，结果如附图5所示。这表明在阳性突变株中，外源片段已经稳定插入叶绿体基因组。

[0094] Southern杂交有阳性结果的转基因斜生栅藻样品，要继续进行western杂交鉴定。Western杂交使用小鼠抗His IgG和羊抗鼠IgG与辣根过氧化物酶(HRP)结合的方法对表达蛋白进行鉴定。杂交结果显示，杂交后出现了一条约28 kDa的条带和16 kDa的条带，与外源基因蛋白大小一致，而未转化的藻株的基因组中没有这个条带(参见图6)，这表明在阳性藻株中，外源蛋白已经表达。

[0095] 上述实施例表明利用本发明的载体成功实验了两个抗菌肽基因在斜生栅藻叶绿体中实现共表达，证明了本发明载体调控外源基因在斜生栅藻叶绿体中表达外源基因的能力，可以实现各种蛋白基因的表达，包含功能蛋白基因如催化各种酶促反应的蛋白基因、光合作用相关蛋白基因，结构性蛋白如细胞膜蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等等，以及营养型蛋白如神经肽、抗菌肽基因等。

[0096] 序列表

[0097] SEQ ID NO:1

[0098] 5‘-TGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATTATGCGGTTTAATTCGATGATACACGAAGAACCTTACCAGGGATTGACATGCCAGGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTTTTTAGGAACCTGGACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTAGAGTTAAGTCTTCTAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTAAAACCATTTGGAACTCTAAAGAGACTGCCGGTGTAAACCGGAGGAAGGAGAGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACATCCTGGGCTACACGCGTAATACAATGGCTAAGACAATAGGCAGCGAACCCGCGAGGGGAAGCGAATCTAGCAAACTTAGCCTCAGTTCAGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCTATACGGCGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACATGCTGGAAGCCGATCTGTCCCGAAGACAGGACGTTAACCTAGCCCCTCTGGGGATTGGAGGCTAATGTCAACGGTTGGGTTGGTGACTAATATGAAGTCGTAACAAGGTATCCGTACTGGAAGGTGTGGATGGAGAAATCTTTTTATTCATTTTTCTTTTTTTGCTTTTTTATCTTTTTTTTTTTTAAAGATAAAAAAAAGCAAAAAAAGTGGTTTATATAAATAAACCTAATTTTTATTTTTTCAATTTTATTTGTATGAATTGTTTTTTGAAACAGTCCATACAAATAAAATTGAAATTTAAAATTTTCTCTTCTCCTTTTTTTTTCAAAAAAAGTAGAAAAGAGAATCTTGGAATGTTTTGTTGATTTTTCATTTTTTTTTTCATATATTTTTTTTACTTTTTCTTTTTGAAAAAAAAATTTGAAACAAAAAGTTGAAAATAGAAAAAAAAACATTTATCTTTTTTTAAACTTTTTTTTTAAAGAAAACAATATGGACGGACCATTAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTCGCTTGATAAGCGAGAGGTTCACTGGTTCAAGTCCAGTATGGTCCAGCTTTTTTAA-3’

[0099] （a）序列特征：16S rDNA-trnI

[0100] ●长度：1101 bp

[0101] ●类型： 碱基序列

[0102]     ●链型：单链

[0103]     ●拓扑结构：线性

[0104] （b）分子类型：DNA

[0105] （c）假设：否

[0106] （d）反义：否

[0107] （e）最初来源：斜生栅藻叶绿体基因组

[0108] SEQ ID NO:2

[0109] 5‘-AGGTAAAAAAGGGAATATAGCTCAGTTGGTAGAGCATTGCCTTTGCAAGGCAAGGGCCAAGGGTTCGAATCCCTTTATTTCCACCCTTTCATTTAAAAACGAATGAAAGTGATCAAAAAAGTTTTTTTTGATTTTGCTTTTACGCTTTTTTTCAAAGAAAAAAAGCAGGAAAGCAAAAAAGTGAAAAAAAACAAAAAAGTTTTTTTATATGTATAAAAAAACTATCAATGTTTGTCAAAAAAAATATTTTTTCTGTTGAATTGATTTTGGTTTTTTATTTTTGTTTATTTTAAAAAAACTTGTTTTAATTGAAATTTTTTCTTTTAAACTTTTTTTTGAAAAAAAGCAAAAGAAAAGTAAAAGCCAAGGATGCAATTTTGCATTTTTTAGGTCAAAGAAACGAAGGCTTACGGTGGAGACCTAGGCACTCAGAGACGATGAAGGGCGCAGATACCGGCGATACGCTTCGGGGAGCTGGTAACAAGCATCGATCCGAAGATCCCCGAATAGGGCAACCTCTTAAAGAACTCCTTTTTGAATTCATAGAAAAGGAAGAGGCAACCCGGTGAACTGAAACATCTCAGTAGCCGGAGGAAAAGAAAGCAAAAGCGATTCCCGGAGTAGCGGCGAGCGAAATGGGAACAGCCTAAACCACTTTCCTTTTGGAAGTGGGGTTGTGGGAATCCAAATAAAAATCAAATGAAAATCAAATGAAAATCAAATGAAAATCAAATGAAAATCAAATGAAAATCAAATGAAAATCAAATGAAAATCAAAAAAGATGAGACGAAGCAGCTGAATCCTGCACCATAGATGGTGAAAGTCCAGTAGTCAAAAACTTTCAAACCTTGGAAAATCCCGAGTAGCATGGGACACGTGGAATCCCGTGTGAATCAGCGAGGACCACCTCGTAAGGCTAAATACTCCTGAGTGACCGATAGTGAAGAAGTACAGCGATGGAAAGGTGAAATAGAACCCCCTGTCGGGGAGTGAAAGAGAACATGAAACCGTAAGCTGACAAGCAGTGGGAGGATAATCTGACCGCGTGCCTGTTGAAGAATGAGCCGGCGA-3’

[0110] （a）序列特征：trnA-23S rDNA

[0111] ●长度：1071 bp

[0112] ●类型： 碱基序列

[0113]     ●链型：单链

[0114]     ●拓扑结构：线性

[0115] （b）分子类型：DNA

[0116] （c）假设：否

[0117] （d）反义：否

[0118] （e）最初来源：斜生栅藻叶绿体基因组

[0119] SEQ ID NO:3

[0120] 5‘-ATAAAAATTTTAAGTTTCAAATTTTTAGTTTGAAAATACAAATAAATATTTAGTTTCAAAATAAAATTAAAGATTTAATCTGAAAAACACAAACTTTTCATTTTAAATTTTTATACAATTCAAAATTCTATTTAGTTTATTCAATTTTATAAAGTTTTCAAACTTAAAAAAAAATTCAAACAAAAACAATGAAGTTTATAATTTCAAGTGTTAAAGATTTGAAATTTTAAAGATTAATAATTAGAGTTTAAAAAAATATTAATTATTAAATTTATGATTTGAAAACTTAAGTTTAATAAAAACTGAAGTATAAATTCAAATATATAAATAAAAATTTTAAATAATTAAATTTTTAATTCAAATAAAAATATTGAAACCAAATATTAAAAAATAAATTTTTTGGTGATTTATTTATGAATTTTTGATTTTTTTATGTATTCTTTAATAATGTATTTTTGTTTTTATTGAAAAATTTAAAAAAAATTGTGATAAAAAAACATCGAATAATATTTTTTAGACTAAAAATTGACATTTTTGAAATTTATGTTATATTTTTAATTAACAAGAGTTCAATTGAATTCATGAAAAATCTTTTAAAGATTCGGAGAATTTTAAATTTTTATTTTTTTATATT-3’

[0121] （a）序列特征：psbA启动子

[0122] ●长度：634 bp

[0123] ●类型： 碱基序列

[0124]     ●链型：单链

[0125]     ●拓扑结构：线性

[0126] （b）分子类型：DNA

[0127] （c）假设：否

[0128] （d）反义：否

[0129] （e）最初来源：斜生栅藻叶绿体基因组

[0130] SEQ ID NO:4

[0131] 5‘-ATCAAAAAAAATGTTTTTTTTTGATTTTGTTTTTACAACGCAAAAAAAAAGCAGAATGGACCAAATTTTTCAATTTGAAAAAATCAAAAATTTAAACTGTTTTTAATGAAAATAAAGTATTTTTTTTCCTTCTAAAAAAATTTTTTTTAATGTTCAAAATATAAAACTTTTAGAATTTTTTTTTAAGTTTGAATCTTTTTTGAAAAGATTTTATATTTTGAAACAAGCACTCCAAAAAGTATTTTTTAAAAAATTGAATTTTTCTAAAGAACAATATTTGAAAAAATTATACTTTTTAATTTTCATTTTTTCTAAAAAATAAAATTTCATAAGTATAAATTTCAAATTTTTTTTTTTTTGCTCTTACTTTTTTTGCTTTGCTGCTTTTTATCATTTTTTGCAAAGCAAAAAATGAAGAAGAAAAAAAGCGTAAAAGTGATAAAAAGCAAAAAAGCAAAAGAAGAAAAAAACTTTTAAAAAAATACTTTTTTTATTTTTTAT-3’

[0132] （a）序列特征：atpA启动子

[0133] ●长度：501 bp

[0134] ●类型： 碱基序列

[0135]     ●链型：单链

[0136]     ●拓扑结构：线性

[0137] （b）分子类型：DNA

[0138] （c）假设：否

[0139] （d）反义：否

[0140] （e）最初来源：斜生栅藻叶绿体基因组

[0141] SEQ ID NO:5

[0142] 5‘-TTTTTTTTTAAAATACTTCCTCTTTAAAGGGGAAGTATTTTTTTCTTGATTTTAGAACTCTAAAAACATAAATTGTTTATTTTTGTTTTTCATTTTCATTTATTTATTGATAAAAACAAAAGAAGCAGCAAAACAAAAAAACAAAAAAAACTAAAAAAATTTGTTTTGTTCATTTCAATAGAATAAAAAAAACAAAATTTTTCAAAAAAATTTATAAAATTATTGTAAGTTTTCAATACAAAAAATTTTTTAAAAATATTTTTTAATATGTTTTTTTTTTTTAAATTGAAAAAAAAATTCAAAACAAAGAATTTTAAAAAATAGAAGAGTTTTTAATTAA-3’

[0143] （a）序列特征：rbcL 终止子

[0144] ●长度：340 bp

[0145] ●类型： 碱基序列

[0146]     ●链型：单链

[0147]     ●拓扑结构：线性

[0148] （b）分子类型：DNA

[0149] （c）假设：否

[0150] （d）反义：否

[0151] （e）最初来源：斜生栅藻叶绿体基因组

[0152] SEQ ID NO:6

[0153] 5’-AAAATTTA-3’

[0154] （a）序列特征：rbs，核糖体结合位点

[0155] ●长度：8 bp

[0156] ●类型： 碱基序列

[0157]     ●链型：单链

[0158]     ●拓扑结构：线性

[0159] （b）分子类型：DNA

[0160] （c）假设：否

[0161] （d）反义：否

[0162] （e）最初来源：斜生栅藻叶绿体基因组 。