AMEP412蛋白对白粉虱的杀虫活性及其在防治白粉虱中的应用

摘要

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412在防治白粉虱中的应用。本发明发现了AMEP412蛋白对白粉虱的杀虫活性及其在防治白粉虱中的应用，该蛋白能够以低浓度杀伤白粉虱，且具有耐热和耐自然降解的稳定性，能够被白粉虱摄入肠道内，但并不抑制肠道内蛋白酶活性；此外，在温室内喷施AMEP412对白粉虱也取得了良好的防效；本发明为白粉虱的生物防治工作积累了新的材料。

权利要求

1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412在防治白粉虱中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的AMEP412蛋白饲喂白粉虱成虫后，达到半数致死量所需蛋白浓度为15.57 µg/ml，达到90%的致死率所需蛋白浓度为63.27 µg/ml。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的AMEP412蛋白能够被白粉虱成虫摄食进入体内，集中定位于肠道内。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的AMEP412蛋白具有耐热稳定性。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的AMEP412蛋白具有对自然降解的稳定性。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的AMEP412蛋白在温室内喷施浓度为

100µg/ml，2天后白粉虱的致死率为56%。

说明书

AMEP412蛋白对白粉虱的杀虫活性及其在防治白粉虱中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物保护与生物防治领域，涉及一种AMEP412蛋白对白粉虱的杀虫活性及其在防治白粉虱中的应用。

背景技术

[0002] 白粉虱(Bemisia tabaci)是蔬菜、棉花、观赏植物等多种农作物的重要害虫。它通过取食植物茎叶汁液和传播植物病毒来损害作物，导致农业生产和国民经济的巨大损失。
防治白粉病的主要策略是以化学杀虫剂为主。然而，白粉虱对那些过度和频繁使用的杀虫
剂产生了抗药性。有鉴于此，探索新型杀虫剂应成为新的研究热点。

[0003] 与化学杀虫剂相比，具有杀虫活性的蛋白质因为作用方式的不同，导致抗虫的概率相对较低，成为了目前杀虫剂研究的热点。关于杀虫蛋白在害虫防治中的应用已有许多
报道。最著名的例子是Bacillus thuringiensis(Bt)的Cry毒素，它被开发成Bt转基因棉花
并有效地控制鳞翅目害虫幼虫。转Bt基因棉花的广泛种植大大减少了化学农药的使用。然
而，Cry毒素对白粉虱无效。近年来，一些研究者致力于从很少被白粉虱侵染的植物中筛选
杀虫蛋白。Das等人于2009年报道了一种从大蒜叶中提取的甘露糖结合凝集素，能够有效地
抑制白粉虱。Jin等人于2012年将半夏的凝集素在叶绿体中表达，并证明其具有抗白粉虱的
能力。Shukla等人于2016年从一种食用蕨类植物中鉴定出一种杀虫蛋白(Tma12)，并在转基
因棉花中表达，该蛋白对白粉虱表现出一定的抗性。尽管这些来自于植物的杀虫蛋白具有
一定的防治白粉虱的潜力，但由于提取率低和转基因的应用受限，目前并没有广泛应用。

[0004] 在之前的研究中，我们从枯草芽孢杆菌BU412中分离鉴定了蛋白AMEP412，能够激发植物的防卫反应，提高植物的抗病性，还能够对疮痂链霉菌产生拮抗作用，是开发为生物
农药的理想候选。在本发明中，我们旨在提供AMEP412蛋白的新用途。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412的新用途，克服目前针对白粉虱的杀虫蛋白太少的问题，以及解决白粉虱的绿色防控的问题。

[0006] 本发明通过以下技术方案来实现：一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412在防治白粉虱中的应用。

[0007] 上述的枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0008] 进一步的，所述的AMEP412蛋白饲喂白粉虱成虫后，达到半数致死量所需蛋白浓度为15.57μg/ml，达到90％的致死率所需蛋白浓度为63.27μg/ml。

[0009] 进一步的，所述的AMEP412蛋白能够被白粉虱成虫摄食进入体内，集中定位于肠道内。

[0010] 进一步的，所述的AMEP412蛋白具有耐热稳定性。

[0011] 进一步的，所述的AMEP412蛋白具有对自然降解的稳定性。

[0012] 进一步的，所述的AMEP412蛋白在温室内喷施浓度为100μg/ml，2天后白粉虱的致死率为56％。

[0013] 首先使用不同浓度梯度的AMEP412蛋白对白粉虱成虫进行人工饲喂，计算半数致死率(LC50)和90％致死率所需的蛋白浓度。随后将AMEP412蛋白进行热处理和自然降解处
理，检测处理后蛋白样品对白粉虱成虫的杀虫活性，确定AMEP412蛋白的稳定性。使用FITC
标记AMEP412蛋白，饲喂白粉虱成虫后，使用荧光显微镜观察白粉虱体内荧光分布，确定
AMEP412在白粉虱体内的定位。测试AMEP412对胰蛋白酶的抑制作用，排除其通过抑制白粉
虱肠道内蛋白酶活性来杀伤白粉虱的可能。

[0014] 采用上述技术方案的积极效果：本发明发现了AMEP412蛋白对白粉虱的杀虫活性及其在防治白粉虱中的应用，该蛋白能够以低浓度杀伤白粉虱，且具有耐热和耐自然降解
的稳定性，能够被白粉虱摄入肠道内，但并不抑制肠道内蛋白酶活性；此外，在温室内喷施
AMEP412对白粉虱也取得了良好的防效；本发明为白粉虱的生物防治工作积累了新的材料。

附图说明

[0015] 图1为不同浓度的AMEP412蛋白对白粉虱成虫的致死率，相同的字母表示差异不显著，不同的字母表示处理间差异显著(α＝5％)；

[0016] 图2为经过热处理和自然降解的AMEP412蛋白对白粉虱成虫的致死率，CK表示未添加AMEP412蛋白，Untreated表示未进行处理的AMEP412蛋白，相同的字母表示差异不显著，
不同的字母表示处理间差异显著(α＝5％)；

[0017] 图3为FITC标记的AMEP412在白粉虱成虫体内的荧光定位，腹腔内的亮斑为激发的绿色荧光，显示AMEP412定位在肠道内。

具体实施方式

[0018] 以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。

[0019] 本发明中生物材料的来源：

[0020] 1、所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BU412于2016年3月30日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC M 2016142；

[0021] 2、AMEP412蛋白：专利申请号201810928176.1，专利名称“一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的新功能及其抗菌肽的鉴定”，申请日为20180814，公开日为20181228，公开号
为CN109096379A。

[0022] 实施例1

[0023] 本实施例说明枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白人工饲喂白粉虱的杀虫效果。

[0024] 饲喂用的液体人工饵料由5％酵母提取物和30％蔗糖溶于蒸馏水后灭菌，添加不同浓度的AMEP412(1、5、10、20、40和80μg/ml)，混合备用。以不含AMEP412的人工饵料为对
照。将1‑2日龄的白粉虱成虫从植物叶片上驱赶至50ml的试管中，每个试管中至少取50只白
粉虱成虫。在试管管帽上覆盖两层拉伸的封口膜，将饵料(100μl)添加至两层膜之间，然后
将管帽反向盖住管帽，使双层膜结构保持在试管内侧，并向上垂直放置。每组实验重复三
次。饲喂2天后进行死亡率的测定，通过在试管底部计数已死亡的白粉虱成虫来记录死亡
率。采用单因素方差分析(ANOVA)对数据进行分析，并采用Tukey's‑HSD试验(α＝5％)时进
行比较。通过SPSS程序的probit分析计算半数致死浓度(LC50)和90％致死浓度。

[0025] 饲喂2天后统计白粉虱死亡率，如图1所示。随着AMEP412蛋白浓度的增加，白粉虱死亡率逐渐提升，呈正相关趋势。AMEP412蛋白浓度为0、1、5、10、20、40、80mg/ml时，所对应
的白粉虱死亡率分别为7.2％、17.4％、31.0％、47.9％、65.5％、82.7％和95.6％。经软件计
算，达到半数致死率所需的AMEP412蛋白浓度为15.57μg/ml(表1)。此外，达到90％致死率所
需的AMEP412蛋白浓度为63.27μg/ml。这些结果说明AMEP412蛋白具有对白粉虱成虫的杀虫
活性，且其所需的半数致死浓度较低，说明其杀虫活性较强。

[0026] 表1 AMEP412蛋白的半数致死浓度计算结果

[0027]

[0028] 实施例2

[0029] 本实施例说明枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的稳定性实验。

[0030] 为了测试AMEP412蛋白的耐热性，将蛋白样品在95℃分别处理15分钟和30分钟。冷却后的蛋白样品按照实施例1中方法制备人工饵料，调整终浓度为60μg/ml进行白粉虱的杀
虫效果测试。以未处理的蛋白样品作为对照，每个处理重复三次。为了测试AMEP412蛋白对
自然降解的稳定性，将蛋白样品放置在1.5ml离心管中在室温25℃分别静置处理24小时和
48小时。之后蛋白样品按照实施例1中方法制备人工饵料，调整终浓度为60μg/ml进行白粉
虱的杀虫效果测试。以未处理的蛋白样品作为对照，每个处理重复三次。以上白粉虱的致死
率数据使用单因素方差分析，使用Tukey’s HSD检验(α＝5％)进行比较。

[0031] 结果显示(图2)，与未进行热处理的AMEP412蛋白相比，AMEP412蛋白经95℃处理15分钟和30分钟，对白粉虱的致死率分别下降了0.57％和0.49％，差异不显著。说明AMEP412
具有良好的热稳定性。与未进行自然放置处理的AMEP412蛋白相比，AMEP412蛋白经过25℃
自然放置24小时后，对白粉虱的致死率下降了2.73％，差异不显著。而AMEP412蛋白经过25
℃自然放置48小时后，对白粉虱的致死率下降了16.38％。虽然达到了显著差异，但是致死
率仍然有70％，故认为AMEP412蛋白具有良好的对自然降解的稳定性。这些结果说明
AMEP412具有对热的稳定性和对自然降解的稳定性，有利于在高温环境施用，并延长其作用
时间。

[0032] 实施例3

[0033] 本实施例说明枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在白粉虱体内的荧光定位。

[0034] 将AMEP412蛋白与荧光素FITC进行孵育，通过分子筛色谱层析依据分子体积差异将未与AMEP412蛋白结合的FITC除去，得到FITC标记的AMEP412蛋白。随后将FITC标记的
AMEP412蛋白饲喂白粉虱成虫。取死亡的白粉虱成虫用蒸馏水清洗后使用Olympus BX60荧
光显微镜在495nm的波长下激发绿色荧光，进行荧光显微观察。结果显示(图3)，绿色荧光集
中在白粉虱成虫腹腔的肠道内，说明AMEP412蛋白能够被白粉虱成虫摄入体内，并定位于肠
道内。这个结果提示我们AMEP412发挥杀虫作用的部位在肠道内。

[0035] 实施例4

[0036] 本实施例说明枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白对胰蛋白酶活性的影响。

[0037] 一些杀虫蛋白的作用机制是作为蛋白酶抑制剂，通过抑制昆虫肠道内的丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)的活性，使昆虫无法消化摄入的食物导致死亡。为了检测枯草芽孢杆菌
AMEP412蛋白是否作为蛋白酶抑制剂达到杀虫效果，本实施例检测了AMEP412蛋白对胰蛋白
酶活性的影响。

[0038] 胰蛋白酶的活性试验是在检测胰蛋白酶对底物N‑α‑苯甲酰‑DL‑精氨酸‑对硝基苯胺(BAPNA)进行催化产生产物的基础上进行的。BAPNA在405nm处有特殊的吸收。对胰蛋白酶
的活性影响可以通过测定吸光度的变化来确定。将0.2ml胰蛋白酶溶液(0.1mg/ml)、0.2ml 
AMEP412蛋白(0.1mg/ml)和1.6ml缓冲液(0.2M Tris HCl，pH7.8)在反应杯中孵育3分钟。酶
促反应通过添加1ml底物(1mg/ml BAPNA)开始。然后立即混合溶液，每分钟记录405nm处吸
光度的增加，持续5分钟。以不加AMEP蛋白作为对照。每次处理重复三次。抑制率的计算如
下：抑制率(％)＝(AMEP412处理ΔA405nm/分钟‑对照ΔA405nm/分钟：)*100/对照Δ
A405nm/分钟。

[0039] 结果显示(表2)，AMEP412蛋白对胰蛋白酶的抑制率为2.97％，无显著差异。说明AMEP412蛋白对胰蛋白酶活性无抑制作用，提示AMEP412的杀虫活性不是蛋白酶抑制剂的作
用机制。

[0040] 表2 AMEP412蛋白对胰蛋白酶活性的影响

[0041]

[0042] 实施例5

[0043] 本实施例说明枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在温室中对白粉虱的防控效果。

[0044] 在温室内种植番茄植株至约50cm高，将三株番茄作为一个处理，使用纱网罩住，每个网内至少接入200只1‑2日龄的白粉虱成虫。将纯化后的激发子AMEP412蛋白样品稀释至
100μg/ml进行喷施处理，以缓冲液作为对照，每个处理重复3次。喷施后2天统计白粉虱死亡
率。

[0045] 结果显示(表3)，100μg/ml的AMEP412蛋白喷施两天后，白粉虱死亡率为56.2％，具有极显著差异(α＝1％)。虽然与饲喂实验相比较，死亡率有所下降，但考虑在实际环境中的
各种因素影响，能达到50％以上的抑制率是比较理想的。因此，枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白
在温室中对白粉虱起到了良好的防控效果。

[0046] 表3 AMEP412蛋白对温室内白粉虱的防治效果

[0047]

[0048] 本发明发现了枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412的对白粉虱成虫的杀虫活性，并进一步确认了该蛋白对热处理和自然降解的稳定性，检测了该蛋白在白粉虱体内的定位，确认了
其对昆虫细胞的裂解作用。进一步的，本发明检测了该蛋白在温室内对白粉虱的防控效果，
为生物防治工作积累了新的材料和经验。