Largazole在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用

摘要

本发明公开了Largazole在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用。本发明首次证实了Largazole能够抑制Msi1基因的表达，用Largazole药物涂抹DTG小鼠后，Msi1在转录水平和翻译水平的表达都降低，通过组织学观察，免疫组化染色，发现小鼠乳腺外Paget病的症状得到了很好恢复，说明Largazole减缓小鼠乳腺外Paget病的症状，是通过降低Msi1的表达实现的。本发明为治疗小鼠及人的乳腺外Paget病提供了新的药物。

权利要求

1.Largazole在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用，其中，Largazole的结构式如下：

所述疾病为乳腺外Paget病。

说明书

Largazole在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药

物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及Largazole在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用。

背景技术

[0002] Largazole最初是由美国佛罗里达大学Luesch博士团队发现，并从蓝藻中分离出来的具有十六元环肽内酯化合物。属于组蛋白去乙酰化酶的抑制剂。在人类和鼠类细胞中发现，该药物具有良好的抗增殖活性。该药物以剂量依赖的方式作用于不同的细胞，在高浓度时对人类乳腺肿瘤上皮细胞(MDA‑MB‑231)的生长具有抑制作用，对未癌变的鼠类上皮细胞(NMuMG)不敏感。许多天然抗肿瘤药物对细胞的选择性没有如此之高。此外，对人神经母细胞瘤细胞(IMR‑32)和结肠肿瘤细胞(HT29)也具有好的抑制作用(Ying Y,2008,J Am Chem Soc,30:8455‑8459)。

[0003] Largazole包含4个结构单元，1：噻唑‑噻唑啉片段。2：β‑羟基酯片段。3：Boc‑缬氨酸片段。4：侧链。将这些片段分别合成，最后将四个单元拼接而成。合成全新的Largazole。该药属于环肽类化合物，由多种氨基酸组成，是一类结构新颖，生物活性广泛，具有独特作用机制的化合物，具有广泛的抗肿瘤及免疫抑制活性。

[0004] Largazole在低浓度(1‑3.2nM)时能将HCT116细胞周期阻滞在G1期，在高浓度(10≥nM)时将细胞周期阻滞在G2/M期。Largazole能够抑制白血病细胞，非小细胞肺癌细胞，结肠癌细胞，中枢神经系统癌细胞，黑色素瘤癌细胞，卵巢癌细胞，肾癌细胞，前列腺癌细胞，乳腺癌细胞等的增殖。促进其凋亡(Yanxia Liu,2010,The Journal of pharmacology and experimental therapeutics,335:351‑361)。

[0005] Musashi1(Msi‑1或Msi1)是一种RNA结合蛋白,序列相对保守，在果蝇中首次被发现，是细胞不对称分裂中所需要的RNA结合蛋白，在神经干细胞发育中具有重要作用。Msi‑1在干细胞的功能的维持及自我更新能力、分化和肿瘤发生方面起着重要作用。小鼠Msi1基因定位于第5条染色体,全长24518bp，由15个外显子和14个内含子构成，mRNA为1551nt，CDS区为1089nt。小鼠Msi1蛋白大小约39KD，由362个氨基酸组成，N端含有2个保守RRM(RNA Recognize Domain)结构域。此外，Msi1作为Notch信号的正调控因子，通过与numb的mRNA相互结合发挥作用。除了在神经系统发挥作用外，在肠道、肠粘膜、乳腺中，Msi‑1还是各种上皮细胞或祖细胞的一种选择性标记，Msi‑1可能在早期祖细胞中表达，并且通过调节干细胞不对称分裂发挥作用(Clarke RB，2005，Dev Biol，277:443–456)。

[0006] 研究者发现Msi‑1在胃粘膜的腔上皮细胞表达，这些细胞与上皮细胞截然不同，除了在壁细胞(泌酸细胞)中表达，在胃组织中，Msi‑1和HES5共表达，胃肠道受损后，Msi‑1阳性细胞呈鳞片状脱落，在胃组织的颈粘液细胞中Msi‑1阳性细胞的表达量是上调(Hiroshi Nagataa，2006，FEBS Letters，580(2006)27–33)。关于胃肠道损伤后如何通过自身重建来修复，一直是科学研究的热点，胃肠道受损后能够快速启动修复机制来完成上皮细胞的修复,有报道称，胃黏膜受损后能够快速修复自身上皮，胃肠上皮细胞在粘膜受损后90min内即可完成重建，可能Msi‑1参与了损伤后上皮的修复( JE，1987，Gastroenterology，93(4):753)。

[0007] 目前对于乳腺外Paget病的治疗，国内外都没有很好的治疗方法，一旦确诊，就需要采用外科手术切除的方法治疗。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供Largazole在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用。

[0009] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供Largazole在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用，其中，Largazole的结构式如下：

[0010]

[0011] 式(I)中，Me表示甲基。

[0012] 优选地，所述异位过表达是指Msi1基因在皮肤基底层中过表达。

[0013] 更优选地，所述疾病是指因Msi1基因过表达所致的Paget病。

[0014] 最优选地，所述疾病是指因Msi1基因过表达所致的乳腺外Paget病。

[0015] 第二方面，本发明提供一种用于治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物或组合物。

[0016] 小鼠体外给药时，Largazole用丙酮溶解后，配制成40μM的浓度，涂抹于患处。当Largazole作用对象为细胞时，用DMSO配制成0.3μM的浓度，然后作用于细胞。

[0017] 第三方面，本发明提供一种m‑TOR信号通路抑制剂，其有效成分为化合物Largazole。

[0018] 第四方面，本发明提供Largazole在制备治疗因m‑TOR信号通路异常激活引起疾病的药物中的应用。

[0019] 第五方面，本发明提供一种抑制Msi1基因表达的药物，其活性成分为Largazole，该药物能够治疗Msi1基因异位高表达所引起的乳腺外Paget病。

[0020] 本发明中，人类和小鼠Msi1基因在GenBank中登录号分别为NM_002442.3和NM_008629.1。

[0021] 本发明中，Largazole用于治疗乳腺外Paget病的给药方式可以是外用(涂抹、喷施)、肌注。

[0022] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

[0023] 本发明首次证实Largazole能够抑制Msi1基因的表达，在皮肤中特异性过表达Msi1后引起皮肤发生异常变化，组织学结构及分子水平都发生显著变化，过表达Msi1后引起组织学变化，通过给小鼠涂Largazole能够恢复过表达Msi1引起的组织学和分子特征的变化。通过给Msi1过表达小鼠，分别涂抹丙酮和丙酮+Largazole，然后取样，从HE染色结果来看，涂抹Largazole后，过表达Msi1小鼠的表型得以恢复，从转录水平和翻译水平检测Msi1，发现涂抹Largazole后，Msi1在转录水平和翻译水平的表达都降低。说明Largazole减缓小鼠乳腺外Paget病的症状，是通过降低Msi1的表达实现的。本发明为治疗小鼠及人的乳腺外Paget病提供了新的药物。

附图说明

[0024] 图1为本发明实施例1中乳腺外Paget病小鼠模型的构建过程示意图。A鼠(K14rtta转基因小鼠)与B鼠(TRE‑Msi1转基因小鼠)进行杂交。

[0025] 图2为本发明实施例1中乳腺外Paget病小鼠模型鉴定结果。A:K14rttA，500bp；B:Tre‑msi1，300bp、500bp。

[0026] 图3为本发明实施例1中基因Musashi1过表达小鼠的基因型鉴定结果。A：对照；B：Msi1过表达小鼠(DTG小鼠)。

[0027] 图4为本发明实施例1中DTG小鼠PAS染色结果。箭头所指是阳性细胞。

[0028] 图5为本发明实施例1中paget样病标志物的免疫组化染色结果。

[0029] 图6为本发明实施例1中HE染色结果。其中，Msi1过表达的DTG小鼠，出现细胞变大，细胞质淡染的paget样细胞，在涂抹了Largazole后，paget样细胞明显变少。疾病症状减轻。

[0030] 图7为本发明实施例1中免疫组化染色结果。其中，对照鼠：DTG转基因小鼠涂丙酮。实验鼠:DTG转基因小鼠涂Largazole。结果表明涂largazole小鼠的Msi1的表达水平明显下降，证明Largazole可抑制Msi1的表达。

[0031] 图8为本发明实施例1中在转录水平上验证Msi1基因的表达水平。其中，DTG小鼠涂丙酮作为对照，DTG小鼠涂Largazole作实验组，结果发现涂Largazole后,Msi1的转录水平表达受到抑制，进而使得由于Msi1异位高表达，所引起的乳腺外paget病的标志物，如Mmp9,Vimentin,Erbb2,Podoplanin,Krt8,Krt7,Gata3的转录水平表达显著降低，结果表明，Largazole能够使Msi1的表达水平受到抑制，进而使得乳腺外paget病的症状减弱。

[0032] 图9为本发明实施例1中western blot检测结果。其中，前2个泳道为DTG小鼠涂丙酮(Ace)，后两个泳道为DTG小鼠涂Largazole，通过western blot可以看出，涂Largazole后，Msi1的翻译水平表达明显降低。

[0033] 图10为本发明实施例1中通过体外细胞实验证实Largazole能够抑制Msi1的表达。其中，在Lovo细胞(结肠癌细胞)中，通过添加不同浓度的Largazole,结果表明不同浓度的Largazole都能抑制Msi1的转录水平表达。但是添加0.3μM以上浓度时，对Msi1的抑制效果基本保持不变。证明Largazole具有剂量依赖性。

[0034] 图11为本发明实施例1中体外细胞实验的western blot检测结果。其中，在Lovo细胞中，通过添加0.3μM Largazole,在添加24h时提取蛋白样品，western blot结果表明，添加0.3μM Largazole时，能显著减弱Msi1蛋白水平的表达。

[0035] 图12为本发明实施例1中乳腺外paget病的特征性或病理性标志物的表达情况。其中，20μM Largazole涂抹小鼠皮肤后，DTG涂丙酮小鼠中，pS6,m‑TOR表达升高，m‑TOR通路激活，DTG小鼠涂Largazole后，抑制了m‑TOR通路。在DTG小鼠中，由于Msi1异位过表达，表现出乳腺外paget病的症状，Largazole药物作用后，乳腺外paget病的特征性或病理性标志物，如K8,Vimentin，Podoplanin的表达明显减少。因此，Largazole药物作用后，乳腺外paget病的症状减弱。

[0036] 其中，图6、图7、图12中bar为25μm。

具体实施方式

[0037] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0038] 化合物Largazole参见Li‑Chuan Wu,Zhe‑Sheng Wen,Ya‑Tao Qiu.etal(2013)Largazole Arrests Cell Cycle at G1 Phase and Triggers Proteasomal Degradation of E2F1 in Lung Cancer Cells,ACS Med.Chem.Lett,4,921‑926。

[0039] 实施例1Largazole在治疗因Msi1基因过表达所致的乳腺外Paget病中的应用[0040] (一)乳腺外小鼠paget病模型(可诱导的小鼠模型)的制备

[0041] 本实施例制备了由Doxycyline(Dox)控制Musashi1表达的转基因小鼠模型(DTG小鼠)。通过给小鼠饲喂Dox，诱导外源基因Musashi1过表达。在Musashi1过表达48h(即Dox给药48h)后，即可出现初期乳腺外paget病的症状。

[0042] DTG小鼠的具体制备方法如下：

[0043] 将K14rtta转基因小鼠与TRE‑Msi1转基因小鼠进行交配(两种转基因小鼠的构建方法参见Wang S,Li N,Yousefi M,Nakauka‑Ddamba A,Li F,Parada K,et al.(2015)Transformation of the intestinal epithelium by the MSI2 RNA‑binding protein.Nat Commun 6:6517)，产生子代小鼠，待子代小鼠长到6周时，向小鼠的饮水中添加终浓度为0.2g/L的四环素，让小鼠自由饮水，保证饮水充足，诱导基因Musashi1过表达。饲喂四环素48h后，即可出现乳腺外paget病样症状的小鼠，即乳腺外小鼠paget病模型(DTG小鼠)。

[0044] DTG小鼠基因型的鉴定：

[0045] 1、提取小鼠基因组DNA作为模板，以F1和R1为引物，进行PCR扩增(PCR靶为K14rtta基因)，检测扩增产物，出现500bp的特征条带。PCR反应体系：mix 6μL(康维世纪，货号：01037/30252)，F1 0.6μL，R1 0.6μL，基因组DNA模板1μL，ddH2O 3.8μL。反应程序：95℃
5min；95℃30s，61℃30s，72℃30s，35个循环；72℃2min。

[0046] 2、提取小鼠基因组DNA作为模板，以F2和R2为引物，进行PCR扩增(PCR靶为TRE‑Msi1基因)，检测扩增产物，出现300bp和500bp两条特征条带。PCR反应体系：mix 6μL(康维世纪，货号：01037/30252)，F2 0.6μL，R2 0.6μL，G 0.6μL，基因组DNA模板1μL，ddH2O 3.2μL。反应程序：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃2min。

[0047] 同时满足上述1和2的鉴定为乳腺外Paget病小鼠。若出现其他的基因型，均为同窝对照小鼠。

[0048] 所用引物序列如下(SEQ ID NO:1‑5)：

[0049] F1:5′‑CACGATACACCTGACTAGCTGGGTG‑3′

[0050] R1:5′‑CACGATACACCTGACTAGCTGGGTG‑3′

[0051] F2:5′‑CCCTCCATGTGTGACCAAGG‑3′

[0052] R2:5′‑GCACAGCATTGCGGACATGC‑3′

[0053] G:5′‑GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG‑3′

[0054] (二)小鼠药物处理

[0055] 待DTG小鼠长到6周时，剃除小鼠背部毛发，剃除干净后，开始涂药，每天涂药一次，连续涂药5天。取样前停止涂药。

[0056] 涂药的具体方法为：对于同窝小鼠，给部分DTG小鼠涂丙酮(对照组)，另一部分DTG小鼠涂Largazole(以丙酮配制，Largazole浓度为40μM，实验组)，每只小鼠每天涂药200μL(能够完全覆盖小鼠背部皮肤)。涂药第3天时，分别给两组实验鼠的饮水中添加0.2g/L Dox，让小鼠自由饮水，保证饮水充足，诱导基因Musashi1过表达。与此同时，继续涂药，共涂药5天。第5天涂药完毕后开始取样，进行后续实验。

[0057] (三)取样

[0058] 以同窝出生，涂丙酮的DTG小鼠作为对照组。涂Largazole+丙酮的DTG小鼠作为实验组。颈部脱臼处死小鼠，用电推剪把背部毛发剔除干净，用剪刀取一小长方形背部皮肤，用4％的多聚甲醛固定24h后，PBS清洗3次，每次20min，使用刀片修剪成约1cm×0.75cm大小的组织块。剪角(顺着毛发方向)，切掉一小块，准备脱水。

[0059] (四)脱水

[0060] 脱水程序及步骤如下

[0061]

[0062] 后3步温度设定为60℃，用来溶解蜡，其余都是常温。

[0063] (五)包埋

[0064] 石蜡包埋，竖立包埋，然后切成5μm大小，在39℃水浴锅中展片，实体显微镜下观察是否完全展开，把展平的片子用粘附性载玻片捞取，晾干。

[0065] (六)小鼠表型分析(HE染色)

[0066] 苏木精‑伊红染色法(hematoxylin‑eosin staining),简称HE染色法,该方法是细胞学，组织学，胚胎学以及病理学中使用最常见的方法，能够直观的观察组织细胞的异常变化。

[0067] 1.烤片：63℃，1h。

[0068] 2.脱蜡，水化。

[0069] 3.二甲苯I:15min。

[0070] 4.二甲苯II:15min

[0071] 5.梯度乙醇处理：

[0072] 100％乙醇I,II：各5min

[0073] 95％乙醇I,II：各5min

[0074] 80％乙醇:5min

[0075] 70％乙醇:5min

[0076] 蒸馏水：5min

[0077] 苏木精：10min

[0078] 自来水：5min

[0079] 95％乙醇I,II：各3min

[0080] 伊红：10s

[0081] 95％乙醇I,II：各3min

[0082] 100％乙醇I,II：各3min

[0083] 二甲苯I:10min

[0084] 二甲苯II:10min

[0085] 封片，拍照。

[0086] (七)免疫组化

[0087] 1.烤片：63℃，1h。

[0088] 2.脱蜡，水化。

[0089] 3.二甲苯I:15min。

[0090] 4.二甲苯II:15min。

[0091] 5.梯度乙醇处理：

[0092] 100％乙醇I,II：各5min

[0093] 95％乙醇I,II：各5min

[0094] 80％乙醇:5min

[0095] 70％乙醇:5min

[0096] 蒸馏水：5min。

[0097] 6.抗原修复：pH＝6.0的柠檬酸钠煮沸20min。

[0098] 7.自然冷却：1h左右。

[0099] 8.PBS:处理3次，5min/次。

[0100] 9.H2O2:避光20min。

[0101] 10.PBS:处理3次，5min/次。

[0102] 11.封闭：封闭液作用至少1h。

[0103] 12.一抗：按照适当比例与量加入现配制好的一抗，4℃过夜。

[0104] 13.复温：室温放置半小时。

[0105] 14.PBS:处理3次，5min/次。

[0106] 15.B液：室温30min。

[0107] 16.PBS:处理3次，5min/次。

[0108] 17.C液：室温30min。

[0109] 18.PBS:处理3次，5min/次。

[0110] 19.蒸馏水：处理5min。

[0111] 20.DAB:根据抗体的特点，在显色合适的时间下，终止显色，放入蒸馏水中。

[0112] 21.苏木精：复染5min。

[0113] 22.自来水：处理5min。

[0114] 23.梯度乙醇处理：

[0115] 70％乙醇:3min

[0116] 80％乙醇:3min

[0117] 90％乙醇:3min

[0118] 100％乙醇:3min

[0119] 二甲苯I:5min

[0120] 二甲苯II:5min

[0121] 封片，拍照。

[0122] 其中，B液、C液来自于中杉金桥试剂盒，目录号：sp9001，sp9002。

[0123] (八)定量PCR

[0124] 1.提取RNA

[0125] (1)取小鼠皮肤样品，剃背部毛发，剪成长1.5cm×宽1cm大小的皮肤块，加入1mL TRIzol试剂(样品体积不超过TRIzol体积的10％)，用组织匀浆仪破碎组织。

[0126] (2)每1mL TRIzol中加入0.2mL氯仿，剧烈振荡混匀15s，室温放置2min。然后12000g、4℃离心15min，小心吸取上清400μL到无Rnase的离心管中。

[0127] (3)在上述上清中加入400μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min，然后12000g、4℃离心10min。

[0128] (4)小心弃去上清，加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)，上下轻轻把沉淀弹起来，12000g，4℃离心3min，弃上清，空离2min。吸去多余的乙醇。

[0129] (5)加入30μL DEPC水重悬沉淀RNA，冰上放置30min，一部分样品用于反转录，进行定量PCR，其余样品放在‑70℃保存。

[0130] 2.反转录合成cDNA

[0131] 反转录体系：

[0132]

[0133] 70℃，5min。冰上冷却3min。

[0134] cDNA的合成：

[0135]

[0136] 42℃，60min。然后70℃，15min，获得cDNA。

[0137] 3.定量PCR

[0138] PCR反应体系：

[0139]

[0140] 定量PCR引物(5′‑3′)：

[0141] MSI1 F:CACTTCCATGAAATCAACAACAA

[0142] R:GGCTGGGCTTTCTTGCATT

[0143] MMP9 F:GCAGAGGCATACTTGTACCG

[0144] R:TGATGTTATGATGGTCCCACTTG

[0145] ERRB2 F:TGCAGGGAAACCTGGAACTC

[0146] R:ACAGGGGTGGTATTGTTCAGC

[0147] PODOPLANIN F:ACCGTGCCAGTGTTGTTCTG

[0148] R:ACCATGCCGTCTCCTGTACC

[0149] KRT8 F:AAGGTCTGGAAGCCCAGATT

[0150] R:CTTGGTGGTGACAACTGTGG

[0151] KRT7 F:AGGAGATCAACCGACGCAC

[0152] R:GTCTCGTGAAGGGTCTTGAGG

[0153] GATA3 F:AAGCTCAGTATCCGCTGACG

[0154] R:GTTTCCGTAGTAGGACGGGAC

[0155] PCR反应条件：95℃10min；95℃10s，60℃10s，72℃10s，45个循环。

[0156] (九)Western blot

[0157] 1.提取蛋白质

[0158] (1)剃除小鼠背部毛发，取长约1.5cm，宽1cm的皮肤块，向样品中加入400μL IP细胞裂解液，混匀。PMSF：IP体积比为1:100，使PMSF终浓度为1mmol/L,用匀浆机将组织分散均匀。

[0159] (2)冰上摇动30min,使组织得到充分裂解。

[0160] (3)4℃，12000g离心10min，取上清，进行后续的Western操作。

[0161] 2.蛋白浓度的测定

[0162] 用碧云天BCA测定试剂盒，按照说明书测定每个样品的浓度。

[0163] 3.蛋白电泳

[0164] (1)按照上一步测定的浓度，按照每个样品50μg的上样量，加样。

[0165] (2)电泳：电压60v，当marker跑过了浓缩胶，将电压变为90v。直到溴酚蓝跑到胶的下边缘，停止电泳。准备转膜。

[0166] (3)转膜：全湿法转膜，电流：330mA，时间：1h。

[0167] (4)封闭：5％脱脂奶粉，1h。

[0168] (5)一抗:musashi1,分子量：39KD，鼠源，1：1000稀释比例，4℃过夜。

[0169] (6)二抗：1h。

[0170] (7)显影。

[0171] 其中，一抗：Msi1(购自MBL公司,稀释比例1：1000,货号：D270‑3)。内参β‑tubulin(购自上海翊圣生物科技有限公司,稀释比例1：4000)，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠IgG(H+L)，编号：A0192，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，编号：A0216，购自上海翊圣生物科技有限公司,稀释比例1:10000。

[0172] 图1为乳腺外Paget病小鼠模型的构建过程示意图。A鼠(K14rtta转基因小鼠)与B鼠(TRE‑Msi1转基因小鼠)进行杂交。

[0173] 图2为乳腺外Paget病小鼠模型鉴定结果。A:K14rttA，500bp；B:Tre‑msi1，300bp、500bp。

[0174] 图3为基因Musashi1过表达小鼠的基因型鉴定结果。A：对照；B：Msi1过表达小鼠(DTG小鼠)。

[0175] 图4为DTG小鼠PAS染色结果。箭头所指是阳性细胞。

[0176] 图5为paget样病标志物的免疫组化染色结果。

[0177] 图6为HE染色结果。其中，Msi1过表达的DTG小鼠，出现细胞变大，细胞质淡染的paget样细胞，在涂抹了Largazole后，paget样细胞明显变少。疾病症状减轻。

[0178] 图7为免疫组化染色结果。其中，对照鼠：DTG转基因小鼠涂丙酮。实验鼠:DTG转基因小鼠涂Largazole。结果表明涂largazole小鼠的Msi1的表达水平明显下降，证明Largazole可抑制Msi1的表达。

[0179] 图8为在转录水平上验证Msi1基因的表达水平。其中，DTG小鼠涂丙酮作为对照，DTG小鼠涂Largazole作实验组，结果发现涂Largazole后,Msi1的转录水平表达受到抑制，进而使得由于Msi1异位高表达，所引起的乳腺外paget病的标志物，如Mmp9,Vimentin,Erbb2,Podoplanin,Krt8,Krt7,Gata3的转录水平表达显著降低，结果表明，Largazole能够使Msi1的表达水平受到抑制，进而使得乳腺外paget病的症状减弱。

[0180] 图9为western blot检测结果。其中，前2个泳道为DTG小鼠涂丙酮(Ace)，后两个泳道为DTG小鼠涂Largazole，通过western blot可以看出，涂Largazole后，Msi1的翻译水平表达明显降低。

[0181] 图10为通过体外细胞实验证实Largazole能够抑制Msi1的表达。其中，在Lovo细胞(结肠癌细胞)中，通过添加不同浓度的Largazole,结果表明不同浓度的Largazole都能抑制Msi1的转录水平表达。但是添加0.3μM以上浓度时，对Msi1的抑制效果基本保持不变。证明Largazole具有剂量依赖性。

[0182] 图11为体外细胞实验的western blot检测结果。其中，在Lovo细胞中，通过添加0.3μM Largazole,在添加24h时提取蛋白样品，western blot结果表明，添加0.3μM Largazole时，能显著减弱Msi1蛋白水平的表达。

[0183] 图12为乳腺外paget病的特征性或病理性标志物的表达情况。其中，20μM Largazole涂抹小鼠皮肤后，DTG涂丙酮小鼠中，pS6,m‑TOR表达升高，m‑TOR通路激活，DTG小鼠涂Largazole后，抑制了m‑TOR通路。在DTG小鼠中，由于Msi1异位过表达，表现出乳腺外paget病的症状，Largazole药物作用后，乳腺外paget病的特征性或病理性标志物，如K8,Vimentin，Podoplanin的表达明显减少。因此，Largazole药物作用后，乳腺外paget病的症状减弱。

[0184] 以上实验结果表明：

[0185] 在体外细胞实验中，通过实时定量PCR和western blot首次证实Largazole能够抑制Msi1的表达。而且抑制效果明显。

[0186] 在诱导Msi1异位过表达的小鼠模型中，在使用Largazole药物后，疾病症状paget样细胞基本消失，症状减轻。

[0187] 在体外小鼠模型中，在使用Largazole药物后，通过免疫组化发现，Msi1的蛋白表达水平明显下降。

[0188] 在转基因小鼠模型中，使用丙酮和Largazole药物涂抹后，通过提取RNA,定量PCR检测，发现paget样的marker在涂抹Largazole药物后，表达水平都下降，表明涂Largazole药物后，paget样疾病减轻。

[0189] 可见，Largazole通过抑制Msi1基因的异位表达，减缓paget样疾病。

[0190] 目前，Largazole在小鼠EMPD病(乳腺外Paget病)治疗上已经取得非常不错的效果，关于Largazole药物用于人的临床试验，目前正在研制乳膏。不久将有望用于治疗EMPD疾病。

[0191] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。