一种靶向沉默害虫模式识别蛋白GNBP3基因表达的重组真菌及在害虫防治中的应用

摘要

本发明公开了一种靶向沉默害虫模式识别蛋白GNBP3基因表达的重组真菌及在害虫防治中的应用，本发明构建了能抑制或者阻断GNBP3基因转录的重组白僵菌。从而使得在重组白僵菌侵染害虫时，害虫体内抗菌肽表达显著下调，减弱或中断害虫识别免疫虫生真菌的信号传导，使害虫更易感染虫生真菌等病原微生物而致死。重组白僵菌显著提高害虫的死亡率，缩短死亡时间，并有浓度依赖性。将其与微生物源杀虫剂苏云金芽孢杆菌Bt或粘质沙雷氏菌结合，可以显著提高重组白僵菌对害虫的死亡率和死亡时间，说明其是一种很好的微生物杀虫剂的增效剂，不提提高杀效果，拓宽了杀虫谱，降低了微生物杀虫剂耐药性，是一种环境友好的微生物源杀虫剂。

权利要求

1.小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3、小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3的片段、小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3中的任一作为害虫防治靶点的应用；

所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体能够抑制权利要求1中所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3或小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3的片段的转录，或沉默权利要求1所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3。

3.一种重组菌，其特征在于，携带有权利要求2所述的重组表达载体。

4.权利要求2所述重组表达载体或权利要求3所述重组菌在防控害虫中的应用。

5.一种防控害虫的方法，其特征在于，抑制权利要求1中所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3或小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3的片段的转录。

6.权利要求3所述重组菌作为增效剂在制备杀虫剂或防控害虫中的应用。

说明书

一种靶向沉默害虫模式识别蛋白GNBP3基因表达的重组真菌

及在害虫防治中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种靶向沉默害虫模式识别蛋白 GNBP3基因表达的重组真菌及在害虫防治中的应用。

背景技术

[0002] 全世界有科学记载的昆虫大约有150万种，约占地球生物物种的一半，其中约有45％的昆虫是以绿色植物的叶片为食物危害植物，以农作物为食的昆虫会严重硬性农作物
的品种产量，进而影响农户收益。

[0003] 目前农业害虫的防治主要依赖化学农药，但化学农药的大量使用导致触目惊心的环境污染，给人类的健康造成了严重的危害，同时提高了昆虫的耐药性，因此，选择有效而
无污染的害虫生物防治越来越受到重视。

[0004] 虫生真菌在昆虫种群密度调控及有害昆虫生物防治方面发挥着重要的作用，已经鉴定种类有750多种，主要分布于子囊菌及结合菌门。昆虫虫生真菌非常适合做生物杀虫
剂，其中子囊菌类的金龟子绿僵菌、蝗绿僵菌和球孢白僵菌等被开发成为重要的害虫生物
防制剂。虫生真菌可大规模培养并能够长期保存，真菌孢子适合于常见的农林喷淋设备，与
化学杀虫剂比较，昆虫致病性真菌对哺乳动物的毒性小，且对环境影响微不足道，昆虫致病
性真菌具有对害虫可持续性控制特点，被广泛地用于农林害虫的防治。世界范围内注册使
用的商业剂型真菌杀虫剂达170余种，在农业、林业及草原等害虫生物防治中取得了良好的
生态、经济及社会效益。

[0005] 但是害虫的免疫防御反应极大地延缓了目前使用的真菌杀虫剂的杀虫效率，昆虫的先天性免疫系统由细胞免疫和体液免疫组成。虫生真菌侵染昆虫，穿过体壁进入昆虫血
腔时，遭受到昆虫的先天性免疫系统的防御，抑制或杀死了虫生真菌，阻碍了真菌的继续繁
殖，直接延缓了虫生真菌的杀虫效率。

[0006] 细胞免疫主要是血细胞(主要为浆细胞和粒细胞)针对外来异物产生的吞噬和包被作用；体液免疫主要的器官为脂肪体，诱导产生抗菌肽并将其释放到血淋巴中，同时包括
溶菌酶作用及酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)级联反应等，配合细胞免疫联合进行防
御反应。当受到外来病原侵染时，昆虫天然免疫的起始是识别外来异物，随后引发、激活丝
氨酸蛋白酶和解除丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞外级联反应，启动Toll或Imd信号转导途径
而诱导不同抗菌肽的产生和酚氧化酶级联反应，杀死/抑制侵染的外源微生物。以黑腹果蝇
Drosophila melanogaste r为模型的昆虫免疫研究取得了巨大的发展，明确了其对异物的
识别主要是由不同模式识别蛋白(pattern recognition proteins,PRPs)来实现的。另一
方面，与昆虫免疫识别相对应，昆虫病原物通过长期的进化适应，发展出不同的免疫逃避机
制，逃避或战胜宿主细胞的免疫识别及免疫防御，引起昆虫发病或最终杀死宿主昆虫。昆虫
免疫与其病原物之间的相互作用是一个动态的过程，体现在分子、细胞、个体到种群的不同
水平。任何免疫应答反应启动的开关按钮是昆虫对入侵外源物质或异物的识别作用。昆虫
存在一套完善的系统可以清楚的识别“自己”与“非己”成分。昆虫免疫开关依赖于模式识别
受体(PRRs)对病原相关分子模式(PAMPs)或微生物相关分子模式(MAMPs)的识别与结合，从
而激活相关的免疫信号通路。PAMPs或MAMPs包括微生物的核酸、蛋白、脂类、脂蛋白，通常位
于病原体生存所必需的保守结构中，是特异性激活先天性免疫通路的配体。昆虫的模式识
别受体主要包括肽聚糖识别蛋白(PGRPs)、革兰氏阴性菌结合蛋白(GNBPs)、β‑1,3‑葡聚糖
识别蛋白(βGRP)、C型凝集素(CTL)、清道夫受体(scavenger receptor)、血淋巴类免疫球蛋
白(hemolin)和硫脂蛋白(TE Ps)。模式识别蛋白对“异己”识别后，机体便会启动自身的免
疫机制，将“危险信号”放大。细胞内信号转导后，激活昆虫体内Toll、Imd和STAT信号途径，
将“危险信号”向下游传递下去，最终激活效应因子的表达，从而保护昆虫。

[0007] 小菜蛾(Plutella xylostella L.)属于世界性十字花科害虫，由于其食性广泛、世代周期短等特点，给农作物生产带来了极大的损失，长期以来化学药物滥用使小菜蛾产
生了严重的抗药性，同时增加了防治的难度。人们一直在寻找高效低毒的替代措施，尤其是
微生物杀虫剂。但是目前尚无能够逃逸其体内对于入侵微生物的识别作用的微生物杀虫
剂。

发明内容

[0008] 本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种靶向沉默害虫模式识别蛋白GNBP3基因表达的重组真菌及在害虫防治中的应用。

[0009] 本发明的第一个目的是提供一种小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3基因。

[0010] 本发明的第二个目的是提供一种小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3。

[0011] 本发明的第三个目的是提供所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3基因、所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3的片段、所述小菜蛾模式识别受体蛋白 GNBP3、或所述小菜
蛾模式识别受体蛋白GNBP3的片段任一作为害虫防治靶点的应用。

[0012] 本发明的第四个目的是所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3、所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3的片段、所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNB P3、或所述小菜蛾模
式识别受体蛋白GNBP3的片段任一的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。

[0013] 本发明的第五个目的是提供一种重组表达载体。

[0014] 本发明的第六个目的是提供一种重组真菌。

[0015] 本发明的第七个目的是提供一种防控害虫的方法。

[0016] 本发明的第八个目的是提供所述重组菌作为增效剂在防控害虫中的应用。

[0017] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

[0018] 本专利选择的模式识别受体基因是识别入侵病原物的开关按钮‑革兰氏阴性菌结合蛋白基因GNBP3，并构建以小菜蛾GNBP3基因为靶标的重组载体，获得了一株含有GNBP3的
重组白僵菌菌株。利用真菌侵染小菜蛾的过程，将外源质粒整合到小菜蛾基因组中，重组白
僵菌对小菜蛾的致死效果明显，死亡率提高明显，死亡时间缩短。进一步将重组白僵菌与微
生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌(Baci llus thuringiensis,Bt)和粘质沙雷氏菌(Serratia 
marcescens,Sm)混合使用，发现可以大大提高杀虫效率。

[0019] 因此本发明要求保护以下内容：

[0020] 一种小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

[0021] 一种小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0022] 所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3、所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3的片段、所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3、或所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3
的片段任一作为害虫防治靶点的应用。

[0023] 所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3、所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3的片段、所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3、或所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3
的片段的任一抑制剂在制备杀虫剂中的应用。

[0024] 优选地，所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0025] 优选地，所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3的片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

[0026] 进一步本发明还要求保护一种重组表达载体，其特征在于，通过靶向所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3或其片段，沉默所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3，和/
或抑制所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3的表达。

[0027] 本发明并不限制该重组表达载体的类型，目前常用的RNAi载体，或CRISPR 载体均可。

[0028] 优选地，所述重组载体为RNAi载体，所述重组表达载体含有所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3或其片段，或所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因 GNBP3或其片段的反
向互补序列。

[0029] 优选地，所述RNAi载体为pSilent载体。

[0030] 进一步本发明还要求保护一种重组菌，携带有所述的重组表达载体。

[0031] 优选地，所述表达载体为白僵菌。

[0032] 更优选地，所述重组菌为携带含有核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3的片段的pSilent载体的白僵菌。

[0033] 所述重组表达载体或所述重组菌在防控害虫中的应用，也属于本发明的保护范围。

[0034] 同时本发明要求保护一种防控害虫的方法，沉默所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3，和/或抑制所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3的表达。

[0035] 优选地，所述害虫包括但不限于甜菜夜蛾，斜纹夜蛾，亚洲玉米螟等等农业害虫。

[0036] 这种方法也同样适用于防治其他害虫，比如甜菜夜蛾，斜纹夜蛾，亚洲玉米螟等等农业害虫。只要筛选出这些害虫的模式识别蛋白GNBP3基因的cDNA序列，构建了一系列重组
白僵菌，运用于害虫的生物防治。

[0037] 优选地，所述方法利用以上所述重组菌或重组表达载体沉默以上所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3，和/或抑制以上所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP3的表达。

[0038] 进一步，本发明还保护了所述重组菌作为增效剂在防控害虫中的应用。

[0039] 重组白僵菌增强了苏云金芽孢杆菌Bt和粘质沙雷氏菌Sm对害虫小菜蛾的致病效4 7
果，在重组白僵菌为10 浓度下，与苏云金芽孢杆菌Bt结合，小菜蛾死亡率重组白僵菌为10
4
结果一致。在重组白僵菌为10浓度下，与粘质沙雷氏菌 Sm结合，与小菜蛾死亡率重组白僵
6
菌为10相比，杀虫时间缩短了半天。

[0040] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0041] 本发明基于RNA干扰技术，以模式识别蛋白基因GNBP3为靶标，利用基因工程手段构建能抑制或者阻断GNBP3基因表达的重组白僵菌。从而使得在白僵菌侵染害虫的同时，害
虫体内抗菌肽表达显著下调，减弱或中断害虫识别免疫虫生真菌的信号传导，使害虫更易
感染虫生真菌等病原微生物。害虫死亡率提高，死亡时间缩短。而且，还能作为增效剂使用，
提高了微生物杀虫剂的使用效率和使用范围，扩大了杀虫谱，降低微生物杀虫剂耐药性出
现，是一种IPM推崇的综合生物防治方法。本发明以害虫免疫系统为靶标，研发能抑制害虫
免疫系统、对人畜安全、环境健康的真菌活性杀虫剂，有效提高自然界存在的病原微生物对
害虫的自然控制作用，延缓微生物耐药性的出现。

附图说明

[0042] 图1为小菜蛾GNBP3基因的核苷酸及推导的氨基酸序列图。

[0043] 图2为小菜蛾GNBP3基因的时空表达模式。

[0044] 图3为三种真菌侵染小菜蛾后GNBP3的表达模式检测。

[0045] 图4为GNBP3基因的PCR扩增和重组质粒的双酶切鉴定；1：GNBP3的 PCR扩增；2：重组质粒T‑GNBP3的双酶切鉴定；3：重组质粒pSilent‑GNBP3 的BglⅡ/KpnⅠ双酶切鉴定；4：重
组质粒pSilent‑GNBP3的XhoⅠ/HindⅢ双酶切鉴定。

[0046] 图5为重组白僵菌的图片。

[0047] 图6为RNAi后小菜蛾GNBP3基因的表达情况。

[0048] 图7为RNAi后小菜蛾抗菌肽Cecropin 1和Cecropin 2基因的表达情况。

[0049] 图8为RNAi后小菜蛾抗菌肽Cecropin3和Moricin基因的表达情况。

[0050] 图9为RNAi后小菜蛾抗菌肽Lysozyme1和Lysozyme 2基因的表达情况。

[0051] 图10为RNAi后小菜蛾的死亡率统计图。

[0052] 图11重组白僵菌与微生物协作侵染小菜蛾的死亡率统计图。

具体实施方式

[0053] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊
说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和
材料。

[0054] 表1本发明实施例中引物序列：

[0055]

[0056]

[0057] 实施例1小菜蛾革兰氏阴性菌结合蛋白基因GNBP3 cDNA序列的克隆

[0058] 一、实验方法

[0059] 1、GNBP3基因的Unigene扩增

[0060] 根据实验室所测定的小菜蛾转录组数据库，生物信息学分析筛选获得GNBP3 Unigene序列，为了确保序列GNBP3正确性，根据设计Unigene一对引物(GNBP3FUni和
GNBP3RUni)，引物序列见表1。

[0061] 以小菜蛾cDNA为模板，PCR扩增Unigene序列，产物回收后T克隆，抽提重组质粒后pMD18‑T‑GNBP3，PstI和EcoR I双酶切鉴定重组质粒 pMD18‑T‑GNBP3，将酶切鉴定正确的重
组质粒pMD18‑T‑GNBP3送广州艾基生物技术有限公司测序。测序结果用DNAMAN软件对比，用
在线生物学网站http: //www.ncbi.nlm.nih.GOv/blast进行序列分析，确认Unigene序列
为GNBP3的部分序列。

[0062] 2、GNBP3基因的全长cDNA的扩增

[0063] 根据RACE试剂盒，合成模板5’RACE cDNA和3’RACE cDNA，以测序正确的GNBP3 Unigene序列分别设计两条5’和3’RACE引物，3’RACE引物为 GNBP3‑3F1和GNBP3‑3F2，5’
RACE引物为GNBP3‑5R1和GNBP3‑5R2，引物序列见表1，3’RACE/5’RACE引物与通用引物配对，
进行半嵌套式PCR扩增。、 T克隆5’和3’RACE PCR产物，最后测序鉴定5’和3’RACE PCR产物。
利用 DNAstar软件将测序正确5’和3’RACE产物进行拼接，获得cDNA全长序列。

[0064] 为了确保序列拼接准确，重新设计一对GNBP3基因全长开放阅读框的特异性引物，GNBP3ORFF和GNBP3ORFR，引物序列见表1，以小菜蛾cDNA为模板，进行RT‑PCR扩增全长cDNA，
酶切和PCR鉴定后，测序最终确认GNBP3 cDNA序列。

[0065] 二、实验结果

[0066] 利用RT‑PCR结合RACE技术克隆到小菜蛾GNBP3全长cDNA序列，及其 GNBP3推导的氨基酸序列如图1所示。由图1可知，小菜蛾GNBP3基因全长 cDNA序列1485bp(其核苷酸序列
如SEQ ID NO：1所示)，5’UTR为126bp， 3’UTR为60bp，开放阅读框为1299bp，编码432个氨基
酸残基(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)。蛋白分子质量为48.36kDa，等电点为5.92。
GNBP3 基因序列中含有β‑1,3‑葡聚糖识别位点、N‑端糖类结合域、糖基水解酶区域以及层
粘连G蛋白区域。

[0067] 实施例2小菜蛾GNBP3基因的时空表达模式

[0068] 一、实验方法

[0069] 选取健康的小菜蛾不同发育阶段包括卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫的样品。选取健康的4龄小菜蛾幼虫，冰上解剖收集头部、血淋巴、中肠、马氏管、脂肪体、表皮6个组织样品。

[0070] 抽提所有样品总RNA和合成cDNA第一链。根据小菜蛾GNBP3全长cDNA 序列和小菜蛾RPS13基因cDNA序列，分别设计两对荧光定量PCR引物。GNBP3 定量引物为GNBP3引物
GNBP3‑qF和GNBP3‑qR，Rps13引物为Rps13‑qF和 Rps13‑qR，引物序列见表1，RT‑qPCR反应体
系为25μL：ddH2O 8.5μL，SYBR Premix ExTaqⅡ12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板1μ
L。反应体系配好之后混匀，短时间内快速离心。在Bio‑CFX 96TM仪器进行反应，反应程序设
置为两步法，反应温度设置为：预变性95℃，3min；循环温度95℃，10s，60℃，采集荧光信号；
95℃，10s；熔解温度65℃‑95℃，5s，采集信号。反应结束后首先对反应的扩增曲线和熔解曲
线进行分析，数据是否可用。定量结果处理采用 进行计算基因相对表达，计算结果利
用软件Graph PadPrism7 绘制柱形图。利用IBM SPSS Statistics20软件分析数据差异性。
利用实时荧光定量PCR(qRT‑PCR)检测小菜蛾GNBP3在不同发育历期和不同组织中的表达
量。

[0071] 二、实验结果

[0072] 利用qRT‑PCR检测了小菜蛾GNBP3基因在4个不同发育历期和6个不同组织的转录水平，结果如图2所示。由图2A可知，小菜蛾GNBP3基因在小菜蛾 4个龄期都有表达，在蛹期
GNBP3基因的相对表达量较高，其次是幼虫和成虫，卵期基因表达量较低；由图2B可知，小菜
蛾GNBP3基因在中肠中的表达量最高，其次是脂肪体和表皮，小菜蛾GNBP3基因在其他组织
部位表达偏低，如血细胞、头部和马氏管。且血细胞的表达高于头部，在马氏管中的表达量
最低。说明小菜蛾GNBP3在不同的部位表达量不一样，所参与的功能也不一样。

[0073] 实施例3小菜蛾GNBP3基因对真菌的敏感性检测

[0074] 一、实验方法

[0075] 将实验室保存三种虫生真菌，白僵菌(Beauveria  bassiana)、绿僵菌 (Metarhizium anisopliae)和玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)转接到PDA平板，然后
置于25℃培养箱(12L:12D)中培养7天。待产孢后，在平板上加入20mL 0.05％吐温‑80溶液，
用接种环轻刮平板上的孢子，将配置的溶液倒入烧杯，磁力搅拌器搅拌30min。待孢子完全
分散后,用双层医用纱布过滤菌液，获得孢子悬浮液。用血球计数器计数母液孢子浓度，用
8
0.05％的吐温‑80溶液配成1.0×10 CFU/mL的孢子悬浮液，备用。

[0076] 选取发育一致4龄第一天小菜蛾幼虫，采用体壁浸泡法处理小菜蛾。具体方法：将48
龄第一天小菜蛾完全浸泡在孢子悬浮液(1.0×10 CFU/mL)中10s，用滤纸吸去多余液体后
正常饲养，每隔12h取样，直到72h，在冰上解剖获取小菜蛾脂肪体，保存于Trizol中。0.05％
吐温80处理小菜蛾作为阴性对照，同样在 12‑72h内取样，在冰上解剖获取小菜蛾脂肪体，
保存于Trizol中。抽提所有样品总RNA并反转录成cDNA第一链。利用RT‑qPCR检测小菜蛾
GNBP3基因在三种不同真菌诱导下的时间表达模式。

[0077] 二、实验结果

[0078] RT‑qPCR检测小菜蛾GNBP3基因的结果如图3所示。由图3可知，三种虫生真菌强烈诱导小菜蛾GNBP3的基因转录水平48h达到最高，其中白僵菌诱导小菜蛾GNBP3的基因转录
水平最好。在12h～72h时内，白僵菌强烈诱导小菜蛾GNBP3的基因转录水平，在48h带到最高
峰，与对照相比，提高了25倍。在12h～48h时，玫烟色棒束孢对小菜蛾GNBP3的基因转录水平
诱导一直在增强，60‑72h则开始下降。绿僵菌侵染小菜蛾后，GNBP3基因表达量显著增强，与
对照相比，表达量提高了20倍。RT‑qPCR检测结果表明三种虫生真菌可以强烈诱导小菜蛾
GNBP3基因的表达。

[0079] 实施例4小菜蛾模式识别受体GNBP3的RNA干扰载体构建

[0080] 一、实验方法

[0081] 小菜蛾GNBP3和GFP片段的获得

[0082] 根据GNBP3基因保守区域选择一段500bp序列，设计两对引物 dsGNBP3‑F1、dsGNBP3‑F2、dsGNBP3‑R1和dsGNBP3‑R2，其中，F1带有酶切位点XhoⅠ(CTCGAG)，R1带有Hind
Ⅲ(AAGCTT)的酶切位点，F2带有酶切位点BglⅡ(AGATCT)，R2带有酶切位点KpnⅠ(GGTACC)，
引物序列见序列表1。为了构建pSilent‑GFP质粒，设计了4条引物，GFP‑F1，GFP‑F2，GFP‑R1， 
GFP‑R2，其中，F1带有酶切位点XhoⅠ(CTCGAG)，R1带有HindⅢ(AAGCTT) 的酶切位点，F2带有
酶切位点BglⅡ(AGATCT)，R2带有酶切位点KpnⅠ (GGTACC)，。具体引物序列见表1，则根据
F1/R1和F2/R2配对，RT‑PCR扩增目的基因GNBP3和GFP。PCR产物回收、目的片段T克隆，质粒
转化到大肠杆菌DH5α菌株中，PCR验证和双酶切鉴定，最终送公司测序鉴定获得阳性克隆
子，保证在目标片段的两端引入正确的酶切位点。

[0083] 二、实验结果

[0084] RT‑PCR扩增小菜蛾GNBP3片段的产物，结果如图4所示，片段大小与预期大小相符。进一步将GNBP3片段克隆T载体，双酶切鉴定结果如图4所示。目标片段的核苷酸序列如SEQ 
ID NO：3所示，进一步测序鉴定，确保在GNBP3 序列的两端引入正确XhoI/HindⅢ和BglII/
KpnI的酶切位点。对GFP基因，方法跟GNBP3一致，同样确保序列的GFP两端带有各自的XhoI/
HindⅢ和BglII/KpnI 的酶切位点。将带有目标基因GNBP3和GFP的质粒保存‑20℃，同时保
存相应甘油菌‑80℃备用。

[0085] 二、重组质粒pSilent‑GNBP3和pSilent‑GFP的构建

[0086] 将测序正确的外源片段GNBP3(其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)和 pSilent‑1质粒同时进行XhoI/HindⅢ双酶切，切胶回收目的片段GNBP3(和酶切后的pSilent‑1质粒进
行连接、转化、PCR验证、抽提重组质粒进行双酶切鉴定，结果如图4。将酶切鉴定正确的质粒
进一步送公司测序鉴定。将测序鉴定正确的重组质粒保存质粒和甘油菌。将重组质粒和
GNBP3基因用BglII/KpnI双酶切，回收，连接、转化、PCR验证、抽提重组质粒进行BglII/KpnI
双酶切验证后，公司测序进一步确认了GNBP3序列正确的引入到表达载体pSilent‑1中。说
明重组干扰载体pSilent‑GNBP3成功构建。重组载体pSilent‑GFP方法参考 pSilent‑GNBP3
构建过程。

[0087] 酶切反应体系：

[0088] 带有酶切位点GNBP3片段的双酶切反应体系100μL：(1)dd H2O 52μL、 (2)回收产物30μL、(3)10×Buffer 10μL、(4)XhoI(BglII)4μL、(5)HindⅢ (KpnI)4μL；

[0089] pSilent‑1双酶切反应体系100μL：(1)dd H2O 67μL、(2)Psilent质粒15μL、 (3)10×Buffer 10μL、(4)XhoI(BglII)4μL、(5)HindⅢ(KpnI)4μL。

[0090] 37℃酶切5h后，对酶切产物进行1.0﹪琼脂糖凝胶电泳检测，分别割胶回收质粒和PCR片段。将pSilent‑1质粒酶切产物与PCR产物酶切产物连接，连接体系如下：(1)PCR产物
酶切产物14μL、(2)pSilent质粒酶切产物3μL、(3)T4 DNA Ligase 1μL、(4)T4 DNA Ligase 
Buffer 2μL。

[0091] 反应连接混合液置于16℃过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑单克隆，摇菌，抽质粒，双酶切(XhoⅠ/HindⅢ)鉴定正确后的重组质粒送艾基生物技术有
限公司测序。

[0092] 测序正确的质粒与带酶切位点BglⅡ/KpnⅠ的PCR产物分别酶切。37℃酶切5h，反应完毕后，对酶切产物进行1.0﹪琼脂糖凝胶电泳回收。测序正确的质粒酶切产物与PCR产物
酶切产物连接后，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑单克隆，摇菌，抽质粒，双酶切(Bgl
Ⅱ/KpnⅠ)鉴定正确的重组质粒送艾基生物技术有限公司测序。保存甘油菌和重组质粒备
用。

[0093] 实施例5小菜蛾RNA干扰载体pSilent‑GNBP3的验证

[0094] 一、实验方法

[0095] 1、白僵菌原生质体的制备

[0096] 将白僵菌在PDA培养基上25℃，相对湿度80％黑暗培养3天左右；产孢后，将孢子转入200ml含100ml PD培养基的三角瓶中，25℃，120rpm振荡培养 15h；无菌条件下，将培养的
菌液过滤至50mL离心管中；44℃，5000rpm，离心10min，弃上清；用0.7mol/L Na Cl溶液重悬
沉淀，4℃，5,000rpm，离心8 min，弃上清；在50ml离心管中加入酶解液，置于30℃，100rpm恒
温振荡酶解 8h；菌丝酶解后，过滤混合液；滤液转移至新离心管中，4℃，4000rpm离心0min；
弃上清；0.7mol/L的NaCl溶液重悬沉淀4℃，4000rpm离心8min；弃上清；用5mL STC溶液重悬
沉淀4℃，4000rpm离心5min，弃上清；在离心管中加入1mL STC溶液，得到原生质体。

[0097] 2、重组质粒转化白僵菌原生质体

[0098] 将重组质粒pSilent‑GNBP3和pSilent‑GFP 10μg分别加入到含有1ml混匀的原生质体中；沿管壁加1.74mL PTC溶液，冰上放置20min；向离心管中加入2mL 再生液体培养基，
冰上放置2min；向离心管中加入4mL再生液体培养基，冰上放置2min；向离心管中加入4mL再
生液体培养基，加入10μL Amp+(50μg/mL)， 25℃，120rpm，45度斜放再生14h左右。将再生的
培养物4℃，4000rpm离心 15min，弃上清使管内液体剩5mL左右，镜检再生情况，视浓度加再
生液体培养基稀释，取200μL涂于再生固体培养基(600μg/mL潮霉素B、50μg/mL Amp+)，25℃
黑暗培养3天左右。

[0099] 3、重组白僵菌的筛选

[0100] 从培养的板上挑取单菌落于再生固体培养基上，25℃黑暗培养一周左右；待产菌丝后，以菌丝为模板，构建RNA表达载体时所用引物进行PCR扩增。取5μL PCR产物进行1.0﹪
琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察是否有预期大小目标带出现。将有PCR扩增结果的菌株，进
一步广州艾基生物技术有限公司测序鉴定。将正确序列的菌珠，保存甘油菌，‑80℃保存备
用。

[0101] 4、重组白僵菌的培养

[0102] 将原始白僵菌和重组白僵菌(pSilent‑GNBP3，pSilent‑GFP)接种于PDA平板上，置于25℃培养箱中培养，待平板上长满重组白僵菌孢子后，用0.05％吐温 80将孢子冲洗下
来，双层纱布过滤除去杂质，将配置的溶液倒入烧杯，磁力搅拌器搅拌30min。待孢子完全分
散后,用双层医用纱布过滤菌液，获得孢子悬浮液。用血球计数器计数母液孢子浓度，用
6
0.05％的吐温‑80溶液配成1.0×10 CFU/mL的孢子悬浮液，即获得重组白僵菌pSilent‑
GNBP3和重组白僵菌 pSilent‑GFP孢子悬浮液，备用。

[0103] 5、重组白僵菌的处理和样品的收集

[0104] 取同一批次发育良好的小菜蛾四龄第一天幼虫，将分别带有pSilent‑GNBP3 重组6 6
白僵菌孢子悬浮液(1×10CFU/ml)和pSilent‑GFP重组白僵菌孢子悬浮液 (1×10 CFU/ml)
处理小菜蛾。即完全浸泡在重组菌株的孢子悬浮液中10s，用滤纸吸去多余水分后正常条件
下饲养，12h后解剖小菜蛾的表皮、中肠和脂肪体三个组织，每隔12h取一次样品，直到60h
6
后。以0.05％吐温80稀释原始的白僵菌孢子液稀释至1×10 CFU/ml作阴性对照，以含有
6
pSilent‑GFP(1×10CFU/ml) 的重组白僵菌孢子作为无干扰RNA对照。

[0105] 6、GNBP3基因的转录表达模式

[0106] 收集小菜蛾三个组织样品，抽提其总RNA和合成cDNA第一链。根据小菜蛾 GNBP3全长cDNA序列和小菜蛾RPS13基因cDNA序列，分别设计两对荧光定量 PCR引物。GNBP3定量引
物为GNBP3引物GNBP3‑qF和GNBP3‑qR，Rps13引物为 Rps13‑qF和Rps13‑qR，引物序列见表1，
RT‑qPCR反应体系为25μL：ddH2O 8.5μL， SYBR Premix ExTaqⅡ12.5μL，上游引物1μL，下游
引物1μL，模板1μL。反应体系配好之后混匀，短时间内快速离心。在Bio‑CFX 96TM仪器进行
反应，反应条件：95℃30s,40个循环95℃5s,60℃10s。利用RT‑qPCR检测GNBP3 基因在三个
组织的表达情况。

[0107] 7、RT‑qPCR检测抗菌肽基因的表达

[0108] 为了进一步验证GNBP3基因是否调控Toll信号通路中的终端效应因子。选取了小菜蛾6个抗菌肽基因Cecropin1、Cecropin2、Cecropin3、Moricin、 Lysozyme1、Lysozyme2各
自的引物序列见表1。利用RT‑qPCR检测了6个下游效应因子基因在小菜蛾体内三个组织的
转录水平。

[0109] 二、实验结果

[0110] 1.重组白僵菌

[0111] 将鉴定正确的重组白僵菌pSilent‑GNBP3进行PDA培养，结果如图5所示，由图可知，重组白僵菌pSilent‑GNBP3的生长状态很好。重组白僵菌pSilent‑GNBP3孢子悬浮液，结
果如图5所示。由图可知真菌孢子饱满，可以处理实验小菜蛾。

[0112] 2.小菜蛾GNBP3的表达模式检测

[0113] 重组白僵菌处理4龄小菜蛾后，RT‑qPCR检测GNBP3基因的mRNA转录水平，结果如图6所示。由图6可知，小菜蛾GNBP3基因在中肠、表皮和脂肪体中都显著降低，其中表皮的表达
量下降最多，达到差异极显著水平(p<0.01)。在中肠中，GNBP3基因在12‑60h内一直处于低
水平表达，与对照相比一直被抑制表达。表皮中，重组白僵菌处理小菜蛾后，在12‑60h内，
GNBP3基因显著被抑制表达，达到差异极显著水平(p<0.01)；脂肪体中，重组白僵菌处理小
菜蛾后，在12‑48h内GNBP3基因显著被抑制表达，达到差异显著水平(p<0.05)， 60h，GNBP3
基因下调不明显。说明重组白僵菌能够干扰GNBP3，从而降低 GNBP3基因的表达。

[0114] 2.小菜蛾抗菌肽基因的表达模式检测

[0115] 重组白僵菌处理4龄小菜蛾后，RT‑qPCR检测抗菌肽基因(Cecropin1、 Cecropin2、Cecropin3、Moricin、Lysozyme1、Lysozyme2)的mRNA转录水平，结果如图7～9所示。由图7～
9可知，小菜蛾抗菌肽基因的转录水平都降低了，只是被抑制的表达模式不同。由图7可知，
抗菌肽Cecropin1在小菜蛾脂肪体和表皮中的表达都强烈下调。在脂肪体中的下调最大，
Cecropin1在脂肪体中下调水平达到95倍，表皮下调11倍。抗菌肽Cecropin2在小菜蛾三种
组织中的表达都强烈下调。Cecropin2在脂肪体中下调水平达到32倍，表皮下调9倍，中肠下
调3倍。

[0116] 由图8可知，抗菌肽Cecropin3和Moricin在小菜蛾脂肪体、表皮和中肠的表达都强烈下调。在脂肪体中的下调最大，Cecropin3在脂肪体中下调水平达到 50倍，表皮下调11
倍。抗菌肽Cecropin2在小菜蛾三种组织中的表达都强烈下调。Cecropin2在脂肪体中下调
水平达到32倍，表皮下调9倍，中肠下调3倍。

[0117] 由图9可知，抗菌肽Lysozyme1和Lysozyme1在小菜蛾脂肪体、表皮和中肠的表达都强烈下调。种抗菌肽基因的表达量都被强烈抑制表达，尤其是在表皮和脂肪体，所有的抗菌
肽基因都被强烈抑制表达，尤其是Cecropin2、Lysozyme1 和Lysozyme2在脂肪体中被强烈
抑制表达，与对照相比达到30、90和100倍以上。说明PxGNBP3基因能够被抑制表达，进一步
抑制下游抗菌肽基因的表达。

[0118] 实施例6小菜蛾RNA干扰载体pSilent‑GNBP3的生物测定

[0119] 一、实验方法

[0120] 1、不同浓度重组白僵菌的杀虫效果

[0121] 将构建好的重组白僵菌pSilent‑GNBP3，制备成浓度为104、105、106、107孢子/ml的孢子悬浮液。

[0122] 选取发育一致健康小菜蛾3龄第一天幼虫。将制备好的孢子悬浮液104 CFU/ml、5 6 7
10CFU/ml、10CFU/ml、10CFU/ml分别处理100头小菜蛾。采用体壁浸泡法，即将小菜蛾完全
浸泡在各自的孢子悬浮液中10s，用滤纸吸去多余液体后正常饲养，每隔24h记录一次，记录
每天小菜蛾的死亡数目和存活数目，一直记录到168h。将0.05％吐温80和白僵菌做相同处
理作为对照。统计小菜蛾在不同浓度重组白僵菌下的存活率，实验独立重复三次，进行生物
学统计。

[0123] 2、重组白僵菌对苏云金芽孢杆菌Bt和粘质沙雷氏菌Sm的增效作用

[0124] 将实验室保存粘质沙雷氏菌(S.marcescens)和苏云金芽孢杆菌 (B.thuringiensis)的甘油菌分别接种到新鲜的不含任何抗性的LB培养基中，37 ℃，
240rpm过夜培养种子菌，将种子菌1:100接种到新鲜的不含任何抗性的LB 培养基中，37℃，
240rpm，OD600＝0.8，12000g离心10min收集菌体，菌体用 PBS洗两次，用血球计数器计数母
7
液菌体浓度，再用PBS稀释至1.0×10 CFU/mL 备用。将构建好的重组白僵菌pSilent‑
4
GNBP3，分别制成浓度为10 CFU/ml的孢子悬浮液。选取发育一致健康小菜蛾3龄第一天幼
4
虫。将制备好的孢子悬浮液 10 CFU/ml处理200头小菜蛾。采用体壁浸泡法，即将小菜蛾完
全浸泡在各自的孢子悬浮液中10s，用滤纸吸去多余液体后正常饲养24h后，将0.05％吐温
7
80 和白僵菌做相同处理。将虫体进一步饲喂有苏云金芽孢杆菌(1.0×10 CFU/ml) 和粘质
7
沙雷氏菌(1.0×10CFU/ml)的饲料。饲喂法：分别将细菌按照比例1：4 (mL：g)即4g饲料中
添加1mL菌液的方法饲养小菜蛾，每天添加新的拌有菌液的饲料。每隔12h记录一次，记录每
天小菜蛾的死亡数目和存活数目，一直记录到84h。对于对照组小菜蛾，0.05％吐温80和白
僵菌处理小菜蛾24h后，参考重组白僵菌的方法，用同样的配比饲料含苏云金芽孢杆菌(1.0
7 7
×10CFU/ml)和粘质沙雷氏菌(1.0×10CFU/ml)分别饲喂小菜蛾，统计小菜蛾苏云金芽孢
7 7
杆菌 (1.0×10CFU/ml)和粘质沙雷氏菌(1.0×10CFU/ml)下的小菜蛾的存活率，实验独立
重复三次，进行生物学统计。

[0125] 二、实验结果

[0126] 1、不同浓度重组白僵菌处理小菜蛾的生物测定

[0127] 将制备好的孢子悬浮液104CFU/ml、105CFU/ml、106CFU/ml、107CFU/ml 分别处理100头小菜蛾，统计7天小菜蛾的死亡数目，进行生物学统计，结果如图10所示。由图10可知
四个浓度处理小菜蛾下，重组白僵菌都能显著降低小菜蛾的存活率，其中重组白僵菌
7 4
10CFU/ml处理小菜蛾后，死亡率最高，时间最短。重组白僵菌菌株浓度为10 孢子/ml的孢子
5
悬浮液处理存活率为0的时间第7 天，重组白僵菌菌株浓度为10 孢子/ml的孢子悬浮液处
6
理后存活率为0的时间是第6天，重组白僵菌菌株浓度为10孢子/ml的孢子悬浮液处理后存
7
活率为0 的时间是第5天；重组白僵菌菌株浓度为10 孢子/ml的孢子悬浮液处理存活率为0
4 5 6 7
的时间第4天，而原始白僵菌浓度10 、10 、10 、10 孢子/ml的孢子处理小菜蛾在第7天的存
活率分别为58.33％、48.7％、41.18％、30.17％，要使小菜蛾在第5天存活率为0，未原始白
9
僵菌孢子悬浮液的浓度需达到10 孢子/ml。以上结果表明，重组菌株GNBP3与原始白僵菌相
比较，重组白僵菌菌株GNBP3对小菜蛾的存活率影响更大，可以显著缩短小菜蛾的死亡时
间。

[0128] 2、重组白僵菌对于其他微生物的增效作用

[0129] 将重组白僵菌pSilent‑GNBP3和原始白僵菌制备成孢子悬浮液104CFU/ml，分别处理200头3龄幼虫第一天小菜蛾。同时还选取健康的3龄幼虫第一天小菜蛾200头，用0.05％
吐温80处理，24h后，统计死亡数目和存活数目。重新从这个三个处理中挑出来100头小菜
蛾，用带菌饲料饲喂小菜蛾，每隔12h，直至84 h，记录小菜蛾的存活数目和死亡数目。统计
84h小菜蛾的累计死亡数目，进行生物学统计，结果如图11所示。由图11可知，重组白僵菌
pSilent‑GNBP3可以显著提高两种微生物的杀虫效果，且重组白僵菌pSilent‑GNBP3对于苏
云金芽孢杆菌Bt的增效效果比对粘质沙雷氏菌Sm的增效作用更好。在重组白僵菌 
4
pSilent‑GNBP3孢子悬浮液10CFU/ml处理小菜蛾时，小菜蛾处理存活率为0的时间第7天。
4
当重组白僵菌pSilent‑GNBP3孢子悬浮液10CFU/ml和Bt处理小菜蛾时，小菜蛾处理存活率
7
为0的时间第4天，与重组白僵菌菌株浓度为10 孢子/ml的孢子悬浮液处理存活率为0的时
间第4天一致。此时，单独Bt处理的小菜蛾存活率还有30％，说明重组白僵菌pSilent‑GNBP3
孢子悬浮液和Bt处结合，可以大大提高杀虫效果，起到一个很好的增效作用。将当重组白僵
4
菌pSilent‑GNBP3孢子悬浮液10CFU/ml和粘质沙雷氏菌Sm共同处理小菜蛾时，小菜蛾处理
6
存活率为0的时间第4.5天，与重组白僵菌菌株浓度为10 孢子/ml 的孢子悬浮液处理存活
率为0的时间第5天相比，杀虫时间缩短了半天的时间。说明当重组白僵菌pSilent‑GNBP3孢
子悬浮液和粘质沙雷氏菌Sm结合也大大提高了杀虫效果，是一个很好的增效剂。因此重组
白僵菌不仅单独可以提高杀虫效果，可以作为增效剂来提高微生物杀虫剂，扩大了杀虫范
围，对环境友好。