一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用

摘要

一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用，属于卵母细胞体外成熟培养技术领域。为了解决目前猪卵母细胞体外成熟率和发育率低的问题，本发明提供了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用。本发明所述的培养液由基础培养液TCM‑199，青霉素，链霉素，NaHCO3，4‑羟乙基哌嗪乙磺酸，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，猪卵泡液，孕马血清促性腺激素，人绒毛膜促性腺激素和单宁酸组成。本发明所述的培养液，可以提高卵母细胞体外成熟质量、卵丘细胞扩散指数、孤雌胚胎囊胚率和囊胚总细胞数、体外受精胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数。

权利要求

1.一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述猪卵母细胞体外成熟培养液含有单宁酸；所述培养液由基础培养液TCM-199，质量浓度为0.066g/L的青霉素，质量浓度为

0.08g/L的链霉素，浓度为2mmol/L的NaHCO3，浓度为9.5mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸Hepes，质量浓度为3.5g/L的聚乙烯醇，浓度为0.9mmol/L的丙酮酸钠，质量浓度为8ng/mL的胰岛素，浓度为0.7mmol/L的半胱氨酸，质量浓度为12ng/mL的表皮生长因子，体积浓度为

75mL/L的猪卵泡液，浓度为8IU/mL的孕马血清促性腺激素PMSG，浓度为12IU/mL的人绒毛膜促性腺激素hCG和浓度为50μg/mL的单宁酸组成。

2.如权利要求1所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)猪卵泡液的获取：从猪卵巢的卵泡中抽出液体，对所述液体进行离心，保留上清液，对上清液进行过滤除杂，获得猪卵泡液；

(2)将TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，PMSG，hCG，单宁酸和步骤(1)所获得的猪卵泡液混合，获得培养液粗液；

(3)对步骤(2)所获得的培养液粗液过滤除菌，获得所述的猪卵母细胞体外成熟培养液。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的猪卵巢温度是28-35℃。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的离心是4-6℃条件下，

12000-14000r/min，离心30-60min。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的过滤除杂是用0.45μm的滤器进行过滤。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的过滤除菌是用0.22μm的滤器进行过滤。

7.权利要求1所述的猪卵母细胞体外成熟培养液在体外培养猪卵母细胞上的应用。

说明书

一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于卵母细胞体外成熟培养技术领域。具体涉及一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 现代生物学和生物医学研究表明猪的生物学特性和遗传特性与人类具有相当高的同源性，被认为是人体异种器官来源的首选动物，因此猪在生物医学研究中是重要的模式动物。体外培养技术和当今飞速发展的基因编辑技术的有效结合，不仅促进了胚胎工程的发展及应用，而且带动了医学领域的发展。卵母细胞体外成熟(IVM)是胚胎体外生产(IVP)的重要一环，如今对猪卵母细胞体外成熟培养(IVM)的标准也在不断的提升。尽管现在猪的卵母细胞IVM体系得到了很大的改善，但是猪卵母细胞体外成熟率仍然低于体内。

[0003] 随着动物胚胎工程的发展，科研和生产方面对于卵母细胞的需求越来越大。传统的超数排卵获得成熟的卵母细胞已远远满足不了当前对卵母细胞的需求，哺乳动物卵母体外成熟一直是研究卵母细胞体外培养、体外受精和胚胎发育等关键步骤，也一直是研究热点和难点。与卵母细胞体内成熟相比，卵母细胞体外成熟存在细胞核和细胞质成熟不协调、不同步问题，这直接导致卵子发育潜力受阻，表现为体外受精胚胎发育率低和胚胎质量差等，表明卵母细胞体外成熟培养系统与受精率和囊胚发育率有较强的相关性。所以深入探索卵母细胞的成熟规律，改善卵母细胞体外成熟的培养环境，建立一种完善的卵母细胞体外成熟体系，是当前胚胎工程研究的重要内容之一。

发明内容

[0004] 为了解决目前猪卵母细胞体外成熟率和发育率低的问题，本发明提供了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用。本发明所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，含有单宁酸。

[0005] 优选的，所述卵母细胞体外成熟培养液，由基础培养液TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，4-羟乙基哌嗪乙磺酸Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，猪卵泡液，孕马血清促性腺激素PMSG，人绒毛膜促性腺激素hCG和单宁酸组成。

[0006] 优选的，所述卵母细胞体外成熟培养液，以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.048-0.066g/L，链霉素的质量浓度为0.08-0.12g/L，NaHCO3的浓度为1.95-2mmol/L，Hepes的浓度为9.5-10mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为2.5-3.5g/L，丙酮酸钠的浓度为0.9-0.95mmol/L，胰岛素的质量浓度为8-12ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.5-0.7mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为8-12ng/mL，猪卵泡液体积浓度为75-125mL/L，PMSG的浓度为8-12IU/mL，hCG的浓度为8-12IU/mL，单宁酸的浓度为1-50μg/mL。

[0007] 优选的，所述卵母细胞体外成熟培养液，以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.06g/L，链霉素的质量浓度为0.1g/L，NaHCO3的浓度为1.99mmol/L，Hepes的浓度为9.8mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为3g/L，丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L，胰岛素的质量浓度为10ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.6mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为10ng/mL，猪卵泡液体积浓度为100mL/L，PMSG的浓度为10IU/mL，hCG的浓度为10IU/mL，单宁酸的浓度为10μg/mL。

[0008] 本发明还提供了所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，具体步骤如下：

[0009] (1)猪卵泡液的获取：从猪卵巢的卵泡中抽出液体，对所述液体进行离心，保留上清液，对上清液进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；

[0010] (2)将TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，PMSG，hCG，单宁酸和步骤(1)所获得的猪卵泡液混合，获得培养液粗液。

[0011] (3)对步骤(2)所获得的培养液粗液过滤除菌，获得所述的猪卵母细胞体外成熟培养液。

[0012] 优选的，步骤(1)所述的猪卵巢温度是28-35℃。

[0013] 优选的，步骤(1)所述的离心是4-6℃条件下，12000-14000r/min，离心30-60min。

[0014] 优选的，步骤(1)所述的过滤除杂是用0.45μm的滤器进行过滤。

[0015] 优选的，步骤(3)所述的过滤除菌是用0.22μm的滤器进行过滤。

[0016] 本发明还提供了所述的猪卵母细胞体外成熟培养液在体外培养猪卵母细胞上的应用。

[0017] 有益效果

[0018] 本发明所述的含有单宁酸的卵母细胞体外成熟培养液，可以提高卵母细胞体外成熟质量；提高卵丘细胞扩散指数；提高孤雌胚胎囊胚率、囊胚总细胞数；提高体外受精胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数。

具体实施方式

[0019] 本发明所有实验试剂均购置于Sigma(美国)公司，特殊说明的除外：TCM-199(Invitrogen)，100X ITS-A(Invitrogen)，青霉素(Invitrogen)，链霉素(Invitrogen)，单宁酸(APExBIO)，PZM-5(Funakoshi Corporation)，H2DCFDA(Invitrogen)，CellTrackerBlue CMF2HC(Invitrogen)。

[0020] 本发明所述的卵母细胞体外成熟培养液，由基础培养液TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，猪卵泡液，孕马血清促性腺激素(PMSG)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)和单宁酸组成。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

[0021] 实施例1.卵母细胞体外成熟培养液。

[0022] 本实施例所述的卵母细胞体外成熟培养液具体成分如下：

[0023] 以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.048g/L，链霉素的质量浓度为0.12g/L，NaHCO3的浓度为1.95mmol/L，Hepes的浓度为10mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为2.5g/L，丙酮酸钠的浓度为0.95mmol/L，胰岛素的质量浓度为12ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.5mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为8ng/mL，猪卵泡液体积浓度为125mL/L，PMSG的浓度为12IU/mL，hCG的浓度为8IU/mL，单宁酸的浓度为1μg/mL。

[0024] 本实施例所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，具体步骤如下：

[0025] (1)猪卵泡液的获取：从30℃猪卵巢的卵泡中抽出液体，对所述液体进行4℃条件下，12000r/min，离心40min，保留上清液，对上清液用0.45μm的滤器进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；

[0026] (2)将TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，PMSG，hCG，单宁酸和步骤(1)所获得的猪卵泡液混合，获得培养液粗液。

[0027] (3)对步骤(2)所获得的培养液粗液用0.22μm的滤器进行过滤除菌，获得所述的猪卵母细胞体外成熟培养液。

[0028] 实施例2.卵母细胞体外成熟培养液。

[0029] 本实施例所述的卵母细胞体外成熟培养液具体成分如下：

[0030] 以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.06g/L，链霉素的质量浓度为0.1g/L，NaHCO3的浓度为1.99mmol/L，Hepes的浓度为9.8mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为3g/L，丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L，胰岛素的质量浓度为10ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.6mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为10ng/mL，猪卵泡液体积浓度为100mL/L，PMSG的浓度为10IU/mL，hCG的浓度为10IU/mL，单宁酸的浓度为10μg/mL。

[0031] 本实施例所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，具体步骤如下：

[0032] (1)猪卵泡液的获取：从28℃猪卵巢的卵泡中抽出液体，对所述液体进行5℃条件下，13000r/min，离心30min，保留上清液，对上清液用0.45μm的滤器进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；

[0033] (2)将TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，PMSG，hCG，单宁酸和步骤(1)所获得的猪卵泡液混合，获得培养液粗液。

[0034] (3)对步骤(2)所获得的培养液粗液用0.22μm的滤器进行过滤除菌，获得所述的猪卵母细胞体外成熟培养液。

[0035] 实施例3.卵母细胞体外成熟培养液。

[0036] 本实施例所述的卵母细胞体外成熟培养液具体成分如下：

[0037] 以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.066g/L，链霉素的质量浓度为0.08g/L，NaHCO3的浓度为2mmol/L，Hepes的浓度为9.5mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为3.5g/L，丙酮酸钠的浓度为0.9mmol/L，胰岛素的质量浓度为8ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.7mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为12ng/mL，猪卵泡液体积浓度为75mL/L，PMSG的浓度为8IU/mL，hCG的浓度为12IU/mL，单宁酸的浓度为50μg/mL。

[0038] 本实施例所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，具体步骤如下：

[0039] (1)猪卵泡液的获取：从35℃猪卵巢的卵泡中抽出液体，对所述液体进行6℃条件下，14000r/min，离心60min，保留上清液，对上清液用0.45μm的滤器进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；

[0040] (2)将TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，PMSG，hCG，单宁酸和步骤(1)所获得的猪卵泡液混合，获得培养液粗液。

[0041] (3)对步骤(2)所获得的培养液粗液用0.22μm的滤器进行过滤除菌，获得所述的猪卵母细胞体外成熟培养液。

[0042] 对比例.未添加单宁酸的卵母细胞体外成熟培养液。

[0043] 本实施例所述的卵母细胞体外成熟培养液具体成分如下：

[0044] 以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.06g/L，链霉素的质量浓度为0.1g/L，，NaHCO3的浓度为1.99mmol/L，Hepes的浓度为9.8mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为3g/L，丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L，胰岛素的质量浓度为10ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.6mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为10ng/mL，猪卵泡液体积浓度为100mL/L，PMSG的浓度为10IU/mL，hCG的浓度为10IU/mL。

[0045] 对比例所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的制备方法重复实施例1，不同之处在于步骤(2)中未添加单宁酸。

[0046] 对实施例1-3，以及对比例所述的未添加单宁酸的卵母细胞体外成熟培养液培养猪卵母细胞的效果进行验证：

[0047] 1.猪卵母细胞收集与体外成熟

[0048] 从当地屠宰场获取猪卵巢，放于30℃生理盐水中运回实验室。用配有18G针头的注射器抽取直径为3-6mm卵泡中的卵丘卵母细胞复合体(COCs)。将COCs置于上述实施例1-3组以及对比例所述的卵母细胞体外成熟培养液中进行清洗，随后将COCs转移至实施例1-3组以及对比例所述的卵母细胞体外成熟培养液中分别培养，在38.5℃，5％CO2的培养箱中培养21小时，然后再将卵母细胞分别转移至实施例1-3组以及对比例中不添加PMSG和hCG的卵母细胞体外成熟培养液中继续培养21小时。

[0049] 所有组别卵母细胞培养42小时后，使用含0.1％透明质酸酶洗脱卵丘细胞，在显微镜下观察卵母细胞。从表1得知，经过42小时的IVM培养，实施例1-3组与对比例在卵母细胞成熟率方面，成熟效果类似。

[0050] 表1.实施例1-3组及对比例组培养液对猪卵母细胞体外成熟的影响

[0051]

[0052] 2.猪卵丘细胞扩散程度判定和分级

[0053] 卵母细胞体外培养结束后，对卵丘细胞的扩散情况进行评估：0级，卵丘细胞无任何扩散；1级，只有卵丘细胞最外层稍有扩散；2级，外层的卵丘细胞扩散；3级，除放射冠外，其余卵丘细胞均扩散；4级，包括放射冠在内的所有卵丘细胞均实现了最大程度的扩散。统计卵丘细胞扩散指数(Cumulus Expansion Index，CEI)，即计算各级卵丘细胞扩散的加权算术平均数，用于衡量卵丘细胞扩散的指标。

[0054] 从表2得知，实施例2-3组与对比例之间有显著性差异。

[0055] 实施例2与实施例3组卵丘细胞的扩散程度和扩散指数相较对比例更好，实施例1组卵丘细胞的扩散程度和扩散指数略差于实施例2组和3组，但优于对比例。

[0056] 表2.实施例1-3组及对比例组培养液对猪卵丘细胞扩散影响

[0057]

[0058] 3.孤雌激活

[0059] 将经透明质酸酶洗脱后的裸卵置于激活液(0.28mol/L甘露醇，0.1mmol/L CaCl2，0.1mmol/L MgSO4，0.5mmol/L Hepes)中，使用BTX ECM 2001激活，激活条件为1.5KV/cm的单极直流脉冲，60μs。激活后的卵母细胞放于PZM-5培养液中培养7天。

[0060] 由表3可知，各组在卵裂率和囊胚总细胞数上无显著性差异；在囊胚率上，实施例2-3组显著高于实施例1组和对比例组，实施例1组在囊胚率上还是要比对比例好。

[0061] 表3.实施例1-3组及对比例组培养液对猪孤雌胚胎体外发育的影响

[0062]

[0063] 4.体外受精(IVF)

[0064] 每组别选择15个MII期成熟卵母细胞，随机地放于mTris-buffered medium(mTBM)小滴中(40μL)，并覆盖提前预热的矿物油。从当地种猪场2h之内运到实验室的新鲜精液，用含1mL/L BSA的DPBS清洗两遍后，1000g离心2分钟，离心后得到的沉淀使用mTBM重悬。经过重悬后，将10μL精液重悬液加入到40μL的mTBM小滴中，使精卵比达到2000:1。在受精进行之前，要确保精子活力＞80％。将含有卵母细胞和精子的mTBM小滴在39℃，5％CO2的条件下培养20分钟。20分钟培养后，轻轻地吹打掉卵母细胞透明带上未附着紧密的精子。卵母细胞使用mTBM清洗后放入不含精子的mTBM中，在39℃，5％CO2的条件下培养5-6小时。经培养后，使用PZM-5培养液清洗配子，随后放入500μL的四孔板(50个配子/孔)中，在39℃，5％CO2，90％N2的条件下继续培养168小时。

[0065] 由表4可知，在囊胚率上，实施例2组显著高于实施例1组、实施例3组和对比例组，实施例1组与实施例3组和对比例之间无显著差异。

[0066] 表4.实施例1-3组和对比例组培养液对猪体外受精胚胎发育的影响

[0067]

[0068] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。