基于基因组编辑和DNA条形码的种类特异杀虫剂转让专利
申请号 : CN201911050838.0
文献号 : CN110760514B
文献日 : 2021-06-01
发明人 : 张子平 , 王艺磊 , 潘银来 , 孙玉龙
申请人 : 福建农林大学 , 集美大学
摘要 :
本发明公开一种基于基因组编辑的种类特异杀虫剂，通常用化学合成药物来防治寄生虫的感染。但化学合成药物特异性较差，副作用大且有药物残留的问题。寄生虫疫苗常因寄生虫表面抗原的突变而失效。我们根据基因编辑技术的原理设计并鉴别出2个可特异性地作用于刺激隐核虫DNA条形码序列和5.8S核糖体RNA基因的sgRNA，并经直接浸泡试验证实其可特异性地切割刺激隐核虫DNA条形码序列，杀死刺激隐核虫。这样一种基于基因组编辑和DNA条形码的种类特异杀虫剂，除可用于刺激隐核虫防治外，其原理应该也适用于其它寄生虫。
权利要求 :
1.一种基于基因组编辑和DNA条形码的种类特异杀虫剂，其特征在于，利用特异性作用于刺激隐核虫DNA条形码序列的sgRNA，通过直接浸泡法，特异性地切割刺激隐核虫DNA条形码序列，杀死刺激隐核虫。
2.根据权利要求1所述一种基于基因组编辑和DNA条形码的种类特异杀虫剂，其特征在于，所述sgRNA包括两条，
（1）刺激隐核虫的ITS‑2的sgRNA序列：atataatcatgccaacatagtgg；
（2）刺激隐核虫的5.8S核糖体RNA基因的sgRNA序列：attttcaacggtggatatcttgg。
3.根据权利要求1所述一种基于基因组编辑和DNA条形码的种类特异杀虫剂，其特征在于，具体操作方法为：
（1）以pUC57‑T7‑gRNA质粒为模板，设计含有靶点的引物，扩增出具靶点的sgRNA的DNA模板，以此为模板在体外进行转录，将转录产物与Cas9蛋白进行37℃温浴，使其形成REGN复合物，然后作用于DNA条形码的PCR产物，检测靶点的活性；
（2）将转录产物与Cas9mRNA混合，加入到孵化刺激隐核虫的海水中，进行体外浸泡4h。
说明书 :
基于基因组编辑和DNA条形码的种类特异杀虫剂
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于基因组编辑和寄生虫DNA条形码序列的种类特异杀虫剂。
背景技术
[0002] 寄生虫引起的病害广泛地存在于地球上有生命的动植物生存之处。几乎所有地区人类的健康都在受到某些寄生虫种类不同程度的威胁而经济动植物的生产也都因为各种
不同寄生虫病害的影响引致减产。如何有效地防治寄生虫是人类面临的一项重要课题。例
如，刺激隐核虫病是海水网箱养鱼的头号大敌，严重制约海水养殖业的可持续发展。目前对
刺激隐核虫的防治措施主要采用物理学方法和化学方法。物理学方法主要包括淡水浸泡、
温度控制、干燥、轮换养殖、长时间沉淀或使用紫外线和臭氧处理养殖水体等。化学法主要
使用福尔马林、亚甲基兰、高锰酸钾、次氯酸钠、磺胺咪哇、硫酸铜、青霉素、中草药等单独或
联合治疗刺激隐核虫病。这些方法可在一定程度上减缓刺激隐核虫发病的进程，起到一定
的防治作用。但是这些方法在实际生产中都存在缺陷，如不适合大水体、效果不确定等，尤
其是化学药物特异性较差，副作用大且对鱼类的毒性、对环境的污染以及药物残留所引起
的人类健康问题等。且寄生虫疫苗常因寄生虫表面抗原的突变而失效。
不同寄生虫病害的影响引致减产。如何有效地防治寄生虫是人类面临的一项重要课题。例
如，刺激隐核虫病是海水网箱养鱼的头号大敌，严重制约海水养殖业的可持续发展。目前对
刺激隐核虫的防治措施主要采用物理学方法和化学方法。物理学方法主要包括淡水浸泡、
温度控制、干燥、轮换养殖、长时间沉淀或使用紫外线和臭氧处理养殖水体等。化学法主要
使用福尔马林、亚甲基兰、高锰酸钾、次氯酸钠、磺胺咪哇、硫酸铜、青霉素、中草药等单独或
联合治疗刺激隐核虫病。这些方法可在一定程度上减缓刺激隐核虫发病的进程，起到一定
的防治作用。但是这些方法在实际生产中都存在缺陷，如不适合大水体、效果不确定等，尤
其是化学药物特异性较差，副作用大且对鱼类的毒性、对环境的污染以及药物残留所引起
的人类健康问题等。且寄生虫疫苗常因寄生虫表面抗原的突变而失效。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供可特异性地作用于刺激隐核虫DNA条形码序列的sgRNA，通过直接浸泡可特异性地切割刺激隐核虫DNA条形码序列，杀死刺激隐核虫。这样一种基于基
因组编辑和DNA条形码的种类特异杀虫剂，除可用于刺激隐核虫防治外，其原理应该也适用
于其它寄生虫。
因组编辑和DNA条形码的种类特异杀虫剂，除可用于刺激隐核虫防治外，其原理应该也适用
于其它寄生虫。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] 根据刺激隐核虫的DNA条形码序列筛选合适的靶点, 然后以pUC57‑T7‑gRNA质粒为模板,设计含有靶点的引物,扩增出具靶点sgRNA。与case 9 mRNA混合即构成基于基因组
编辑的种类特异杀虫剂。
编辑的种类特异杀虫剂。
[0006] 我们设计筛选的有效sgRNA的序列为：
[0007] （1）刺激隐核虫的ITS‑2：atataatcatgccaacatagtgg；
[0008] （2）刺激隐核虫的5.8S核糖体RNA基因：attttcaacggtggatatcttgg。
[0009] 所述的具体操作步骤为：
[0010] 1.以pUC57‑T7‑gRNA质粒为模板,设计含有靶点的引物,扩增出具靶点的sgRNA的DNA模板，以此为模板在体外进行转录。将转录产物与Cas9蛋白进行37℃温浴，使其形成
REGN复合物，然后作用于DNA条形码的PCR产物，检测靶点的活性。
REGN复合物，然后作用于DNA条形码的PCR产物，检测靶点的活性。
[0011] 2. 将合成的sgRNA和case9 RNA混合，加入到孵化刺激隐核虫的海水中，进行体外浸泡4h，发现能显著降低幼虫的存活率。
[0012] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0013] 我们根据基因编辑技术的原理设计并鉴别出2个可特异性地作用于刺激隐核虫DNA条形码序列的sgRNA，可特异性地切割刺激隐核虫DNA条形码序列，杀死刺激隐核虫。具
有种属的特异性。
有种属的特异性。
附图说明
[0014] 图1为几个sgRNA作用于靶标的活性测定图；
[0015] 图2为几个sgRNA和case9 RNA 杀灭幼虫的效率比较；
[0016] 图3为pUC57‑T7‑gRNA质粒图谱。
具体实施方式
[0017] 实施例1：刺激隐核虫DNA条形码sgRNA靶点的设计
[0018] 以pUC57‑T7‑gRNA质粒为模板（图3）,其中gRNA固定序列为（gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc，见附图3）。设计含有
靶点的引物（引物见表1）,扩增出具靶点的sgRNA的DNA模板，具体实验步骤如下，反应体系：
模板pUC57‑T7‑gRNA 1μl，正向引物和反向引物各2μl，Mix预混液25μl，ddH2O 20μl；PCR反
应条件具体见表2；然后以PCR扩增出来的片段为模板在体外进行转录，反应体系：10X RNA
polymerase buffer 2μl，T7RNA聚合酶2μl，rNTP 2μl，RNA inhibitor 1μl，DNA模板
1000ng，无酶水加至总量20μl，37℃反应2.5h，反应结束后加入1μl Dnase Ⅰ并于37℃温浴
15min，然后加入50ul无水乙醇和2ul pH5.3的3 mol/L醋酸钠，‑80℃冷冻过夜，过夜结束后
4℃ 12000g离心30min去掉上清，然后加入预冷的70%乙醇溶解沉淀再次4℃ 12000g离心
15min去掉上清，室温干燥5min后加入1ul的RNA inhibitor和适量的无酶水。将转录产物与
Cas9蛋白在37℃条件下进行温浴，使其形成REGN复合物。然后作用于DNA条形码的PCR产物，
检测靶点的活性。将转录产物与Cas9mRNA加入到孵化刺激隐核虫的海水中，进行体外浸泡
4h，统计幼虫的成活率。靶点活性检测的结果（图1），DNA条形码的两个序列只有靶点A具有
活性，处于5.8S核糖体RNA基因的7个靶点序列只有靶点E具有活性。因此选用这两个靶点
sgRNA进行体外浸泡刺激隐核虫，并统计幼虫的成活率（图2），发现能够显著性的降低幼虫
的成活率。
靶点的引物（引物见表1）,扩增出具靶点的sgRNA的DNA模板，具体实验步骤如下，反应体系：
模板pUC57‑T7‑gRNA 1μl，正向引物和反向引物各2μl，Mix预混液25μl，ddH2O 20μl；PCR反
应条件具体见表2；然后以PCR扩增出来的片段为模板在体外进行转录，反应体系：10X RNA
polymerase buffer 2μl，T7RNA聚合酶2μl，rNTP 2μl，RNA inhibitor 1μl，DNA模板
1000ng，无酶水加至总量20μl，37℃反应2.5h，反应结束后加入1μl Dnase Ⅰ并于37℃温浴
15min，然后加入50ul无水乙醇和2ul pH5.3的3 mol/L醋酸钠，‑80℃冷冻过夜，过夜结束后
4℃ 12000g离心30min去掉上清，然后加入预冷的70%乙醇溶解沉淀再次4℃ 12000g离心
15min去掉上清，室温干燥5min后加入1ul的RNA inhibitor和适量的无酶水。将转录产物与
Cas9蛋白在37℃条件下进行温浴，使其形成REGN复合物。然后作用于DNA条形码的PCR产物，
检测靶点的活性。将转录产物与Cas9mRNA加入到孵化刺激隐核虫的海水中，进行体外浸泡
4h，统计幼虫的成活率。靶点活性检测的结果（图1），DNA条形码的两个序列只有靶点A具有
活性，处于5.8S核糖体RNA基因的7个靶点序列只有靶点E具有活性。因此选用这两个靶点
sgRNA进行体外浸泡刺激隐核虫，并统计幼虫的成活率（图2），发现能够显著性的降低幼虫
的成活率。
[0019] 表1. 合成含有靶点的sgRNA的DNA模板所需的引物，加粗的序列为特异性靶点。
[0020]
[0021] 表2. PCR反应的具体条件，反应进行34个循环
[0022]
[0023] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。