一种长筒石蒜LlDFRa基因及其表达的蛋白和应用

摘要

本发明公开了一种长筒石蒜LlDFRa基因及其表达的蛋白和应用，属于植物分子生物学领域，LlDFRa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。LlDFRa基因是花青素合成下游途径中重要的调控基因，在石蒜盛花期参与花青素合成，而在石蒜蕾期表达弱，能使其遗传转化的烟草花色加深，由粉红转至浅红，是一种可以改变花色的DFR基因。将LlDFRa基因应用于转基因植物，可改良植物的花色从而提高其观赏性，具有实际应用价值。

权利要求

1.一种长筒石蒜LlDFRa基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述长筒石蒜LlDFRa基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的长筒石蒜LlDFRa基因的载体。

4.根据权利要求3所述的长筒石蒜LlDFRa基因的载体，其特征在于：所述长筒石蒜LlDFRa基因的载体为pEASY-Blunt-LlDFRa、pCAMBIA1300-LlDFRa或pCAMBIA1304-LlDFRa。

5.权利要求1所述的长筒石蒜LlDFRa基因，或权利要求2所述的长筒石蒜LlDFRa基因的表达蛋白，或权利要求3或4中任一所述的长筒石蒜LlDFRa基因的载体在改良植物花色中的应用，所述的植物为本氏烟草。

6.一种利用长筒石蒜LlDFRa基因得到改变花色的植物新品种方法，其特征在于，所述的植物为本氏烟草，包括以下步骤：

1）构建权利要求3或4中所述长筒石蒜LlDFRa基因的载体；

2）将所构建的长筒石蒜LlDFRa基因的载体转化到植物或植物细胞中；

3）培育筛选得到改变花色的植物新品种。

说明书

一种长筒石蒜LlDFRa基因及其表达的蛋白和应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种长筒石蒜LlDFRa基因及其表达的蛋白和应用。

背景技术

[0002] 长筒石蒜(Lycoris longituba)属石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris)，为我国特有种，主产于江苏安徽两地，其种内花色变异极为丰富，有粉色、黄色、橙色、紫红色、红蓝色以及罕见的翠绿色等，而且花型变异也很大，有的还可散发出幽香，具有很大的研究价值和应用潜力。二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成下游途径中重要的调控基因，它催化二氢黄酮醇分别生成无色天竺葵素、无色飞燕草素和无色矢车菊素，是花色素从无色走向有色的一个重要节点，作为类黄酮代谢途径下游的关键酶对于植物最终花色呈现起着至关重要的作用，即在花色形成过程中，呈现不同颜色的花色素的积累主要是依赖于DFR基因的活性，失去DFR活性的突变体产生象牙色或者白色。基于DFR功能鉴定的基础之上，利用转基因技术在许多植物花色修饰的研究中取得了显著成果。DFR基因在植物中的功能和表达调控模式是多变的，而目前在单子叶植物中有关该基因的表达调控机理解析较少，研究长筒石蒜的DFR基因在花色调节中的功能，可以为利用基因工程改良植物的观赏性状提供有用的分子工具。

发明内容

[0003] 针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于石蒜的DFR基因LlDFRa，可用于改良花色从而改良植物观赏性状。本发明所要解决的另一技术问题在于提供该LlDFRa基因的应用方法，可用于改良植物的花色从而提高其观赏性。

[0004] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

[0005] 一种长筒石蒜LlDFRa基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0006] 所述长筒石蒜LlDFRa基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0007] 含有权利要求1所述的长筒石蒜LlDFRa基因的载体。

[0008] 优选地，所述长筒石蒜LlDFRa基因的载体为pEASY-Blunt-LlDFRa、pCAMBIA1300-LlDFRa或pCAMBIA1304-LlDFRa。

[0009] 所述的长筒石蒜LlDFRa基因，或所述的长筒石蒜LlDFRa基因的表达蛋白，或所述的长筒石蒜LlDFRa基因的载体在改良植物花色中的应用。

[0010] 一种利用长筒石蒜LlDFRa基因得到改变花色的植物新品种方法，包括以下步骤：

[0011] 1)构建权利要求3或4中所述长筒石蒜LlDFRa基因的载体；

[0012] 2)将所构建的长筒石蒜LlDFRa基因的载体转化到植物或植物细胞中；

[0013] 3)培育筛选得到改变花色的植物新品种。

[0014] 有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：本发明提供的一种长筒石蒜L1DFRa基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过克隆和荧光定量确定该基因表达模式是在石蒜盛花期参与花青素合成，而在石蒜蕾期表达弱；通过亚细胞定位和转基因鉴定该基因功能，发现其表达蛋白为结构蛋白，能使其遗传转化的烟草的花色加深，由粉红转至浅红，表明LlDFRa是一种可以改变花色的DFR基因。作为花青素合成过程中重要调控基因DFR家族成员的L1DFRa基因，可以用于基因工程改良植物花色，从而改良植物的观赏性状，具有实际应用价值。

附图说明

[0015] 图1为粉色长筒石蒜不同发育时期花瓣图；S1：初蕾期；S2中蕾期；S3：盛花期；

[0016] 图2为粉色长筒石蒜不同发育时期LlDFRa表达分析结果图；S1：初蕾期；S2中蕾期；S3：盛花期；

[0017] 图3为LlDFRa在烟草叶片中的亚细胞定位情况图；35s：：GFP：携带空载体pCAMBlAl300的农杆菌GV3101注射烟草下表皮细胞的表达情况图；35s：：GFP-LlDFRa：携带质粒pCAMBIA1300-LlDFRa的农杆菌GV3101注射烟草下表皮细胞的表达情况图；

[0018] 图4为转基因株系与野生型烟草表型比较图；A：野生型B：转基因植株；

[0019] 图5为转基因株系L9和L32花青素含量图；

[0020] 图6为转基因株系L9和L32的LlDFRa表达的荧光定量分析结果图。

具体实施方式

[0021] 下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

[0022] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0023] 本申请所用材料采自南京林业大学园林植物学科石蒜种质资源库，于2016年8月，选择长筒石蒜粉色系3个发育时期(S1初蕾期、S2中蕾期、S3盛花期)花朵的花瓣(图1)，装入灭菌的离心管中，并立即放入液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱内保存。

[0024] 实施例1：LlDFRa基因的克隆及表达分析

[0025] (1)克隆LlDFRa基因

[0026] 本实施例采用TIANGEN植物RNA提取试剂盒(DP432)提取植物总RNA。采用TaKaRa PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒将所提取到的RNA反转录成cDNA，最后得到的cDNA加水稀释10倍后于-20℃冰箱保存。

[0027] 根据前期课题组已获得的长筒石蒜花瓣转录组数据库，筛选得到1个DFR蛋白同源性较高的Unigene片段，并通过NCBI数据库比对，初步确定这些筛选获得的基因全长完整性良好。并使用Primer  Premier  5 .0软件设计1对特异性引物(F：5 ′-AGAGAGAGAGACAGAGAGAGAGATGAA-3′；R：5′-ACCACCTCCACAATGGCACT-3′)对其编码区序列进行克隆。

[0028] 以lst Strand cDNA为模板，使用全式金公司的EasyPfu Mix高保真酶进行PCR扩增反应，反应体系为50μL：1μL 1st Strand cDNA，2μL ORF Forward Primer(10mM)，2μL ORF Reverse Primer(10mM)，25μL 2×EasyPfu PCR SuperMix，20μL ddH2O。反应条件：94℃预变性10min；94℃变性20s，不同温度退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min，16℃终止反应。得到的产物用于琼脂糖电泳检测后切胶回收与预期大小一致的电泳条带，连接pEASY-Blunt载体并转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，挑取3个阳性克隆送至北京金斯瑞生物技术有限公司测序。测得LlDFRa基因序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

[0029] 目的片段回收与纯化：PCR扩增完成之后，加入10μL 5×Loading Buffer，并将其全部点入胶孔中；采用1.5％的琼脂糖胶，160V，200mA，电泳35min之后取出；用凝胶成像仪拍照，再将凝胶取出在紫外灯下切下目的片段；进行胶回收，具体步骤如下：

[0030] 1)将目的条带小心切下放入无菌离心管(1.5μL)中，并称重(称量之前除去离心管自身重量)。

[0031] 2)向离心管中加入3倍体积的GSB(Gel Solubilization Buffer)(将胶块重量换算成体积，粗算100mg≈100μL)，55℃水浴10min使胶块完全融化，每隔2-3min颠倒摇匀；

[0032] 3)待胶块完全融化后，向溶液中加入1倍体积的异丙醇混匀，并将其全部加入到离心柱中，静置1min，10000rpm离心1min，弃流出液；

[0033] 4)加入650μL WB(Wash Buffer)，10000rpm离心1min，弃流出液；

[0034] 5)重复上一步骤；

[0035] 6)10000rpm离心2min，去除残留的WB，将离心柱置于一个新的无菌的1.5μL离心管中，开盖室温静置3min；

[0036] 7)在离心柱中央悬空滴入40μL的ddH2O，室温静置2min，10000rpm离心1min；将洗脱的ddH2O再次悬空滴入离心柱中，室温静置2min，10000rpm离心1min；弃离心柱，将得到的DNA溶液于-20℃冰箱中保存备用。

[0037] (2)荧光实时定量PCR分析LlDFRa基因表达模式

[0038] 根据LlDFRa的cDNA全长序列在非保守区设计荧光定量引物如下：

[0039] F：5′-ATCACTGCTAAAGACCACCAAGG-3′；

[0040] R：5′-TGATAGCACATAAACCCATCCACT-3′。

[0041] 以粉色长筒石蒜花瓣3个发育阶段的cDNA为模板，选取长筒石蒜eIF基因作为内参基因。根据 Premix Ex TaqTM说明书，将不同组分按反应体系比列配制。反应体系为总体积约为10μL，包括：0.4μL正反向引物、5μL SYBR、1μL cDNA、0.2μL校正液、3μL超纯水。扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环。每个样品设3个生物学重复和三次技术重复。确保实验数据可靠之后使用2-ΔΔCT法计算目的基因的表达差异，所得数据使用SPSS 20.0软件进行显著性分析。

[0042] 结果如图2所示，LlDFRa基因在粉花长筒石蒜花瓣3个不同发育时期中表达模式呈上调趋势，其表达量随着花的开放逐渐增加，至盛花期达到较高水平，可以推测，LlDFRa基因在盛花期参与花青素合成，而在石蒜蕾期表达弱。

[0043] 实施例2：LlDFRa的载体构建及功能验证

[0044] I、LlDFRa基因表达亚细胞定位观察

[0045] (1)目的片段克隆回收及测序

[0046] 将LlDFRa基因完整ORF在BioXM软件中进行酶切位点分析，最终选取可使用的限制性内切酶Kpn I和Sma I。设计含有酶切位点的引物如下：

[0047] F：5′-AAGCTTCTGCAGGGGCCCGGGATGGAGGAGGAGGAGGAGGAT-3′；

[0048] R：5′-GCCCTTGCTCACCATGGTACCCGAGGCATGATTAATAAAACCAAT-3′。

[0049] 以测序正确的pEASY-Blunt-LlDFRa质粒为模板，使用PrimerStar Max(TaKaRa)高保真酶进行PCR扩增，反应体系为50μL：1μL 1st Strand cDNA，2μL ORF Forward Primer(10mM)，2μL ORF Reverse Primer(10mM)，25μL 2×PrimerStar Max(Takara)，20μL ddH2O。反应条件：98℃预变性1min；98℃变性10s，退火5s，72℃延伸15s，35个循环；72℃总延伸1min，4℃终止反应，之后以第一轮产物为模板，按照以上反应体系和程序进行第二轮PCR富集目的片段，后得到的产物用于用的琼脂糖电泳、并将目的片段回收、克隆测序。

[0050] (2)pCAMBIA1300质粒的提取

[0051] 使用天根质粒小提中量试剂盒完成质粒的提取：

[0052] 1)取课题组于-80℃冰箱所保存的pCAMBIA1300质粒菌液冰上融化，吸取100μL加入20mL新鲜LB培养基中(含kan)，37℃，200rpm摇菌12-14h；

[0053] 2)取5-10微升摇好的菌液分次加入2mL离心管中，12000rpm离心1min，弃上清；

[0054] 3)向吸附柱CP4中加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉废液备用；

[0055] 4)离心管中加入500μL的溶液P1(已加入RNaseA)，涡旋震荡摇动至底部菌斑完全溶解，使菌体彻底悬浮；

[0056] 5)加入500μL的溶液P2，轻柔地上下翻转6-10次，使菌体充分裂解(该过程切勿剧烈晃动，避免基因组DNA污染)；

[0057] 6)加入700μL溶液P2，轻柔翻转6-8次，充分混匀，观察是否出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min，离心管底部形成沉淀；

[0058] 7)将上步收集的上清液分次加入过滤柱CS，12000rpm离心2min，将收集管中获得的溶液分次加入CP4中，吸附柱12000rpm离心1min，弃废液；

[0059] 8)向CP4中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，弃废液；

[0060] 9)向CP4中加入600μL漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃洗脱液，重复该步骤1次；

[0061] 10)将CP4放回收集管12000rpm离心2min：

[0062] 11)将CP4置于一个新的1.5mL离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加40-60μL ddH2O(65℃-70℃预热效果最佳)，室温静置2min，12000rpm离心1min，之后测定质粒浓度。

[0063] (3)pCAMBIA1300质粒双酶切

[0064] 将提取的pCAMBIA1300质粒按照以下反应体系对质粒进行双酶切(50μL)：10μL Plastic DNA，1μL Kpn I，1μL Sma I，5μL 10×QuickCut Buffer(Takara)，33μL ddH2O。

[0065] 反应条件：37℃ 1-2h。

[0066] (4)重组反应

[0067] 将插入pEASY-Blunt载体中的LlDFRa基因PCR片段的PCR产物与酶切后的pCAMBIA1300载体进行重组反应，从而得到pCAMBIA1300-LlDFRa，于冰水浴中配置如下重组反应体系：2μL II，40ng插入片段的扩增产物，60ng载体质粒，4μL 5×CE II 
Buffer，ddH2O补满反应体系到20μL。

[0068] 配制该体系之前，先分别测定插入片段的PCR产物与酶切后的载体的浓度及纯度，根据最适克隆载体与插入片段摩尔比1∶2，取用适宜的量。

[0069] 体系配制完成以后，用移液器轻轻吹打混匀，避免产生气泡及剧烈震荡。置于37℃反应30min，之后冰水浴冷却5min，贮存于-20℃冰箱。

[0070] (5)连接转化

[0071] 取5μL以上冷却反应液，加入到50μL Trans1感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰浴30min。42℃热激90秒，冰浴2min。加入300μL LB液体培养基(不含抗生素)，37℃摇菌1h。
3000rpm离心1min，吸除150μL上清液，吹打剩余液体，均匀涂布于含Kna的平板上，于37℃倒置过夜培养。

[0072] (6)阳性克隆的鉴定及测序

[0073] 用无菌牙签于每个板子上挑取12个白色单克隆，先在新的平板上备份，之后蘸至7μL无菌水中，配成20μL的PCR反应体系：1μL菌液，10μL 2×Taq Mix，1μL 1300Reverse Primer(10mM)，1μL 1300Forward Primer(10mM)，7μL ddH2O。PCR检测反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。

[0074] 用1％的琼脂糖胶检测PCR产物，于备份中选取三个阳性克隆，用无菌牙签蘸取至800μL液体LB筛选培养基中，37℃200rpm培养5-6h，之后进行测序。测序鉴定无误后，保菌备份。

[0075] 通过以上具体方法，以测序正确的pEASY-Blunt-LlDFRa质粒为模板进行扩增，回收PCR产物。再利用双酶切将LlDFRa目标片段插入到含有报告基因GFP的pCAMBIA1300载体中，然后转入到Trans1感受态细胞中，通过Trans1获得大量重组质粒。所获重组质粒经过酶切鉴定后，用电转法将其导入根癌农杆菌GV3101中。之后将含有载体的农杆菌及辅助表达载体P19于含有LB液体培养(100mg·L-1卡那霉素)中进行振荡培养(28℃，200r·min-1)至菌液OD600在0.6-1.0间，将菌液在4℃，5000r·min-1下离心5min收集菌体，用缓冲液(含有10mM·L-1 MgCl2，10mM·L-1生物缓冲液MES，150μM·L-1乙酰丁香酮)对菌体进行重悬，最后将重悬菌液按照比例(OD600比值为7∶5)混合，于室温静置2-3h。用1mL医用注射器将含混合菌液注入本氏烟草叶背面，放入培养箱中培养2-3d，在激光共聚焦显微镜下观察注射pCAMBIA1300-LlDFRa-农杆菌GV3101的烟草下表皮细胞的表达情况，分别于GFP绿色荧光场(GFP)、叶绿体粉色荧光场(Chloroplast)、白光场(Bright Field)和前三者混合场(Merged)下观察，同时以携带空载体pCAMBlAl300的农杆菌GV3101注射烟草下表皮细胞的表达情况为对照，确定长筒石蒜LlDFRa蛋白的亚细胞定位情况。

[0076] 结果如图3所示，将LlDFRa-GFP注射到本氏烟草长出的第5-8片烟草叶中，放入培养箱中培养2d后，在激光共聚焦显微镜观察显示在本氏烟草表皮细胞细胞核、细胞膜、细胞质中可以检测到GFP信号，初步证明LlDFRa蛋白主要定位于细胞核、细胞膜及细胞质中，为典型的结构蛋白。

[0077] II、转基因烟草阳性株系的鉴定及表型分析

[0078] 将LlDFRa基因的全长编码区序列通过XbalI和SalI酶切位点克隆到含有CaMV 35S启动子的pCAMBIA1304载体上，连接转化步骤同pCAMBIA1300-LlDFRa载体构建中使用的具体方法，采用电转法将含有目的基因的表达载体转入土壤农杆菌EHA105，叶盘法转化烟草。

[0079] 花青素的提取与保存方法：将保存于-80℃的烟草花冠材料在液氮中充分研磨后称取干粉50mg，加入1.5mL的1％盐酸甲醇提取液，充分振荡1min，于4℃避光提取，每8h振荡一次，提取24h，4℃，10000rpm，离心10min，吸取上清，用0.22μm滤膜过滤后存放于1.5mL棕色色谱瓶中，于-20℃保存。

[0080] 花青素含量测定方法：称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品，用体积分数1％盐酸甲醇溶液溶解，分别配制成0.01、0.025、0.05、0.075、0.1mg/mL并制作标准曲线。液相色谱所用色谱柱为C18，二极管阵列检测器，流动相A液为乙腈，B液为体积分数0.4％磷酸溶液，A、B液体积比为20∶80，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样体积10μL，检测波长526nm。以标准品质量浓度(x)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程及相关系数：y＝0.0225x-2.5427，R2＝0.9994，浓度ug/mL。用于花青素的定量分析。

[0081] 为了验证LlDFRa基因的功能，通过农杆菌转化将该LlDFRa基因转入烟草，在所获得的阳性植株中选择两个转基因株系L9和L32，以野生型烟草为对照，对转基因植株进行了表型分析，结果如图4所示，对比野生型，转基因植株从蕾期到盛花期花色都更深更红。野生型烟草蕾期花冠呈青绿色，盛开期为粉红色，花丝为青绿色；而转基因植株蕾期花冠呈红色，盛开期为浅红，花丝为也明显带有浅红色。花青素含量测定结果也表明转基因植株花冠中的花青素含量显著高于对照(图5)，2个株系L9和L32花冠中花青素平均含量分别是对照的2.7倍和3.5倍。

[0082] 为了验证LlDFRa基因的功能，以野生型烟草植株作对照，通过荧光定量PCR验证LlDFRa在转基因植株中的表达。对转基因株系进行LlDFRa表达分析，发现L9和L32两株系间也存在表达量的差异(图6)，LlDFRa在L32株系中表达量稍高，这与花青素在L32株系具有更高积累的结果相互印证，说明超表达LlDFRa基因遗传转化烟草所得到的阳性株系也存在着基因表达强弱的情况，但对比野生型均明显积累了花青素。以上结果表明LlDFRa显著促进了烟草花中花青素的积累。