一种光激活型溶酶体靶向荧光探针及其合成方法和应用

摘要

本发明提供了一种光激活型溶酶体靶向荧光探针及其合成方法和在检测二氧化硫中的应用，所述衍生物的中文名称为3‑(3'，3'‑二甲基‑6‑硝基螺并[苯并吡喃‑2,2'‑吲哚]‑1'‑基)‑N‑(2‑((2‑(3‑吗啉代丙基)‑1,3‑二氧‑2,3‑二氢‑1H‑苯并[de]异喹啉‑6‑基)氨基)乙基)丙酰胺，英文名称为3‑(3',3'‑dimethyl‑6‑nitrospiro[chromene‑2,2'‑indolin]‑1'‑yl)‑N‑(2‑((2‑(3‑morpholinopropyl)‑1,3‑dioxo‑2,3‑dihydro‑1H‑benzo[de]isoquinolin‑6‑yl)amino)ethyl)propanamide，命名为Ly‑NSP。本发明还提供了一种光激活型溶酶体靶向荧光探针合成方法和在检测二氧化硫中的应用。所述应用是在pH＝7.4的PBS溶液中，通过荧光分光光度计定量检测二氧化硫的含量。该检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确度高。

权利要求

1.一种光激活型溶酶体靶向荧光探针Ly‑NSP，其特征在于，结构式为：。

2.如权利要求1所述的一种光激活型溶酶体靶向荧光探针Ly‑NSP的合成方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐和3‑吗啉‑1‑丙胺溶解在无水乙醇中，将混合物在85℃加热反应5‑6小时；反应完成后将反应液冷却到室温，所得残渣用冰乙醇洗涤，得到白色粉末状产物，即6‑溴‑2‑（3‑吗啉代丙基）‑1H‑苯并[去]异喹啉‑1,3（2H）‑二酮；其中4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐和3‑吗啉‑1‑丙胺的摩尔比为1 ：1.0‑1.5；

（2）将6‑溴‑2‑（3‑吗啉代丙基）‑1H‑苯并[去]异喹啉‑1,3（2H）‑二酮和乙二胺溶解在乙二醇甲醚中，混合物在125℃搅拌回流6‑8小时，冷却至室温后将反应液倒入冰水中，继续搅拌，所得沉淀过滤、洗涤、真空干燥得到黄色固体，即6‑（（2‑氨基乙基）氨基）‑2‑（3‑吗啉代丙基）‑1H‑苯并[异]喹啉‑1,3（2H）‑二酮，其中6‑溴‑2‑（3‑吗啉代丙基）‑1H‑苯并[去]异喹啉‑1,3（2H）‑二酮和乙二胺的摩尔比为1 ：2‑4；

（3）将2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚和3‑溴丙酸在无水乙腈中混合，将混合物在85℃加热反应12‑14小时；反应完成后减压除去溶剂，所得残渣用乙醚洗涤除去未反应原料，残余物用体积比1 : 5的二氯甲烷与丙酮重结晶得到浅紫色粉末状产物，即1‑（2‑羧乙基）‑2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚‑1‑溴化物；其中2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚和3‑溴丙酸的摩尔比为1 ：1‑3；

（4）将1‑（2‑羧乙基）‑2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚‑1‑溴化物和5‑硝基水杨醛在无水乙醇中混合，混合物在85℃搅拌回流6‑8小时，然后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥得到淡黄色固体，即3‑（3'，3'‑二甲基‑6‑亚硝基螺[色烯‑2,2'‑二氢吲哚] ‑1'‑基）丙酸, 其中1‑（2‑羧乙基）‑2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚‑1‑溴化物和5‑硝基水杨醛的摩尔比为1 ：1‑1.5；

（5）将3‑（3'，3'‑二甲基‑6‑亚硝基螺[色烯‑2,2'‑二氢吲哚] ‑1'‑基）丙酸，1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，1‑羟基苯并三唑混合溶解于无水N，N‑二甲基甲酰胺中，混合物在0℃惰性气体保护下反应0.5‑1小时，然后向反应体系中分别加入6‑（（2‑氨基乙基）氨基）‑2‑（3‑吗啉代丙基）‑1H‑苯并[异]喹啉‑1,3（2H）‑二酮和三乙胺，混合物在室温下反应24‑30小时；反应结束后将混合物倒入冰水中，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得粗产物，粗产物用体积比20 : 1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，得到浅黄色粉末状目标物3‑（3'，3'‑二甲基‑6‑硝基螺并[苯并吡喃‑2,2'‑吲哚] ‑1'‑基）‑N‑（2‑（（2‑（3‑吗啉代丙基）‑1,3‑ 二氧‑2,3‑二氢‑1H‑苯并[de]异喹啉‑6‑基）氨基）乙基）丙酰胺，其中3‑（3'，3'‑二甲基‑6‑亚硝基螺[色烯‑2,2'‑二氢吲哚] ‑1'‑基）丙酸，1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，1‑羟基苯并三唑，6‑（（2‑氨基乙基）氨基）‑2‑（3‑吗啉代丙基）‑1H‑苯并[异]喹啉‑1,3（2H）‑二酮和三乙胺的摩尔比为1 ：2‑3：2‑3：0.8‑1：2‑3。

3.如权利要求1所述的一种光激活型溶酶体靶向荧光探针Ly‑NSP在制备二氧化硫检测试剂中的应用。

4.一种检测二氧化硫的方法，包括如下步骤：（1）、配制pH=7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，配制2 mM的二氧化硫溶液，将权利要求

1所述的Ly‑NSP溶于DMSO配制成2 mM的溶液；

（2）、取2 mL的pH为7.4的PBS溶液、10 µL Ly‑NSP的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，用紫外光对荧光比色皿进行照射并在荧光分光光度仪上检测，随着紫外光照射时间增加，

535nm处的荧光强度逐渐降低，630 nm处的荧光强度逐渐增强；在此基础上向荧光比色皿中加入亚硫酸钠，随着待测样亚硫酸钠的加入，535nm处的荧光强度逐渐增强，630 nm处的荧光强度逐渐减弱；

（3）、在8个比色皿中，各加入2 mL的pH = 7.4的PBS 溶液、10 µLLy‑NSP的DMSO溶液，紫外光照射150秒后，分别向比色皿加入二氧化硫溶液的体积为0、10、20、30、40、50µL，然后在荧光光谱仪上测定630 nm与535 nm处荧光强度的比值为0.96、0.79、0.59、0.42、0.33、

0.20；以二氧化硫浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到二氧化硫浓度的工作曲‑6

线；线性回归方程为：F630/F535 = ‑0.015 c + 0.934，c的单位为10  mol/L；

（4）、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得二氧化硫的浓度。

5.如权利要求1所述的光激活型溶酶体靶向荧光探针Ly‑NSP在制备细胞成像试剂中的应用。

说明书

一种光激活型溶酶体靶向荧光探针及其合成方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及荧光探针和二氧化硫检测，特别涉及一种光激活型溶酶体靶向荧光探针及其合成方法和应用，具体属于一种螺吡喃‑萘酰亚胺衍生物及其合成方法和在区分检
测二氧化硫中的应用。

背景技术

[0002] 近年来，越来越多的研究表明溶酶体在维持细胞正常生理功能方面发挥重要作用，活性硫化物的代谢与溶酶体内众多酶活性密切相关。溶酶体是内源性二氧化硫产生的
主要场所，同时也是细胞内的“消化系统”。为了防御潜在的应激损伤，溶酶体在调节细胞程
序性凋亡过程中发挥重要机制。二氧化硫作为一种重要的小分子活性硫化物，具有多种病
理活性，如抗菌、抗高血压、抗氧化以及对心肌缺血再灌注损伤的保护作用等，内源性产生
的二氧化硫可以增强细胞抗氧化作用，并且在信号传导过程中起重要作用。因此，开发有效
的方法监测溶酶体内二氧化硫含量变化具有重大的研究有意义，对于生物研究和临床诊断
起着至关重要的作用。

[0003] 应生物体系中二氧化硫水平检测的要求，设计选择性好、准确度高且低细胞毒性的荧光探针，已成为生物医学发展中具有挑战性的前沿课题之一。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种光激活型溶酶体靶向荧光探针及其制备方法，所述荧光探针可用于二氧化硫检测，且检测方法简单，操作方便，选择性好，准确度高。

[0005] 本发明提供了一种光激活型溶酶体靶向荧光探针，3‑(3'，3'‑二甲基‑6‑硝基螺并[苯并吡喃‑2,2'‑吲哚]‑1'‑基)‑N‑(2‑((2‑(3‑吗啉代丙基)‑1,3‑二氧‑2,3‑二氢‑1H‑苯并
[de]异喹啉‑6‑基)氨基)乙基)丙酰胺，英文名称为3‑(3',3'‑dimethyl‑6‑nitrospiro
[chromene‑2,2'‑indolin]‑1'‑yl)‑N‑(2‑((2‑(3‑morph‑

[0006] olinopropyl)‑1,3‑dioxo‑2,3‑dihydro‑1H‑benzo[de]isoquinolin‑6‑yl)amino)ethyl)propanamide，命名为Ly‑NSP，结构式为：

[0007]

[0008] 本发明提供的一种光激活型溶酶体靶向荧光探针Ly‑NSP的合成方法，步骤为：

[0009] (1)将4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐和3‑吗啉‑1‑丙胺溶解在无水乙醇中，将混合物在85℃加热反应5‑6小时；反应完成后将反应液冷却到室温，所得残渣用冰乙醇洗涤，得到白色
粉末状产物，即6‑溴‑2‑(3‑吗啉代丙基)‑1H‑苯并[去]异喹啉‑1,3(2H)‑二酮；其中4‑溴‑1,
8‑萘二甲酸酐和3‑吗啉‑1‑丙胺的摩尔比为1：1.0‑1.5；

[0010] (2)将6‑溴‑2‑(3‑吗啉代丙基)‑1H‑苯并[去]异喹啉‑1,3(2H)‑二酮和乙二胺溶解在乙二醇甲醚中，混合物在125℃搅拌回流6‑8小时，冷却至室温后将反应液倒入冰水中，继
续搅拌，所得沉淀过滤、洗涤、真空干燥得到黄色固体，即6‑((2‑氨基乙基)氨基)‑2‑(3‑吗
啉代丙基)‑1H‑苯并[异]喹啉‑1,3(2H)‑二酮，其中6‑溴‑2‑(3‑吗啉代丙基)‑1H‑苯并[去]
异喹啉‑1,3(2H)‑二酮和乙二胺的摩尔比为1：2‑4；

[0011] (3)将2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚和3‑溴丙酸在无水乙腈中混合，将混合物在85℃加热反应12‑14小时；反应完成后减压除去溶剂，所得残渣用乙醚洗涤除去未反应原料，残余
物用体积比1:5的二氯甲烷与丙酮重结晶得到浅紫色粉末状产物，即1‑(2‑羧乙基)‑2,3,3‑
三甲基‑3H‑吲哚‑1‑溴化物；其中2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚和3‑溴丙酸的摩尔比为1：1‑3；

[0012] (4)将1‑(2‑羧乙基)‑2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚‑1‑溴化物和5‑硝基水杨醛在无水乙醇中混合，混合物在85℃搅拌回流6‑8小时，然后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥得到淡
黄色固体，即3‑(3'，3'‑二甲基‑6‑亚硝基螺[色烯‑2,2'‑二氢吲哚]‑1'‑基)丙酸,其中1‑
(2‑羧乙基)‑2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚‑1‑溴化物和5‑硝基水杨醛的摩尔比为1：1‑1.5；

[0013] (5)将3‑(3'，3'‑二甲基‑6‑亚硝基螺[色烯‑2,2'‑二氢吲哚]‑1'‑基)丙酸，1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，1‑羟基苯并三唑混合溶解于无水N，N‑二甲基甲酰
胺中，混合物在0℃惰性气体保护下反应0.5‑1小时，然后向反应体系中分别加入6‑((2‑氨
基乙基)氨基)‑2‑(3‑吗啉代丙基)‑1H‑苯并[异]喹啉‑1,3(2H)‑二酮和三乙胺，混合物在室
温下反应24‑30小时；反应结束后将混合物倒入冰水中，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得
粗产物，粗产物用体积比20:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，得得到浅黄
色粉末状目标物3‑(3'，3'‑二甲基‑6‑硝基螺并[苯并吡喃‑2,2'‑吲哚]‑1'‑基)‑N‑(2‑((2‑
(3‑吗啉代丙基)‑1,3‑二氧‑2,3‑二氢‑1H‑苯并[de]异喹啉‑6‑基)氨基)乙基)丙酰胺，其中
3‑(3'，3'‑二甲基‑6‑亚硝基螺[色烯‑2,2'‑二氢吲哚]‑1'‑基)丙酸，1‑(3‑二甲氨基丙基)‑
3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，1‑羟基苯并三唑，6‑((2‑氨基乙基)氨基)‑2‑(3‑吗啉代丙基)‑1H‑
苯并[异]喹啉‑1,3(2H)‑二酮和三乙胺的摩尔比为1：2‑3：2‑3：0.8‑1：2‑3。

[0014] 所述光激活型溶酶体靶向荧光探针Ly‑NSP可用于二氧化硫检测。

[0015] 本发明提供的一种检测二氧化硫的方法，步骤为：

[0016] (1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM的二氧化硫溶液，将Ly‑NSP溶于DMSO配制成2mM的溶液；

[0017] (2)、取2mL的PBS(pH＝7.4)溶液、10μL Ly‑NSP的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，用紫外光对荧光比色皿进行照射并在在荧光分光光度仪上检测，随着紫外光照射时间
增加，535nm处的荧光强度逐渐降低，630nm处的荧光强度逐渐增强。在此基础上向荧光比色
皿中加入亚硫酸钠，随着待测样亚硫酸钠的加入，535nm处的荧光强度逐渐增强，630nm处的
荧光强度逐渐减弱；

[0018] (3)、在8个比色皿中，各加入2mL的PBS(pH＝7.4)溶液、10μL Ly‑NSP的DMSO溶液，紫外光照射120秒后，分别向比色皿加入二氧化硫溶液的体积为0、10、20、30、40、50μL，然后
在荧光光谱仪上测定630nm与535nm处荧光强度的比值为0.96、0.79、0.59、0.42、0.33、
0.20；以二氧化硫浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到二氧化硫浓度的工作曲
‑6
线；线性回归方程为：F630/F535＝‑0.015c+0.934，c的单位为10 mol/L；

[0019] (4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得二氧化硫的浓度。

[0020] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

[0021] 1、本发明光激活型溶酶体靶向荧光探针操作方便；

[0022] 2、本发明光激活型溶酶体靶向荧光探针能实现对溶酶体二氧化硫的准确检测，显示了高的灵敏性和极好的选择性；

[0023] 3、本发明检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；

[0024] 4、本发明检测信号明显，为比率型荧光信号。

附图说明

[0025] 图1实施例1制备的Ly‑NSP核磁氢谱图

[0026] 图2实施例1制备的Ly‑NSP的核磁碳谱图

[0027] 图3实施例1制备的Ly‑NSP的质谱图

[0028] 图4实施例2Ly‑NSP与紫外光作用的荧光发射图

[0029] 图5实施例3Ly‑NSP与二氧化硫的荧光发射图

[0030] 图6实施例4Ly‑NSP与各种分析物的荧光柱状图

[0031] 图7实施例5测定二氧化硫的工作曲线

[0032] 图8实施例6Ly‑NSP测定样品的荧光发射图

[0033] 图9实施例7Ly‑NSP细胞成像图

具体实施方式

[0034] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

[0035] 实施例1

[0036] 光激活型溶酶体靶向荧光探针Ly‑NSP的制备和表征

[0037] (1)将4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐(2.77g,10mmol)和3‑吗啉‑1‑丙胺(1.78g,12mmol)溶解在50mL无水乙醇中，将混合物在85℃加热反应5小时；反应完成后将反应液冷却到室温，
所得残渣用20mL冰乙醇洗涤三次，得到白色粉末状产物(3.13g,产率：78.4％)；

[0038] (2)将6‑溴‑2‑(3‑吗啉代丙基)‑1H‑苯并[去]异喹啉‑1,3(2H)‑二酮(0.802g,2mmol)和乙二胺(0.18g,3mmol)溶解在20mL乙二醇甲醚中，混合物在125℃搅拌回流6‑8小
时，冷却至室温后将反应液倒入100mL冰水中，继续搅拌30分钟，所得沉淀过滤、洗涤、真空
干燥得到黄色固体(0.66g,产率：85.2％)；

[0039] (3)将2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚(3.18g,20mmol)和3‑溴丙酸(6.08g,40mmol)在30mL无水乙腈中混合，将混合物在85℃加热反应12小时；反应完成后减压除去溶剂，所得残渣用
20mL乙醚洗涤三次除去未反应原料，残余物用体积比二氯甲烷(5mL)与丙酮(25mL)重结晶
得到浅紫色粉末状产物(3.78g,产率:57.7％)；

[0040] (4)将1‑(2‑羧乙基)‑2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚‑1‑溴化物(3.27g,10mmol)，5‑硝基水杨醛(1.83g,11mmol)和三乙胺(1.7mL,12mmol)在70mL无水乙醇中混合，混合物在85℃搅
拌回流6‑8小时，然后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥得到暗黄色固体(3.03g,产率:
83.7％)；

[0041] (5)将3‑(3'，3'‑二甲基‑6‑亚硝基螺[色烯‑2,2'‑二氢吲哚]‑1'‑基)丙酸(0.363g,1mmol)，1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(0.52g,4mmol)，1‑羟基苯
并三唑(0.76g,4mmol)混合溶解于10mL无水N，N‑二甲基甲酰胺中，混合物在0℃氩气保护下
反应0.5小时，然后向反应体系中分别加入6‑((2‑氨基乙基)氨基)‑2‑(3‑吗啉代丙基)‑1H‑
苯并[异]喹啉‑1,3(2H)‑二酮(0.30g,0.8mmol)和三乙胺(0.3mL)，混合物在室温下反应24
小时。反应结束后将混合物倒入50mL冰水混合物，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得粗产
物，粗产物用体积比20:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，得橘黄色粉末
1
(0.47g,产率：79.3％)。H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.61(d,J＝7.3Hz,1H),8.42(d,J＝8.3Hz,
1H),8.25(d,J＝8.4Hz,1H),7.98(d,J＝8.9Hz,1H),7.87(s,1H),7.66(t,J＝7.8Hz,1H),
7.14(d,J＝7.1Hz,1H),7.12(t,J＝7.8Hz,1H),7.09(d,J＝7.2Hz,1H),6.90(t,J＝7.4Hz,
1H),6.69(t,J＝9.5Hz,2H),6.64(d,J＝7.7Hz,1H),6.51(d,J＝8.4Hz,1H),6.21(s,1H),
5.74(d,J＝10.3Hz,1H),4.26(t,J＝7.3Hz,2H),3.80–3.74(m,1H),3.73–3.66(m,2H),3.63
(s,4H),3.56–3.51(m,1H),3.39(d,J＝4.4Hz,2H),2.73–2.67(m,1H),2.54(d,J＝10.4Hz,
13
2H),2.52–2.41(m,4H),2.02–1.93(m,2H),1.22(s,3H),1.05(s,3H).(图1) C NMR(151MHz,
CDCl3)δ174.53(s),164.79(s),164.29(s),159.14(s),149.75(s),146.12(s),141.13(s),
136.09(s),134.45(s),131.17(s),129.80(s),128.54(s),127.83(s),127.03(s),125.91
(s),124.96(s),122.97(s),122.79(s),122.09(s),121.57(s),120.30(s),120.15(s),
118.54(s),115.37(s),110.16(s),106.79(d,J＝15.7Hz),103.29(s),66.93(s),56.61
(s),53.53(s),52.92(s),46.37(s),39.96(s),39.28(s),38.57(s),35.79(s),25.65(s),
+
19.73(s).(图2)ESI‑MS:[M+H]Calcd.For 745.3349,Found 745.3346(图3)。

[0042] 实施例2

[0043] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM的二氧化硫溶液，将Ly‑NSP溶于DMSO配制成2mM的溶液；取2mL的PBS(pH＝7.4)溶液、10μL Ly‑NSP的DMSO溶液加到一个荧
光比色皿中，然后将荧光比色皿置于紫外光下分别照射0、30、60、90、120秒，同时在荧光分
光光度仪上检测，随着紫外光照射时间增加，535nm处的荧光强度逐渐降低，630nm的荧光强
度逐渐增强。荧光发射图见图4。

[0044] 实施例3

[0045] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM的二氧化硫溶液，将Ly‑NSP溶于DMSO配制成2mM的溶液；取2mL的PBS(pH＝7.4)溶液、10μL Ly‑NSP的DMSO溶液加到一个荧
光比色皿中，然后将荧光比色皿置于紫外光下分别照射120秒，然后取二氧化硫的水溶液，
逐渐用微量进样器加到此比色皿中，加样的同时在荧光分光光度仪上检测，随着二氧化硫
的加入，535nm处的荧光强度逐渐增强，630nm的荧光强度逐渐减弱。荧光发射图见图5。

[0046] 实施例4

[0047] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM的二氧化硫溶液，将Ly‑NSP溶于DMSO配制成2mM的溶液；在荧光比色皿中，各加入2mL的PBS(pH＝7.4)溶液、10μL Ly‑NSP
的DMSO溶液，然后将荧光比色皿置于紫外光下分别照射120秒，再分别加入10倍当量的其它
2‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ 2‑ ‑ ‑
分析物和二氧化硫的水溶液：Cys,Hcy,GSH,SO4 ,SCN ,F ,Cl ,Br ,I ,AcO ,CO3 ,NO2 ,N3 ,
2‑ ‑
SO3 ,HSO3在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的630nm处与535nm处荧光强度
比值柱状图(见图6)。二氧化硫使得检测体系在630nm处与535nm荧光强度明显降低，其它的
分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。

[0048] 实施例5

[0049] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM的二氧化硫溶液，将Ly‑NSP溶于DMSO配制成2mM的溶液；在8个比色皿中，各加入2mL的PBS(pH＝7.4)溶液、10μL Ly‑NSP的
DMSO溶液，紫外光照射120秒后，分别向比色皿加入二氧化硫溶液的体积为0、10、20、30、40、
50μL，然后在荧光光谱仪上测定630nm与535nm处荧光强度的比值为0.96、0.79、0.59、0.42、
0.33、0.20。以二氧化硫浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到二氧化硫浓度的
‑6
工作曲线；线性回归方程为：F630/F535＝‑0.015c+0.934，c的单位为10 mol/L。(见图7)。

[0050] 实施例6

[0051] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并用Ly‑NSP的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫水溶液；把10μL Ly‑NSP的DMSO溶液加入到2mL的PBS(pH＝7.4)溶液的荧光比色皿中，
取二氧化硫的溶液35μL，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定630nm与
‑6
535nm处荧光强度的比值为0.397，通过实施例4的线性回归方程，求得c＝35.79×10 mol/
L，偏差为2.2％。见图8。

[0052] 实施例7

[0053] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM Ly‑NSP的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫的水溶液；把10μL Ly‑NSP的DMSO溶液加入到2mL的PBS中；将探针溶液加入HeLa细
胞培养液中，使得其浓度为10μM，与HeLa细胞在37℃下，反应15min，体系在荧光成像仪下呈
现绿色荧光；将HeLa在紫外光环境下照射3min，体系在荧光成像仪下显示红色荧光，然后再
加入外源的二氧化硫，使其浓度为分别为50μM，在37℃下，反应15min，体系在荧光成像仪下
出现绿色荧光,见图9。