一种突变的几丁质酶及其应用

摘要

本发明公开了一种几丁质酶SsChi18A的突变基因SsChi18A_1，所述基因的突变位点为K186A，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了所述基因在制备几丁质酶中的应用。实验证明，这种基因所编码的突变几丁质酶活性可达到84.2U/μmol，比野生型酶提高了55％；且与野生型一样，能够耐受70℃高温，并在pH 4‑11的缓冲体系中稳定；该突变几丁质酶具有高活性、耐高温的特性，能够被广泛应用在寡糖生产、原生质体制备、生物杀虫剂、抗真菌药物和生物农药生产加工等众多领域。

权利要求

1.一种突变的几丁质酶，所述突变的几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码权利要求1所述突变的几丁质酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组表达载体。

6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的骨架载体来源于pET-

15b、pET-22b或pET-28a。

7.包含权利要求4-6任一所述重组载体的重组菌株。

8.根据权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌。

9.根据权利要求8所述的重组菌株，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。

10.权利要求1所述的突变的几丁质酶、权利要求2-3任一所述的基因、权利要求4-6任一所述的重组载体或权利要求7-9任一所述的重组菌株在降解含有几丁质的材料中的应用。

11.权利要求1所述的突变的几丁质酶、权利要求2-3任一所述的基因、权利要求4-6任一所述的重组载体或权利要求7-9任一所述的重组菌株在制备几丁质寡糖中的应用。

12.一种降解含有几丁质或者含有几丁质寡糖的材料的方法，所述方法包括利用权利要求1所述的突变的几丁质酶、权利要求2-3任一所述的基因、权利要求4-6任一所述的重组载体或权利要求7-9任一所述的重组菌株对含有几丁质或者含有几丁质寡糖的材料进行处理的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述处理的温度为30℃-80℃。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述处理的温度为50℃-70℃。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述处理的pH为3-11。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述处理的pH为4-7。

说明书

一种突变的几丁质酶及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种突变的几丁质酶及其应用。

背景技术

[0002] 几丁质是一种多聚-β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)，是自然界中除纤维素外含量11
第二丰富的多糖。几丁质主要来源于甲壳类动物，每年水体中产生的几丁质高达10 吨。生物质中的几丁质去矿化并除蛋白以获取纯甲壳素的过程常用浓酸或碱来进行的，但会造成腐蚀及产生环境问题。酶法降解几丁质能够产生多种药理活性成分，例如N-乙酰葡糖胺(NAG)和几丁质寡糖(CHOS)，可以作为药物输送载体和抗氧化剂，在抗肿瘤、伤口愈合、控制血液胆固醇和食品保存方面发挥作用。几丁质酶的来源广泛，酶解过程环境友好，在工业生产中应用潜力巨大。目前，几丁质酶制剂广泛应用在医药、食品、生物技术、植物病虫害防治等众多领域。

[0003] 来自链霉菌(Streptomyces sp.F-3)的几丁质酶Chi18A(SsChi18A)是一种良好的工业用酶。Streptomyces sp.F-3能够耐受50℃的高温，并且具有相对高的几丁质降解活性，能够降解真菌细胞壁中的几丁质。

[0004] SsChi18A的酶反应最适温度为70℃，且在这个温度下蛋白仍然稳定；最适pH值为5，酶在pH 4-6时仍具有85％以上的活性，且其在pH 4-11的缓冲体系中相对稳定。总的来说，与真菌几丁质酶相比，几丁质酶SsChi18A不仅耐热，而且对pH变化表现出更宽的耐受性，表明它们在工业应用中的潜在用途。SsChi18A水解胶体几丁质和几丁质粉末时，酶活分别是54.33和4.81U/μmol；作为一种持续性几丁质酶，其水解产物主要是几丁质二糖。持续性几丁质酶在天然结晶几丁质的降解过程中发挥了重要作用，其能够连续的作用于几丁质分子链，减少随机碰撞带来的能量损失，因而在底物降解过程中具有明显优势。

[0005] 综上，SsChi18A是一种理想的工业用酶，可以用作几丁质寡糖的生产和抗真菌药物等。但是，在SsChi18A的实际应用中，仍存在着亟待解决的问题；缩短工艺流程，提高生产效益亟待具有更高活性几丁质酶的出现。为了扩展SsChi18A的工业应用，提高其酶活性是一个很关键的任务，然而，目前还未见关于SsChi18A增强酶活性和其相关突变基因的报道。

发明内容

[0006] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种突变的几丁质酶及其应用。

[0007] 一方面，本发明提供了一种突变的几丁质酶，所述突变的几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0008] 另一方面，本发明还提供了所述突变的几丁质酶的编码基因；优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

[0009] 另一方面，本发明还提供了包含所述突变的几丁质酶的编码基因的重组载体；优选的，所述重组载体为重组表达载体；优选为pET系列的载体，例如，pET-15b、pET-22b、pET-28a。

[0010] 另一方面，本发明还提供了包含上述重组载体的重组菌株，优选的，所述重组菌株为大肠杆菌，如，大肠杆菌BL21。

[0011] 另一方面，本发明还提供了所述突变的几丁质酶、所述编码基因、所述重组载体或重组菌株在降解含有几丁质的材料中的应用。应当理解，含有几丁质的材料包括天然含有几丁质的材料，或者经加工的含有几丁质的材料；此外，几丁质单体也属于含有几丁质的材料的概念。

[0012] 另一方面，本发明还提供了所述突变的几丁质酶、所述编码基因、所述重组载体或重组菌株在制备几丁质寡糖中的应用。

[0013] 另一方面，本发明还提供了一种降解含有几丁质或者含有几丁质寡糖的材料的方法，所述方法包括利用所述突变的几丁质酶、所述编码基因、所述重组载体或重组菌株对含有几丁质或者含有几丁质寡糖的材料进行处理的步骤。应当理解，含有几丁质的材料包括天然含有几丁质的材料，或者经加工的含有几丁质的材料；此外，几丁质单体也属于含有几丁质的材料的概念。含有几丁质寡糖的材料包括天然含有几丁质寡糖的材料，或者经加工的含有几丁质寡糖的材料；此外，单纯的几丁质寡糖也属于含有几丁质寡糖的材料的概念。

[0014] 优选的，所述寡糖为二糖、三糖、四糖、五糖或六糖。

[0015] 进一步的，所述处理的温度为30℃-80℃，优选，50℃-70℃；所述处理的pH为3-11，优选，4-7。

[0016] 本发明具有的有益效果是：

[0017] 本发明中突变基因SsChi18A_1所编码的突变几丁质酶SsChi18A-K186A具有高酶活性，在60℃下酶活为84.2U/μmol，比野生型酶SsChi18A提高了55％；与野生型一样，能够耐受70℃高温，并在pH4-11的缓冲体系中稳定。本发明突变的几丁质酶在实际工业生产过程中，在工农业生产中具有更大的应用空间。由于其在高温条件下具有较高的水解活力和良好的热稳定性，因而有助于提升生化反应速率、减少微生物污染，从而降低成本提高效益。在作为医药、食品、生物技术、植物病虫害防治等工业用酶时，能在更广泛的环境中保持较高活性，具体应用包括但不仅限于：

[0018] 在医药生产过程中中，此突变几丁质酶既可以作为微生物抑制剂来制备眼科制剂，也可以作为抗真菌药物的添加剂应用于真菌疾病的治疗。在食品工业中，此突变几丁质酶可以用于几丁质寡糖的生产，既能作为抗微生物剂和免疫增强剂，激活宿主防御系统；又可以用作骨关节炎、风湿性关节炎治疗剂和食品添加剂，调节人体健康。在生物技术产业中，此突变几丁质酶可以和其它细胞壁降解酶一起用于真菌原生质体的制备。在植物病害防治过程中，此突变几丁质酶可以作为生防制剂来预防植物病原体和害虫，能够快速水解植物病害真菌的细胞壁，从而导致细胞裂解，进而杀死病原真菌。

附图说明

[0019] 图1为本发明的SsChi18A-K186A蛋白表达的SDS-PAGE结果图，其中M为Unstained Protein Marker(Thermo Scientific,MA,USA)，其它为突变几丁质酶SsChi18A-K186A。泳道1是异源表达过程中大肠杆菌胞内含有目的蛋白的粗酶液；泳道2是经过Ni Sepharose 6Fast Flow亲和柱对含有6×His tag的目的蛋白进行亲和纯化后的粗酶液；泳道5-1和5-2分别代表的是用5mM咪唑洗脱第一次和第二次获得的蛋白；其余20-1到250-2分别代表的是用20mM、40mM、60mM、100mM和250mM咪唑洗脱第一次、第二次和第三次或第四次获得的蛋白。

[0020] 图2为本发明SsChi18A-K186A与SsChi18A在最适条件下的相对酶活性图。

[0021] 图3为本发明SsChi18A-K186A与SsChi18A降解不同的几丁质寡糖的结果示意图。WT代表的是野生型SsChi18A，K186A代表的是突变体蛋白SsChi18A-K186A。(GlcNAc)3、(GlcNAc)4、(GlcNAc)5、(GlcNAc)6分别代表的是几丁质三糖、几丁质四糖、几丁质五糖和几丁质六糖。其中M代表Marker，由不同聚合度的几丁质寡糖组成。数字0、2、5、10、20和30分别代表的是酶降解底物0分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟和30分钟所形成的产物谱。

具体实施方式

[0022] 下面结合附图以及具体实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

[0023] 实施例1、几丁质酶SsChi18A的突变以及重组载体的构建

[0024] (1)从NCBI数据库中获取几丁质酶SsChi18A基因，将SsChi18A基因和质粒pET28a连接，获得pET28a-SsChi18A质粒，所述pET28a-SsChi18A质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。以上述重组质粒为模板，设计突变引物，进行定点突变，引物序列如下：

[0025] K186A-sense：TCGGACGGAGGCGCACTCGACGCGG；

[0026] K186A-antisense：GAGTGCGCCTCCGTCCGAGGCGTCC；

[0027] PCR扩增反应体系如下：

[0028]

[0029] 反应程序如下：

[0030] 预热，94℃，5min；变性，94℃，30s；退火，55-65℃，30s；30cycles；延伸，72℃，2min；再延伸，72℃，10min；4℃，forever。

[0031] (2)取3μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，留下条带清晰的反应产物。用DpnI限制酶对产物中野生型的质粒进行消化，确保之后步骤中的转化子均为突变型。消化体系如下表，将体系充分混合，于37℃水浴反应15min；

[0032]

[0033] (3)将消化后的PCR产物进行纯化，实验步骤参照北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司GV-High–Efficiency DNA Fragments Purification Kit；

[0034] (4)突变质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：

[0035] 将10μL已纯化的上述突变质粒加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min；42℃热击90s；冰浴2min，加1mL液体LB，37℃摇床中培养1-1.5h；8000rpm离心2min，弃上清(留少许底部液体)。将剩余溶液涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃过夜倒置培养；次日挑取单克隆，接种在5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃200rpm过夜培养；

[0036] (5)提取质粒，实验步骤参照北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司GV-Plasmid DNA Mini Extraction Kit；

[0037] (6)取3μL质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，留下条带清晰的质粒；

[0038] (7)取10μL质粒溶液于灭菌EP管中进行测序。比对测序结果和原始序列，确认定点突变是否成功。测序正确的质粒即为含有几丁质酶SsChi18A的突变基因SsChi18A_1的重组载体pET28a-SsChi18A-K186A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0039] 实施例2、构建含有上述突变基因SsChi18A_1的重组工程菌

[0040] 本实施例中构建含有上述突变基因SsChi18A_1的重组工程菌，具体步骤如下：将2μL测序正确的上述突变质粒pET28a-SsChi18A-K186A加入50μL大肠杆菌BL-21感受态细胞，冰浴30min；42℃热击90s；冰浴2min，加入1mL液体LB，37℃摇床中培养1-1.5h；8000rpm离心2min，弃上清(留少许底部液体)。将剩余溶液涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB平板，涂布均匀至干燥，37℃过夜倒置培养；次日挑取单克隆，接种在5mL含抗生素的LB培养基中，37℃
200rpm过夜培养，即得到含有突变基因SsChi18A_1的重组工程菌。

[0041] 实施例3：突变基因SsChi18A_1的重组表达

[0042] 发酵表达并纯化上述突变基因SsChi18A_1所编码的突变几丁质酶SsChi18A-K186A，具体步骤如下：

[0043] (1)重组蛋白的异源表达：

[0044] 取实施例2得到的含有上述突变基因SsChi18A_1的重组工程菌，于5mL LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素)37℃200rpm过夜培养；

[0045] 将培养过夜的菌液转接到装有300mL LB培养基的1L三角瓶中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃下培养约3h，至OD600＝0.6-0.8；加入终浓度为0.5mM的IPTG，20℃诱导培养20h；8000rpm，4℃离心10min，得到菌体沉淀；

[0046] 用pH 8.0的NaH2PO4-NaCl缓冲液重悬菌体，将菌液置于100mL离心管中；将离心管置于冰上，超声破碎细胞，时间设置为9s ON，10s OFF，共90次；11000rpm，4℃离心30min；用0.22μm的滤头过滤上清液，把柱子的填料与滤液结合，准备进行亲和纯化。

[0047] (2)重组蛋白的纯化：

[0048] 使用GE Healthcare公司Ni Sepharose 6Fast Flow亲和柱对含有6×His tag的目的蛋白进行亲和纯化。将上一步获得的粗酶液与填料混合，于4℃转动结合2h，使填料上的镍与蛋白上的His标签充分结合；

[0049] 用pH 8.0的NaH2PO4-NaCl缓冲液配制浓度为1M的咪唑母液，然后分别稀释到5mM，20mM，60mM，100mM，250mM，用以上浓度的咪唑洗脱蛋白，分别收集至10mL EP管中；

[0050] 蛋白洗脱后镍柱再生，镍柱再生时按照如下顺序加入对应溶液：50mM EDTA→蒸馏水→1M NaCl→蒸馏水→0.1M硫酸镍→蒸馏水→70％乙醇→20％乙醇保存备用；

[0051] 将收集的酶液进行SDS-PAGE：将样品与SDS buffer按4:1混匀(样品取16μL，buffer取4μL)，Marker取10μL，105℃处理10min；点样时样品点12μL，Marker点5μL。用80V电压进行电泳，待蛋白样品呈一条直线时把电压调成180V。电泳结束后考马斯亮蓝R-250染液染色30min，脱色液脱色约2h，用扫描仪扫胶观察；

[0052] 找出目的蛋白条带较纯的几管，加pH 5.0的NaH2PO4-柠檬酸缓冲液，4900rpm于4℃超滤，至滤出的缓冲液pH＝5.0；

[0053] 用无菌的0.22μm滤头将超滤后的酶液过滤到灭菌的10mL离心管中，4℃保存。如要长期保存，需置于-80℃。

[0054] (3)重组蛋白的含量测定：

[0055] 将目的蛋白稀释到合适的浓度(测定时不超过标准曲线的量程)；对照组加入0.1mL pH 5.0的NaH2PO4-柠檬酸缓冲液，实验组加入0.1mL稀释后的目的蛋白溶液。每管再分别加入1mL考马斯亮蓝染色液，摇匀。静置10min后测定OD595；每组三个平行，测定三次，共九组重复；根据标准曲线算出蛋白量和蛋白浓度。

[0056] 如图1所示，SDS-PAGE电泳显示，突变几丁质酶SsChi18A-K186A的条带为45kDa左右的标准蛋白，与预期大小相似。此结果显示，本发明成功获得了目标蛋白SsChi18A-K186A。

[0057] SsChi18A-K186A的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码基因序列如SEQ ID No.1所示。

[0058] 按照上述方法同样制备含有野生型基因SsChi18A的重组载体pET28a-SsChi18A，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，并进行蛋白的表达和纯化。

[0059] 实施例4：突变几丁质酶SsChi18A-K186A与野生型酶SsChi18A的酶学性质比较[0060] (1)突变几丁质酶SsChi18A-K186A和野生型酶SsChi18A在最适条件下的酶活性：

[0061] 将突变几丁质酶SsChi18A-K186A和野生型酶SsChi18A稀释到0.01μmol/mL；在对照组管中加入100μL pH 5.0的NaH2PO4-柠檬酸缓冲液，实验组管中加入100μL稀释过的酶液，每管再分别加入100μL浓度为10mg/mL的胶体几丁质(其溶于pH 5.0的50mM NaH2PO4-柠檬酸缓冲液)，60℃反应10min；

[0062] 每管各加入300μL DNS，沸水浴10min；迅速冷却，摇匀，离心，取上清，测定OD550；每种酶做三次重复实验；根据标准曲线算出还原糖量，再根据公式算出比酶活；比较两种蛋白的酶活性。

[0063] 突变几丁质酶SsChi18A-K186A与野生型几丁质酶SsChi18A在最适条件下的酶活性如图2所示。突变木聚糖酶SsChi18A-K186A的酶活性是野生型木聚糖酶SsChi18A的1.55倍，这证明突变几丁质酶对于几丁质聚糖具有较强的酶活性，具有潜在的应用价值。

[0064] (2)突变木聚糖酶SsChi18A-K186A和野生型酶SsChi18A在60℃下的寡糖产物谱测定：

[0065] 将突变几丁质酶SsChi18A-K186A和野生型酶SsChi18A稀释到0.01nmol/mL；实验组管中加入40μL稀释过的酶液，再加入60μL浓度为1mg/mL的几丁质寡糖溶液(其溶于pH 5.0的50mM Na2HPO4-柠檬酸缓冲液)，60℃反应30min；在第0、2、5、10、20、30min时分别取样；

[0066] 采用FACE电泳的方法检测其产物谱：首先，用溶于15％乙酸的过饱和7-氨基-1,3-萘二磺酸盐(ANDS)溶液与样品等体积混合(各取5μL)，避光反应1小时；随后将等体积的NaCNBH3溶液加入混合物中，42℃温育过夜；在混合液中加入15μL的50％蔗糖溶液；并将标记后的产物以7μL/孔的比例用于电泳；使用ChemiDocTM MP成像系统扫描图像，并将图像文件以TIFF格式存储。

[0067] 突变几丁质酶SsChi18A-K186A与野生型几丁质酶SsChi18A在60℃下处理不同时间的寡糖产物谱如图3所示。突变几丁质酶SsChi18A-K186A能在10min内完成几丁质五糖的降解，在20min内完成几丁质六糖的降解；而野生型几丁质酶SsChi18A在30min内寡糖均不能降解完成。这证明突变几丁质酶对于几丁质寡糖也具有较强的酶活性，具有潜在的工业应用价值。

[0068] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。