一种美洲黑杨促雄基因MmS及其应用

摘要

本发明公开了一种美洲黑杨促雄基因MmS及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明公开的美洲黑杨雄性特异的促雄基因MmS不编码蛋白，而是作为miRNA海绵吸附miRNA，通过降低所吸附的自由miRNA的浓度，从而使下游靶基因表达量上调。MmS基因在杨树雄株中以半合子的形式存在，仅存在于Y染色单体上，X染色单体不含该基因。促雄基因使杨树雄株雄花发育，而杨树雌株不含该基因，所以杨树雌株的雄性花器官不发育。杨树雄株达到性成熟年龄后会产生大量花粉，造成严重环境污染，在杨树雄株中敲除MmS基因，可以培育不产生花粉的杨树新品系，也可在植物中导入该基因，促进雄花发育，该基因在杨树育种中具有重要的应用价值。

权利要求

1.一种美洲黑杨的促雄基因MmS，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.含有权利要求1所述的美洲黑杨的促雄基因MmS的载体或重组菌。

3.权利要求2所述的美洲黑杨的促雄基因MmS的载体，其特征在于，所述的载体是pCambia2301-35S-plus-Mms过表达载体。

4.权利要求1所述的美洲黑杨的促雄基因MmS在杨树性别早期鉴定及杨树分子育种中的应用。

5.权利要求4所述的美洲黑杨的促雄基因MmS在杨树分子育种中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备杨树MmS基因敲除载体；

2)敲除杨树雄株中的促雄基因MmS；

3)培育筛选，得到雄花不发育或不产花粉的杨树植株。

6.权利要求1所述的美洲黑杨的促雄基因MmS在促进植物雄花发育中的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或美洲黑杨，包括以下步骤：

1)构建杨树MmS基因过表达载体；

2)将所构建的杨树MmS基因过表达载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到雄蕊增多或雄蕊发育增强的植株。

说明书

一种美洲黑杨促雄基因MmS及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种美洲黑杨(Poplus deltoides)促雄基因MmS及其应用。

背景技术

[0002] 植物性染色体起源假说认为，性染色体起源于一对常染色体。性染色体的进化是从该对常染色体的一条染色体上发生了一个雄性或者雌性不育突变开始。植物性染色体起
源假说认为，性染色体起源于一对常染色体。性染色体的进化是从该对常染色体的一条染
色体上发生了一个雄性或者雌性不育突变开始，由于某种未知原因造成突变部位的重组受
到抑制，非重组区域逐渐扩展最终形成异型的性染色体。雌雄异株植物比近缘的雌雄同株
植物在进化上出现的时间更短，雌雄异株植物是由雌雄同株植物进化而来。理论上植物性
由雌雄同株进化为雌雄异株涉及两个功能相反的基因，即抑雌基因和促雄基因，这两个基
因独立作用于雌花或雄花的发育。

[0003] 近年来，对植物性别基因克隆研究取得了一定进展，如2014年SCIENCE杂志上发表了柿子的性别决定基因OGI，该基因是一个Y特异的半合子，编码一个miRNA，其调控的靶基
因是位于常染色体上的MeGI基因，MeGI基因编码一个具有同源异形结构域的、调控花药育
性的转录因子。因此柿子雌性性别的发生是由位于Y染色体上OGI基因编码的miRNA，对位于
常染色体上的靶基因MeGI的抑制引起的。但柿子中仅发现了一个性别调控基因，论文的作
者认为柿子中可能还存在另外一个没有被发现的性别决定基因。另外，2017和2018年发表
的对芦笋和对弥猴桃性别分化的研究，分别发现了两个性别决定候选基因，且基因功能研
究结果显示两个性别决定基因相互独立且功能相反，分别作用于雌性或雄性花器官发育。
芦笋和弥猴桃均为假性雌雄异株，即雌花和雄花分别具有相反性别花器官的正常结构，但
两个性别决定基因分别使相反性别的花器官败育，导致了雌雄分化。这两种植物的性别分
化在花发育早期没有明显差异，雌雄性别的差异是在花发育的后期出现的。

[0004] 杨树为典型的雌雄异株植物，雄花和雌花都没有相反性别的花器官发育。杨树花芽发育过程的动态观察显示，杨树虽然在早春开花，但石蜡切片显微观察发现，杨树花芽分
化在上一年的6月份就已经完成。因此，杨树性别决定基因在花发育早期即产生作用，分别
决定雌花和雄花原基的形成。以往开展的细胞学观察研究发现，杨树基因组中都没有形态
上有显著差异的性染色体，其性染色体尚处于进化的早期阶段。虽然杨树的性别二型性主
要表现在花器官的形态差异上，但有很多研究发现杨树的雌、雄株在环境适应性、生长速度
和生物量产量性状上存在显著差异。性别对生长性状有显著影响，雄株总体上优于雌株。雌
株达到性成熟后会产生大量飞絮，造成严重的空气污染，已引发越来越多的社会关注。而杨
树雄株达到性成熟年龄后会产生大量花粉，造成严重环境污染。因此，利用杨树植树造林或
绿化，应充分考虑性别的重要影响，但杨树的性别决定基因一直未被克隆和确定。

[0005] 杨树分布广泛，生长迅速，高大挺拔，用途很广，是重要的人工林造林树种，其木材主要用于工业用材，已成为胶合板、纤维板、造纸等行业重要加工原料。我国是世界上杨树
栽培面积最大的国家，杨树人工林面积已达853万公顷(第八次全国森林资源清查结果)。由
于杨树的童期很长，长达6～7年，阐明其性别调控分子基础，对杨树性别早期鉴定及分子育
种具有重要应用价值，有助于对不同性别的杨树资源加以开发和利用。

发明内容

[0006] 针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种美洲黑杨促雄基因MmS。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述美洲黑杨促雄基因MmS的应
用方法。

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

[0008] 一种美洲黑杨的促雄基因MmS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 含有所述的美洲黑杨的促雄基因MmS的载体、重组菌或宿主细胞。

[0010] 优选地，所述的载体是pCambia2301-35S-plus-Mms过表达载体。

[0011] 所述的美洲黑杨的促雄基因MmS在杨树性别早期鉴定及杨树分子育种中的应用。

[0012] 优选地，所述的美洲黑杨的促雄基因MmS在杨树分子育种中的应用，包括以下步骤：

[0013] 1)制备杨树MmS基因敲除载体；

[0014] 2)敲除杨树雄株中的促雄基因MmS；

[0015] 3)培育筛选，得到雄花不发育或不产花粉的杨树植株。

[0016] 美洲黑杨的促雄基因MmS在促进植物雄花发育中的应用，包括以下步骤：

[0017] 1)构建杨树MmS基因载体；

[0018] 2)将所构建的杨树MmS基因载体转化到植物或植物细胞中；

[0019] 3)培育筛选得到雄蕊增多或雄蕊发育增强的植株。

[0020] 有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

[0021] 本发明公开了一种美洲黑杨雄性特异的促雄基因MmS，该基因不编码蛋白，而是作为miRNA海绵吸附miRNA，通过降低所吸附的自由miRNA的浓度，从而使下游靶基因表达量上
调。MmS基因在杨树雄株中以半合子的形式存在，仅存在于Y染色单体上，X染色单体不含该
基因。促雄基因使杨树雄株雄花发育，而杨树雌株不含该基因，所以杨树雌株的雄性花器官
不发育。杨树雄株达到性成熟年龄后会产生大量花粉，造成严重环境污染，在杨树雄株中敲
除MmS基因，可以培育不产生花粉的杨树新品系，能够解决花粉污染带来的环境问题，加上
杨树童期长达6～7年，因此，该基因在杨树性别早期鉴定和杨树育种中具有重要的应用价
值；同时，也可在植物中导入该基因，促进雄花发育，是另一种应用该基因的重要方式。

附图说明

[0022] 图1为杨树雄性特异的染色体片段示意图；SDR-Y上的环状片段显示Y染色单体上的特异片段，该片段含FERR-R，MmS基因和一个转座子序列；

[0023] 图2为杨树雌、雄花芽分化过程图；2A显示对应时期雌、雄花芽的形态变化；2B显示对应时期雌、雄花芽石蜡切片的纵切面显微观察；右下箭头指示雄花的花药，其余箭头指示
雌、雄花芽的小花花原基；

[0024] 图3为杨树雄性特异MmS基因的动态转录表达示意图；S5期显示了MmS基因在去掉鳞片和不去掉鳞片的花芽中的表达水平对比；

[0025] 图4为杨树雄性特异MmS基因作为miRNA海绵吸附miRNA的功能展示图；图上部展示MmS基因，中部展示MmS基因的转录，下部展示MmS基因转录本的作用位点，及作用位点2对
miR172a的吸附作用；

[0026] 图5为杨树雄性特异MmS基因的分子调控模型图；5A显示杨树雄株含MmS基因，而雌株不含MmS基因；5B显示杨树雌、雄株中对miRNAs的吸附差异；5C显示杨树雌、雄株中由于对
miRNAs吸附作用的不同，雌株与雄株相比，相应靶基因的表达水平下调。

[0027] 图6为在拟南芥中转化杨树MmS基因的功能验证结果图；

具体实施方式

[0028] 下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

[0029] 实施例1

[0030] (1)获得美洲黑杨雄性特异MmS基因

[0031] 利用美洲黑杨全同胞作图群体进行杨树性别决定基因定位，性别决定基因被定位于第十九染色体的末端。性别连锁分析发现杨树性别决定基因为雄性杂合，说明美洲黑杨
性别为XY决定系统。参照美洲黑杨雄株的基因组序列，我们在性别决定区设计了SSR标记，
然后对性别决定基因区开展了局部区域精细作图，对性别决定基因区进行单倍型构建显
示，杨树Y染色单体上有一段Y特异的半合子片段。利用收集的美洲黑杨自然群体种质材料，
开展了全基因组重测序。利用重测序数据，我们开展了全基因组Read覆盖度与性别基因的
关联分析。结果显示，雌株中没有出现雌性特异的半合子片段，而单倍型构建检测到的Y特
异的半合子片段在群体水平上是保守的，即所有雄性个体均含这一Y特异的半合子片段。通
过序列注释从这一片段中获得两个非编码基因，其中一个全长为2468bp，命名为MmS，具体
序列如SEQ ID NO.1所示(图1)。

[0032] (2)杨树雄性特异MmS基因的动态转录表达分析

[0033] 基因注释显示MmS基因不编码蛋白，其转录本不含polyA尾巴。所以采用lncRNA-Seq技术来检测该基因的表达水平。为测定MmS基因在杨树雌、雄株中的表达，对美洲黑杨
雌、雄花芽，从2018年6月份开始取样，一直取到2019年1月份，共设置了9个取样时间点，分
别为S1(2018年6月3号)，S2(2018年6月18号)，S3(2018年7月3号)，S4(2018年7月18号)，S5
(2018年8月3号)，S6(2018年8月18号)，S7(2018年9月3号)，S8(2018年12月1号)，S9(2019年
1月15号)。花芽发育形态变化见图2A，石蜡切片显微观察显示，雄花芽在6月3号即可分辨。
以上所采集样品中，7月18号之前花器官占整个花芽的比例极低，取样时花芽未剥去鳞片。8
月3号以后的样品取样时剥去鳞片。为比较剥掉和未剥掉鳞片的样品对照，S5时间点的样品
分别用了剥掉和未剥掉鳞片的花芽作为对照。对采集的样品，提取RNA后，采用一步法去除
gDNA和进行cDNA反转录合成。对目的基因MmS设计定量引物。内参基因选用PtUBQ。时实定量
PCR实验程序如下：配置20μL反应体系包括100ng的cDNA、4pmol的上下游引物，10μL AceQ 
qPCR SYBR Green Master Mix，无菌超纯水补齐至20μL。反应步骤，首先95℃变性3分钟，然
后进行40个反应循环包括95℃变性15秒、60℃退火15秒、72℃延伸30秒。基因的表达计算使
用2-ΔCT方法，即ΔCT＝CT目的基因-CT内参基因。利用T测验的方法检测在同一取样点雌、雄样品之间
的表达差异是否显著。测定结果显示，MmS基因为雄性特异组成性表达(图3)。

[0034] (3)杨树雄性特异MmS基因的功能及分子调控模式

[0035] lncRNA测序显示MmS基因在叶片和不同发育时期的花芽中均表达，但其转录本不翻译成蛋白，对MmS基因转录本序列分析发现，其含有多个与不同miRNAs序列高度匹配的位
点，显示MmS基因转录本可以通过对匹配的miRNAs产生吸附作用而发挥生物学功能。将作用
序列的最多不匹配碱基数设为5，我们共发现了MmS基因转录本上的8个与不同miRNAs起吸
附作用的位点。图4显示了lncRNA测序检测到的MmS基因转录本及其吸附不同miRNAs的作用
位点，其中作用位点2对miR172a的吸附展示在图4中，其他作用位点的序列及吸附的miRNAs
展示在表1中。

[0036] 表1.MmS基因转录本及其吸附不同miRNAs的作用位点

[0037]

[0038]

[0039] MmS基因转录本上的8个作用位点共吸附7种miRNAs，位点3和4吸附的miRNA相同，均吸附miR156k。在MmS基因转录本吸附的miRNAs中，miR156，miR159，miR172和miR319均已
在其他植物中证实参与花发育调控，而MmS基因转录本通过吸附调控miR156，miR159，
miR172和miR319水平，表明MmS基因对杨树花发育具有调控作用。作用位点还显示杨树中存
在一些特异的与花发育调控相关的miRNAs。图5显示MmS基因作为miRNAs海绵的分子调控模
式：MmS基因转录产生的RNA链上有多个作用位点，图中不同颜色的小刷子代表与这些作用
位点匹配度高的miRNAs，这些作用位点可以对相应的miRNA产生吸附作用。由于MmS基因转
录本对与其作用的miRNAs的吸附，降低了所吸附的自由miRNA的浓度，从而抑制了这些
miRNAs对其靶基因的作用，使相应的靶基因表达上调，由于MmS基因为雄性特异组成性表
达，所以其应当是促雄基因。

[0040] (4)杨树雄性特异MmS基因功能的遗传转化验证

[0041] 美洲黑杨雄株花芽为材料，利用植物基因组提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)提取基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量后，用引物F_Mms-in-fu-F/R和高
保真pfu酶进行PCR，PCR反应条件为：第一轮反应为94℃，2min；然后进行35次循环，每次94
℃，1min；55℃1min；72℃3min；循环结束后72℃延伸5min。PCR产物进行纯化和测序，获得目
标序列Mms。利用重组酶把Mms插入到pCambia2301-35S-plus双元载体的35S启动子下游
KpnI和BamHI之间，形成pCambia2301-35S-plus-Mms过表达载体。过表达载体pCambia2301-
35S-plus-Mms通过冻融法转化至农杆菌GV3101中。拟南芥(Clo-0)转化采用花序浸染法
(Clough and Bent，1998)，通过卡那霉素(50mg/ML)筛选获得T1代转基因植株，卡那霉素抗
性基因纯合T3代植株开展相关表型分析(以同期野生型为参照)。结果发现，在拟南芥中过
表达杨树MmS基因，花器官的雄蕊发育受到了显著影响，拟南芥野生型花器官为四强雄蕊，
即花器官有雄蕊6枚，其中4枚花丝较长，另2枚花丝较短，而转化植株普遍呈现六强雄蕊，另
外还出现雄蕊增多为7枚甚至8枚的表型，还观察到有的雄蕊出现分叉或发育出两枚花药的
表型(图6)。遗传转化的结果证实MmS基因为促雄基因。杨树雄株达到性成熟年龄后，会产生
大量花粉，飘粉引起过敏等诸多环境问题。因此，在杨树雄株中敲除MmS基因，可获得雄蕊不
发育或不飞粉的杨树植株；也可以通过在雄蕊发育较弱的植物中，导入MmS基因，促进其过
表达，使雄蕊发育增强，促进授粉有益结实，是该基因的另一有益应用方式。因此，杨树MmS
基因有重要育种应用价值。