一种细胞程序性死亡受体1抗体制剂及其用途转让专利
申请号 : CN202010008058.6
文献号 : CN110787292B
文献日 : 2020-04-24
发明人 : 方源 , 韩冬梅
申请人 : 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司
摘要 :
本发明提供了一种包含抗细胞程序性死亡受体1单克隆抗体的药物制剂，所述药物配制剂包括：抗PD‑1单克隆抗体、枸橼酸‑枸橼酸钠缓冲液、蛋白保护剂和、表面活性剂、等渗调节剂等成分。本品经过40℃，最长4周的加速实验，主要检测指标外观、浓度、浊度（A350）、pH值、渗透压、纯度等测试等标均无明显变化，表现出良好的稳定性。
权利要求 :
1.一种抗PD-1单克隆抗体的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂由10 mg/ml抗PD-1单克隆抗体、20 mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液、质量/体积百分比为3%的甘露醇、体积百分比为0.02%的聚山梨酯80和质量/体积百分比为0.3%的氯化钠组成，pH 5.5，其中质量/体积比为g/L，所述抗PD-1单克隆抗体是h1G4抗体，包含SEQ ID NO.10所示的重链和SEQ ID NO.9所示的轻链。
2.权利要求1所述的药物制剂在制备注射用液体制剂或冻干制剂中的应用。
说明书 :
一种细胞程序性死亡受体1抗体制剂及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种PD-1抗体制剂及其用途。
背景技术
[0002] 细胞程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)，也称CD279，是一种重要的免疫抑制分子，属于免疫球蛋白超家族CD28家族成员，分子量为50～55kD的I型跨膜糖蛋白。PD-1持续性表达在T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞以及骨髓细胞的表面。PD-1具有两个已知配体，PD-L1和PD-L2。目前，研究发现，PD-1与其配体PD-L1结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增生，而且PD-1还可以借由调节Bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性T细胞的聚积。而阻断PD-1与PD-L1的结合，可以有效阻止T淋巴细胞抑制信号的产生，从而打破免疫系统对自身组织的外周免疫耐受，促进T淋巴细胞的活化与增殖，以及细胞因子表达。因此研发新型的抗PD-1单克隆抗体，用于癌症的免疫治疗，使其具有更低的毒副作用，更佳的临床药效，成为目前的研究热点，也将给患者提供更多的药物选择。
[0003] 蛋白质(单克隆抗体等)类药物制剂适合于非肠道给药，包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下注射等给药方式。其液体制剂使用方便，但稳定性较差，对储存条件要求较高，一般需在低温条件下保存。此外液体制剂中蛋白易形成聚体或颗粒，也会导致单抗制剂稳定性下降。通常的药物制剂中，包含的蛋白质特别是单克隆抗体类药物，很难在储藏期内，尤其非冷藏条件下保持良好的物理稳定性、化学稳定性和生物稳定性，因此需要研究针对此类药物的稳定缓冲液体系。已有报道可在蛋白（单抗）类药物中加入的稳定剂包括表面活性剂、糖和多元醇、盐类、氨基酸/氨基酸盐以及一些大分子化合物。但是抗体类药物的结构性质各异且易于聚合，目前还缺乏满足制药工业需求的稳定的蛋白制剂。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种包含抗PD-1单克隆抗体的药物制剂。
[0005] 本发明通过筛选和配方优化研究，首先确定使用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液作为抗PD-1单抗药物制剂的优选缓冲体系。具体地该药物制剂包括抗PD-1单克隆抗体、缓冲液、稳定剂和表面活性剂、以及可选地包含等渗调节剂等成分。
[0006] 在经筛选的缓冲液体系基础上，设计单因素试验，考察蛋白质浓度、pH值以及稳定剂种类及含量、表面活性剂种类及含量、是否添加等渗调节剂等因素对蛋白稳定性的影响。从而优化筛选得出优选的其他制剂组分。
[0007] 所述药物制剂中抗PD-1单克隆抗体的含量较佳地为5-50 mg/mL，更佳地为8-30mg/mL，优选地为10.0mg/mL，所述抗PD-1单克隆抗体可选地为具有SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ ID NO.8所示的轻链可变区，优选h1G4抗体（由SEQ ID NO.10所示的重链和SEQ ID NO.9所示的轻链构成）。
[0008] 该制剂的缓冲液体系中，所述枸橼酸-枸橼酸钠的浓度较佳地为10-50mM，更佳地为15-30mM，优选地为20mM；所述药物制剂的pH值较佳地为：pH 5.0-6.5，优选地为：pH 5.5。
[0009] 本发明制剂还添加蛋白保护剂提供产品的稳定性，选自本领域常规蛋白保护剂，所述蛋白保护剂能够保护蛋白质药物的稳定性，并保护蛋白质药物的功能不受条件变化的影响(例如：冷冻、冻干或其他制备条件的变化)。蛋白保护剂较佳地包括：糖类、蛋白质、氨基酸、聚合物、盐、胺、表面活性剂等，更佳地包括：蔗糖、甘露醇、或甘氨酸中的一种或多种。所述蛋白保护剂的含量较佳地为：蔗糖、甘氨酸或甘露醇的一种或数种，质量/体积百分含量（g/L）0.5-5%；较佳地为：1-3%蔗糖，或者1%甘氨酸；优选地为：3%甘露醇。
[0010] 本发明制剂包括表面活性剂，选自本领域常规表面活性作用剂，较佳地为非离子型表面活性剂。本文中的表面活性剂的例子较佳地包括：聚山梨酯(例如聚山梨酯20和聚山梨酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-，肉豆蔻基-，亚油基-，或硬脂酰基-磺基甜菜碱；月桂基-，肉豆蔻基-，亚油基-，或硬脂酰基-肌氨酸；亚油基-，肉豆蔻基，或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰氨基丙基-，椰油酰氨基丙基-，亚油酰氨基丙基-，肉豆蔻酰氨基丙基-，棕榈酰氨基丙基-，或异硬脂酰氨基丙基-甜菜碱(例如月桂酰氨基丙基)；肉豆蔻酰氨基丙基-，棕榈酰氨基丙基-，或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基椰油基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson，N.J.)；聚乙二醇，聚丙二醇，及乙二醇和丙二醇共聚物(例如Pluronics，PF68等。其中，更佳地为聚山梨酯，优选地为聚山梨酯80。所述表面活性剂的含量较佳地为0.01％-0.05％，优选地为0.02％。
[0011] 本发明配制剂中可以根据需要含有或不含有等渗调节剂，其中所述等渗调节剂为本领域常规等渗调节剂，较佳地为氯化钠，含量为质量/体积百分比0.1-0.5%，其中质量/体积比为g/L。
[0012] 本发明对各个组分的制剂进行了40℃，最长4周的高温加速试验，检测评价各制剂配方的稳定性数据，检测项目包括：外观、浓度、浊度（A350）、pH值、渗透压、纯度(SEC-HPLC、CEX-HPLC)等测试。结合测试结果，分析得出最优的制剂配方。
[0013] 其中一个优选的实施方式为：抗PD-1单克隆抗体10 mg/ml ，20 mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，质量/体积百分比为3%的甘露醇，体积百分比为0.02%的聚山梨酯80，质量/体积百分比为0.3%的氯化钠，pH 5.5，其中质量/体积比为g/L。另一优选的制剂含有：抗PD-1单克隆抗体10 mg/ml， 20 mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，质量/体积百分比为1-3%的蔗糖，体积百分比为0.02%的聚山梨酯80，质量/体积百分比为0.3%的氯化钠，pH 5.5，其中质量/体积比为g/L。再一优选的配制剂含有：抗PD-1单克隆抗体10 mg/ml ，20 mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，质量/体积百分比为1%的甘氨酸，体积百分比为0.02%的聚山梨酯80，质量/体积百分比为0.3%的氯化钠，pH 5.5，其中质量/体积比为g/L。
[0014] 所述药物配制剂的剂型为本领域常规剂型，较佳地包括注射用液体制剂或冻干制剂等等。所述注射用液体制剂较佳地包括皮下注射制剂、静脉注射制剂、腹腔给药制剂、肌肉注射制剂、静脉/皮下注射制剂或玻璃体注射制剂等。所述注射用液体制剂较佳地包括水针注射制剂、预充针注射制剂等，优选地为水针注射制剂，该水针注射制剂可以用于静脉注射。
[0015] 本发明所得药物制剂经过高温加速测试，主要检测指标均无明显变化；在40℃条件下经过4周的加速处理，经检测表明，各项主要检测指标均无明显变化，较为稳定，且所有检测结果均符合本品现行质量标准要求，表现出良好的稳定性。
附图说明
[0016] 图1. h1G4抗体制剂缓冲体系筛选研究加速稳定性试验（40°C）SEC片段含量（%）柱状图。
[0017] 图2. h1G4抗体制剂缓冲体系筛选研究加速稳定性试验（40°C）浊度柱状图。
具体实施方式
[0018] 以下通过实施例对本发明进行进一步的详细说明，不应理解为对本发明的限制。
[0019] 试剂来源：本发明的实验部分涉及的试剂均为市售产品。
[0020] 实施例1. 样品测试方法
[0021] 1.1.渗透压检测
[0022] 移液器吸取20 μl样品及2份290 mOsmol/kg的渗透压标准品，采用Advanced 2020 型渗透压仪测定样品及标准品的渗透压值。
[0023] 1.2.SEC-HPLC
[0024] 采用Agilent 1260高效液相色谱，TOSOH TSK G3000（300*7.8 mm）色谱柱分析样品，柱温为室温，流速0.5 mL/min，检测波长280 nm。流动相组成为100 mM PB，0.5% NaCl，pH 6.8，供试样品用流动相稀释到1.0 mg/mL左右，进样50 μL，停止时间30 min。
[0025] 1.3.CEX-HPLC
[0026] 采用Agilent 1260高效液相色谱，Thermo ProPac WCX-10色谱柱 (4×250 mm)分析样品，柱温为35°C，流速1.0 mL/min，检测波长280 nm，流动相洗脱梯度见表 1所示。流动相A组成为CX-1 Gradient buffer A，pH 5.6，流动相B组成为CX-1 Gradient buffer B，pH 10.2，供试样品用流动相A稀释到1.0 mg/mL左右，进样20μL。
[0027] 表 1. 流动相洗脱梯度
[0028] 时间（min） 流动相B% 流速（mL/min）0.00 10.0 1.0
5.00 10.0 1.0
35.00 40.0 1.0
35.01 100.0 1.0
40.00 100.0 1.0
40.01 10.0 1.0
45.00 10.0 1.0
5.00 10.0 1.0
35.00 40.0 1.0
35.01 100.0 1.0
40.00 100.0 1.0
40.01 10.0 1.0
45.00 10.0 1.0
[0029] 1.4.DSC
[0030] 通过差示热量扫描方法测试供试品Tm onset、Tm1及Tm2值。样品扫描前需用安慰剂稀释至1.0 mg/ml。
[0031] 实施例2.抗体的制备
[0032] PD-1抗体h1G4来源自专利申请WO2018052818中所公开的h1G4，其制备方法完全引用WO2018052818。PD-1抗体h1G4的氨基酸序列如下：
[0033] 表 2 h1G4的CDR序列
[0034]
[0035] h1G4抗体重链可变区（VH）SEQ ID NO：7
[0036] QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWIRQAPGKGLEWVSTISGGGSNIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSYYYGIDFWGQGTSVTVSS
[0037] h1G4抗体轻链可变区（VL）SEQ ID NO：8
[0038] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTIPWTFGGGTKLEIK
[0039] h1G4抗体轻链（LC）SEQ ID NO：9
[0040] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTIPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0041] h1G4抗体重链（HC）SEQ ID NO：10
[0042] QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWIRQAPGKGLEWVSTISGGGSNIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSYYYGIDFWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
[0043] 实施例3.缓冲体系筛选研究
[0044] 本研究选择了两组不同的制剂缓冲体系作为备选处方（以下分别称为B1 B6），目~标药物h1G4抗体浓度为10.0 mg/mL。其中B1 B3为20 mmol/L 枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系，~
pH值为5.0、5.5及6.0；B4 B6为20 mmol/L组氨酸-组氨酸盐酸缓冲体系，pH值为5.0、5.5及~
6.0；上述缓冲体系中均含有3%甘露醇、0.02%聚山梨酯80以及0.3%氯化钠作为辅料，本材料中辅料浓度百分比均指代质量体积比（w/v，g/L）。h1G4抗体制剂缓冲体系筛选研究备选处方信息见表3。
pH值为5.0、5.5及6.0；B4 B6为20 mmol/L组氨酸-组氨酸盐酸缓冲体系，pH值为5.0、5.5及~
6.0；上述缓冲体系中均含有3%甘露醇、0.02%聚山梨酯80以及0.3%氯化钠作为辅料，本材料中辅料浓度百分比均指代质量体积比（w/v，g/L）。h1G4抗体制剂缓冲体系筛选研究备选处方信息见表3。
[0045] 表3. h1G4抗体制剂备选缓冲体系组成
[0046]
[0047] 取适量抗体原液超滤换液，加辅料，调节浓度制备成表3处方。生物安全柜内采用0.22 μm一次性无菌过滤器过滤样品，无菌分装至2 mL西林瓶中，加13 mm胶塞，轧13 mm铝塑组合盖。将分装后样品放置于40°C及2 8°C的恒温药用保存箱内正置2周，于第0、1、2周分~
别取样，检测分析，测试项目详见表4。
别取样，检测分析，测试项目详见表4。
[0048] 表4. h1G4抗体缓冲体系筛选研究考察条件
[0049]
[0050] 研究结果
[0051] 1.高温加速试验结果
[0052] 0周时除20 mmol/L pH 5.0的枸橼酸体系（C50）出现颗粒外，其余缓冲体系外观均为无色微乳光液体，无明显可见异物，浓度在9 11 mg/mL范围内，渗透压摩尔浓度为300~ ~340 mOsmol/kg。SEC主峰含量均大于99.0%，聚体含量为0.6 0.7%。CEX主峰含量为47.0~ ~
48.6%，酸性峰含量为11.0 14.3%，碱性峰含量为38.6 40.9%，R-CE-SDS纯度为94.1 96.9%。
~ ~ ~
基础理化检测结果显示0周时，各缓冲体系质量良好，无明显差异（见表5）。
48.6%，酸性峰含量为11.0 14.3%，碱性峰含量为38.6 40.9%，R-CE-SDS纯度为94.1 96.9%。
~ ~ ~
基础理化检测结果显示0周时，各缓冲体系质量良好，无明显差异（见表5）。
[0053] 在40°C加速条件下放置2周后，所有枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系蛋白浓度无明显变化，均在9 11 mg/mL范围内，但是组氨酸-组氨酸盐酸缓冲体系中浓度显著升高，并且C50、~C60以及H55缓冲体系出现蛋白沉淀，组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲体系浊度（A350：使用NanoDrop 2000C，加样2.5 μL，测定样品在350 nm波长下的吸光度值。重复测定三次取其均值为最终结果。）数值明显增加（见图1和图2），故缓冲体系优劣排序为C55>C60>C50, H60>H55>H50。40 ± 2ºC条件下放置2周CE-SDS测定重链含量降低5.4 23.7%，纯度排序为C55, ~
H55, H50>H60>C50>C60。
H55, H50>H60>C50>C60。
[0054] 40°C加速条件下放置2周，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系SEC主峰含量降低0.1 2.5%，~聚体含量增加0.1 0.4%，片段含量增加0 2.1%。但是所有组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲体系均~ ~
发生明显降解反应，因此枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系优于组氨酸-组氨酸盐酸体系，最佳pH为5.5。
发生明显降解反应，因此枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系优于组氨酸-组氨酸盐酸体系，最佳pH为5.5。
[0055] 表5. h1G4抗体缓冲体系筛选研究加速稳定性试验（40°C）数据汇总表
[0056]
[0057] 注：N/A表示不适用。
[0058] 实施例4.
[0059] 本轮研究共6个备选处方（以下分别称为F1 F6），目标蛋白h1G4抗体浓度为10.0 ~mg/mL。缓冲体系均为20 mmol/L pH 5.5的枸橼酸-枸橼酸钠溶液。除了处方F3不含氯化钠以外，其余处方中均含有0.3%氯化钠、0.02%聚山梨酯80，其中处方F1、F2和F5中甘露醇的含量分别为1%、3%和5%，单因素考察甘露醇含量对蛋白稳定性影响。对比处方F2（0.3% NaCl）及F3（0% NaCl），考察氯化钠是否有助于增加蛋白的稳定性。F2、F5和F6处方中分别含有等渗的3%甘露醇、3%蔗糖以及1%甘氨酸，筛选有助于h1G4抗体制剂长期稳定性的最优辅料体系。h1G4抗体制剂辅料筛选研究备选处方信息见表6。
[0060] 表6. h1G4抗体制剂辅料筛选研究备选处方组成
[0061]
[0062] 取适量原液超滤换液，加辅料，调节浓度制备成表6处方，生物安全柜内采用0.22 μm一次性无菌过滤器过滤样品，无菌分装至2 mL西林瓶中，加13 mm胶塞，轧13 mm铝塑组合盖。将分装后样品放置于40 ºC及2 8ºC的恒温药用保存箱内正置8周。于第0、1、2、4、6、8周~分别取样检测。
[0063] h1G4抗体制剂辅料筛选研究单因素试验设计6个处方，根据40 ºC加速稳定性试验结果以及辅料优劣排序（见表7），不含氯化钠的处方（F3）以及含有5%甘露醇的处方（F4）稳定性略差，含有1%甘露醇、3%甘露醇的处方与含有3%蔗糖的处方（F5）无显著性差异。
[0064] 表7. h1G4抗体制剂辅料筛选研究高温加速试验（40°C）数据汇总表
[0065]
[0066] 注：N/A表示不适用。*表示F4处方在40±2℃放置2周后乳光情况略重于其余处方。
[0067] 实施例5.稳定剂的筛选
[0068] 本轮研究通过单因素试验筛选制剂处方，共设计9个备选处方（以下分别称为F7~F15），目标药物h1G4抗体浓度为10.0 mg/mL。其中处方F7 F14的缓冲体系均为20 mmol/L ~
pH 5.5枸橼酸-枸橼酸钠，F15为20 mmol/L枸橼酸钠-磷酸氢二钠，制剂辅料筛选研究备选处方信息见表8。
pH 5.5枸橼酸-枸橼酸钠，F15为20 mmol/L枸橼酸钠-磷酸氢二钠，制剂辅料筛选研究备选处方信息见表8。
[0069] 表8. h1G4抗体制剂辅料筛选研究备选处方组成
[0070]
[0071] 取适量原液超滤换液，加辅料，调节浓度制备成表8处方，生物安全柜内采用0.22 μm一次性无菌过滤器过滤样品，无菌分装至2 mL西林瓶中，加13 mm胶塞，轧13 mm铝塑组合盖。将分装后样品放置于恒温摇床内40 ºC，200 rpm振摇4周。于第0、1、2、4周分别取样，检测分析（见表9）。
[0072] 表9. h1G4抗体制剂辅料筛选研究考察条件
[0073]
[0074] 研究结果
[0075] 0周时所有处方外观均为无色澄清液体，无明显可见异物，浓度在9 11 mg/mL范围~内，渗透压为185 540 mOsmol/kg，浊度（A350）为0.006 0.009。SEC主峰含量为98.0 98.2%，~ ~ ~
聚体含量为1.7 1.9 %。CEX主峰含量为35.4 39.1%，酸性峰含量为31.6 33.8%，碱性峰含量~ ~ ~
为27.5 30.8%（见表10）。基础理化检测结果显示0周时，各处方质量良好，无明显差异。
~
聚体含量为1.7 1.9 %。CEX主峰含量为35.4 39.1%，酸性峰含量为31.6 33.8%，碱性峰含量~ ~ ~
为27.5 30.8%（见表10）。基础理化检测结果显示0周时，各处方质量良好，无明显差异。
~
[0076] 经过最长4周的40°C加速处理，可以看出枸橼酸钠-磷酸氢二钠缓冲体系不适于h1G4抗体的稳定保存。
[0077] 表10. h1G4抗体制剂辅料筛选研究振摇稳定性试验（40 °C，200 rpm）数据汇总表[0078]
[0079] 注：N/A表示不适用。
[0080] 结果表明，本发明所得h1G4制剂成品在40 ºC条件下保存最长4周，外观、可见异物、蛋白质含量、SEC、CEX、pH、渗透压均未见明显变化趋势，均符合本品现行质量标准草案要求，表明所述制剂具有较好的稳定性。
[0081] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。