一种FasL-CAR融合蛋白和表达融合蛋白的T细胞及其制备方法和应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种FasL‑CAR融合蛋白和含FasL‑CAR融合蛋白T细胞及其制备方法和应用。表达FasL‑CAR融合蛋白的T细胞具有增强表达FasL蛋白的性质，增强了该T细胞的FasL/Fas信号途径诱导肿瘤细胞凋亡的能力，从而增强CAR‑T细胞杀伤肿瘤细胞的能力，减少治疗后肿瘤复发的可能性。将本方案的FasL‑CAR融合蛋白以及表达FasL‑CAR融合蛋白的T细胞应用于治疗肿瘤的药物中，可提供一条治疗癌症的有效途径。

权利要求

1.一种FasL‑CAR融合蛋白，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO:6所示。

2.一种表达FasL‑CAR融合蛋白的T细胞，其特征在于，所述FasL‑CAR融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO:6所示。

3.根据权利要求2所述的一种表达FasL‑CAR融合蛋白的T细胞的非治疗目的的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建表达质粒：将FasL蛋白的基因连接在已连接有CAR蛋白的基因的慢病毒表达载体上，获得表达质粒；所述表达质粒用于表达FasL‑CAR融合蛋白；所述慢病毒表达载体为pLVX‑IRES‑ZsGreen1；FasL‑CAR融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO:6所示；

（2）病毒包装：使用包装质粒和所述表达质粒共转染293T细胞，然后培养293T细胞，收集细胞培养基上清液，浓缩所述细胞培养基上清液，获得病毒浓缩液；

（3）T细胞感染：使用病毒浓缩液和促感染试剂同感染T细胞，获得所述表达FasL‑CAR融合蛋白的T细胞。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在（2）中，浓缩所述细胞培养基上清液的方法为：对所述细胞培养基上清液进行离心操作，获得病毒沉淀，然后用培养基重悬病毒沉淀，获得病毒浓缩液。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在（3）中，所述T细胞分离自人外周血，所述促感染试剂包括聚凝胺和4‑羟乙基哌嗪乙磺酸。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在（3）中，先使用T淋巴细胞刺激液处理T细胞，再使用病毒浓缩液和促感染试剂同感染T细胞；所述T淋巴细胞刺激液含有白细胞介素2、CD3单克隆抗体和CD28单克隆抗体。

7.根据权利要求1所述的FasL‑CAR融合蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。

说明书

一种FasL‑CAR融合蛋白和表达融合蛋白的T细胞及其制备方

法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种FasL‑CAR融合蛋白和表达融合蛋白的T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T Cell，简称CAR‑T)免疫疗法是一种高效且新颖的肿瘤免疫疗法，它利用病人自身的免疫T细胞，通过基因工程技术在体
外修饰后再回输到体内清除肿瘤细胞。目前，改造和制备CAR‑T细胞的技术大多集中在改变
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，简称CAR)的类别，以增强T细胞识别肿瘤细胞
的能力，再利用T细胞自身的清除肿瘤细胞的机制杀灭肿瘤细胞。CAR由胞内信号区(如
CD3zeta激活区和CD28/4‑1BB共刺激区)、跨膜区(如CD8跨膜区)以及胞外抗原结合区组成。
胞外抗原结合区具有识别特定肿瘤抗原(tumor‑associated antigen，TAA)的功能，由TAA
的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接形成。CAR的胞外抗原结合区一旦与TAA结
合，可通过胞内信号区使T细胞活化发挥效应功能，活化的T细胞会分泌穿孔蛋白、粒酶及细
胞因子协同作用杀死肿瘤细胞。

[0003] 但是，现有技术中的CAR‑T细胞利用CAR与肿瘤细胞识别并结合后，仅依靠T细胞自身机制清除肿瘤细胞，其杀伤肿瘤细胞的能力较低。在治疗过程中，需要对患者输送大量嵌
合抗原受体T细胞，或者反复进行多次CAR‑T细胞治疗，才能实现对肿瘤细胞的清除，现有
CAR‑T细胞治疗效果差、效率低、过程复杂且成本较高；除此之外，由于现有的CAR‑T细胞肿
瘤杀伤力较低，使得用该技术进行肿瘤治疗后，肿瘤细胞清除不彻底，存在较大的肿瘤复发
的风险。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种FasL‑CAR融合蛋白，该融合蛋白具有增强T细胞肿瘤杀伤能力的功能。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

[0006] 一种FasL‑CAR融合蛋白，所述FasL‑CAR融合蛋白包括FasL蛋白和CAR蛋白；所述CAR蛋白包括CD3zeta激活区，所述FasL蛋白包括胞浆区；所述胞浆区与所述CD3zeta激活区
连接。

[0007] 采用上述技术方案，技术原理如下：FasL‑CAR融合蛋白包括FasL蛋白和CAR蛋白，两种蛋白均为跨膜蛋白。表达FasL‑CAR融合蛋白的T细胞具有更强的肿瘤杀伤能力。CAR蛋
白CD3zeta激活区位于细胞内部，FasL蛋白的胞浆区位于细胞内部。

[0008] 在使用表达FasL‑CAR融合蛋白的T细胞(即CAR‑FasL‑T细胞)进行肿瘤治疗时，CAR蛋白的胞外抗原结合区与肿瘤细胞上的特定肿瘤抗原(TAA)识别并结合，进而激活CAR蛋白
的CD3zeta激活区，使T细胞活化发挥肿瘤杀伤的效应功能。在T细胞被TAA持续激活时，其表
面会表达FasL蛋白，FasL蛋白与肿瘤细胞上的Fas结合后会激活caspase‑8级联反应，导致
肿瘤细胞凋亡。在本方案中，CAR‑FasL‑T细胞可以表达FasL‑CAR融合蛋白，使得细胞内含有
的FasL蛋白的量上升，不通过TAA与T细胞的结合，T细胞也可以大量合成FasL蛋白，从而加
强了FasL/Fas信号途径对肿瘤细胞凋亡的诱导，增加了CAR‑T细胞对肿瘤的杀伤能力。除此
之外，FasL蛋白的胞浆区与CAR蛋白的CD3zeta激活区连接，FasL蛋白被相应细胞因子激活
之后，其胞浆区对CD3zeta激活区具有激活作用，进一步增加CD3zeta激活区的活性，加强对
T细胞的活化作用，从而增加了T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

[0009] 有益效果：

[0010] (1)本方案的CAR‑FasL‑T细胞可以表达FasL‑CAR融合蛋白，其中CAR蛋白部分起到识别和结合肿瘤细胞的作用，而FasL蛋白部分起到了促进肿瘤细胞凋亡的作用。FasL蛋白
不仅仅是在T细胞被TAA持续激活时表达，而是随着FasL‑CAR融合蛋白的表达而产生，使得T
细胞膜上常态化的嵌合有FasL蛋白，大大增强了FasL蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的效率和速
度。

[0011] (2)发明人在尝试使用FasL基因修饰T细胞的过程中，尝试过制备只表达FasL蛋白的T细胞，表达FasL蛋白和CAR蛋白的T细胞(两种蛋白分别表达，未形成融合蛋白)，但均未
获得理想的肿瘤杀灭效果。但是将FasL蛋白的胞浆区与CAR蛋白的CD3zeta激活区连接在一
起后(即形成融合蛋白)，FasL蛋白不但能够行使触发肿瘤细胞凋亡的功能，还能够反过来
进一步激活CAR蛋白的CD3zeta激活区，从而促进了T细胞的活化，进一步加强了T细胞的肿
瘤杀伤功能。在本方案中，FasL蛋白和CAR蛋白融合在一起后，可以发生相互作用，并协同加
强T细胞的肿瘤杀伤能力，获得了预料不到的效果。

[0012] (3)现有技术中，尚未有人尝试将T细胞的FasL蛋白过表达，因为单独过表达FasL蛋白会出现该蛋白无法有效附着在T细胞膜上的情况，进而释放到细胞外。除了肿瘤细胞，
正常细胞也会合成FasL的配体Fas，过表达FasL的T细胞会导致正常细胞的大量凋亡，带来
较大的不良反应，对人体损伤较大。所以研发人员不会考虑将FasL蛋白过表达，更不会想到
将FasL蛋白和其他蛋白同时过表达。发明人将FasL蛋白连接在CAR蛋白上形成融合蛋白，发
现CAR蛋白可将FasL固定在T细胞上，不会形成游离的FasL，并且CAR蛋白和肿瘤细胞靶向结
合，通过CAR识别肿瘤细胞特定表面抗原，将FasL带到肿瘤细胞附近，促进肿瘤细胞凋亡，
FasL不会结合正常细胞，减少了不良反应发生的概率。

[0013] 进一步，所述CAR蛋白还包括顺序连接胞外抗原结合区、CD8跨膜区和CD28/41BB共刺激区；所述胞外抗原结合区的基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述CD8跨膜区的基因序列
如SEQ ID NO:2所示；所述CD28/41BB共刺激区的基因序列如SEQ ID NO:3所示；CD3zeta激
活区的基因序列如SEQ ID NO:4所示。

[0014] 采用上述技术方案，上述序列表达的蛋白具有识别并结合肿瘤细胞的能力，还可以激活T细胞，使其发挥肿瘤杀伤的效应功能。CAR蛋白包括顺序连接胞外抗原结合区、CD8
跨膜区、CD28/41BB共刺激区和CD3zeta激活区。CAR蛋白通过CAR跨膜区镶嵌在T细胞的细胞
膜上，CD3zeta激活区位于细胞内部，胞外抗原结合区位于细胞外部。

[0015] 进一步，所述FasL蛋白还包括顺序连接FasL跨膜区和胞膜外区；所述FasL蛋白的基因序列如SEQ ID NO:5所示。

[0016] 采用上述技术方案，上述序列表达的蛋白具有激活caspase‑8级联反应、导致肿瘤细胞凋亡的功能。FasL蛋白为Fas蛋白的配体，FasL蛋白为II型跨膜糖蛋白，包括顺序连接
的胞浆区(位于细胞内)、FasL跨膜区和胞膜外区。FasL蛋白通过FasL跨膜区镶嵌在T细胞的
细胞膜上，胞浆区位于细胞内部，胞膜外区位于细胞外部。

[0017] 进一步，一种表达FasL‑CAR融合蛋白的T细胞，所述FasL‑CAR融合蛋白包括FasL蛋白和CAR蛋白；所述CAR蛋白包括顺序连接胞外抗原结合区、CD8跨膜区、CD28/41BB共刺激区
和CD3zeta激活区；所述FasL蛋白包括顺序连接的胞浆区、FasL跨膜区和胞膜外区；所述
FasL蛋白的胞浆区与所述CAR蛋白的CD3zeta激活区连接。

[0018] 采用上述技术方案，该T细胞(CAR‑FasL‑T细胞)具有增强表达FasL蛋白的性质，增强了该T细胞的FasL/Fas信号途径诱导肿瘤细胞凋亡的能力，从而增强CAR‑T细胞杀伤肿瘤
细胞的能力，减少治疗后肿瘤复发的可能性。除此之外，表达的FasL‑CAR融合蛋白中的FasL
蛋白不但能够行使触发肿瘤细胞凋亡的功能，还能够反过来进一步激活CAR蛋白的CD3zeta
激活区，从而促进了T细胞的活化，进一步加强了T细胞的肿瘤杀伤功能。

[0019] 进一步，一种表达FasL‑CAR融合蛋白的T细胞的制备方法，包括以下步骤：

[0020] (1)构建表达质粒：将FasL蛋白的基因连接在已连接有CAR蛋白的基因的慢病毒表达载体上，获得表达质粒；所述表达质粒用于表达FasL‑CAR融合蛋白；

[0021] (2)病毒包装：使用包装质粒和所述表达质粒共转染293T细胞，然后培养293T细胞，收集细胞培养基上清液，浓缩所述细胞培养基上清液，获得病毒浓缩液；

[0022] (3)T细胞感染：使用病毒浓缩液和促感染试剂同感染T细胞，获得所述表达FasL‑CAR融合蛋白的T细胞。

[0023] 采用上述技术方案，表达质粒可以在适合的表达体系(如转基因进入T细胞，利用T细胞的蛋白表达系统)中合成FasL‑CAR融合蛋白；经共转染293T细胞后，可以获得包装好的
病毒，该病毒可以用于感染目的T细胞，将含有FasL基因和CAR基因的载体转入目的T细胞
中。

[0024] 在本方案中形成的FasL‑CAR融合蛋白不但具有原来的识别和结合肿瘤细胞的功能以及启动肿瘤细胞FasL‑Fas介导的凋亡途径的功能，连接在一起的FasL蛋白和CAR蛋白
还具有协同增效的作用，FasL蛋白可以加强激活CAR蛋白的CD3zeta激活区，进一步活化T细
胞，从而增加了T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。除此之外，本方案构建表达质粒的方案较为
简单易行，只需要将FasL蛋白的基因和CAR蛋白的基因连接到同一慢病毒载体上，并使用慢
病毒载体上的同一启动子即可，不用采取更复杂的设计和操作。

[0025] 进一步，在(1)中，所述慢病毒表达载体为pLVX‑IRES‑ZsGreen1；FasL‑CAR融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO:6所示。

[0026] 采用上述技术方案，将FasL基因插入到CAR基因之后，使得FasL蛋白的胞浆区与CAR蛋白的CD3zeta激活区连接；pLVX‑IRES‑ZsGreen1为常用的慢病毒表达载体，容易获取，
可构建成稳定的表达质粒。

[0027] 进一步，在(2)中，浓缩所述细胞培养基上清液的方法为：对所述细胞培养基上清液进行离心操作，获得病毒沉淀，然后用培养基重悬病毒沉淀，获得病毒浓缩液。

[0028] 采用上述技术方案，可以提高病毒对T细胞的感染率。由于T细胞较难感染，为提高病毒的感染效率，需要将上清液离心，进而将病毒浓缩获得病毒浓缩液。

[0029] 进一步，在(3)中，所述T细胞分离自人外周血，所述促感染试剂包括聚凝胺和4‑羟乙基哌嗪乙磺酸。

[0030] 采用上述技术方案，从人外周血中分离得到T细胞，对T细胞进行改造后再输入回人体，进行肿瘤治疗，可以减少人体的排异反应，加强治疗效果。聚凝胺(polybrene)为一种
多聚阳离子聚合物,常用于哺乳动物细胞的DNA转染实验以增强转染成功率，4‑羟乙基哌嗪
乙磺酸(HEPES)为一种两性离子有机化学缓冲剂，维持转染的最佳pH值。

[0031] 进一步，在(3)中，先使用T淋巴细胞刺激液处理T细胞，再使用病毒浓缩液和促感染试剂同感染T细胞；所述T淋巴细胞刺激液含有白细胞介素2、CD3单克隆抗体和CD28单克
隆抗体。

[0032] 采用上述技术方案，在培养过程中，T淋巴细胞刺激液中的白细胞介素2(IL‑2)、CD3单克隆抗体(anti‑CD3)和CD28单克隆抗体(anti‑CD28)，可以使除T细胞外的其他细胞
发生凋亡，只有T细胞存活，可获得纯度较高的T细胞。

[0033] 进一步，FasL‑CAR融合蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。

[0034] 采用上述技术方案，表达FasL‑CAR融合蛋白的T细胞具有较强的肿瘤细胞的杀伤能力，并能够防止肿瘤复发，可以将该FasL‑CAR融合蛋白(或者CAR‑FasL T细胞)应用于治
疗肿瘤的药物中，提供一条治疗癌症的有效途径。

附图说明

[0035] 图1为实施例1制备的T细胞的示意图；

[0036] 图2为实施例1的pLVX‑CAR‑IRES‑ZsGreen1质粒酶切后的电泳图；

[0037] 图3为实施例1的pLVX‑CAR‑FasL‑IRES‑ZsGreen1质粒酶切后的电泳图；

[0038] 图4为实施例1的转染293T细胞24h后的荧光图像；

[0039] 图5为实施例1的转染293T细胞48h后的荧光图像；

[0040] 图6为实施例1的感染T细胞48h后的流式细胞仪检测结果；

[0041] 图7为实施例1的感染T细胞72h后的流式细胞仪检测结果；

[0042] 图8为实验例1的免疫荧光检测结果(使用对比例1中制备的T细胞)；

[0043] 图9为实验例1的免疫荧光检测结果(使用实施例1中制备的T细胞)；

[0044] 图10为实验例2流式细胞仪检测结果(使用实施例2中制备的T细胞)；

[0045] 图11为实验例2流式细胞仪检测结果(使用实施例1中制备的T细胞)。

具体实施方式

[0046] 实施例1：增强FasL/Fas信号途径的嵌合抗原受体T细胞的制备

[0047] 本实施例中制备的T细胞(CAR‑FasL‑T细胞)的结构示意图如图1所示，图中VH和VL分别表示抗体的重链可变区和轻链可变区，胞外抗原结合区包括重链可变区和轻链可变
区，FasL表示FasL蛋白。CAR‑FasL‑T细胞具体构建过程如下：

[0048] (一)：构建表达质粒：

[0049] 原始慢病毒表达载体为pLVX‑IRES‑ZsGreen1(产品编号：632187；宝日医生物技术有限公司)。对pLVX‑IRES‑ZsGreen1进行改造，同时插入CAR基因和FasL基因。CAR基因包括
顺序连接的胞外抗原结合区基因(SEQ ID NO:1)、CD8跨膜区基因(SEQ ID NO:2)、CD28/
41BB共刺激区基因(SEQ ID NO:3)和CD3zeta激活区基因(SEQ ID NO:4)。FasL基因序列见
SEQ ID NO:5。

[0050] 先将CAR基因插入pLVX‑IRES‑ZsGreen1中，获得pLVX‑CAR‑IRES‑ZsGreen1质粒载体。具体的操作方式为：使用EcoR1和Spe1限制性内切酶对合成好的CAR基因进行酶切，再用
EcoR1和Xba1限制性内切酶对pLVX‑IRES‑ZsGreen1进行酶切，然后将CAR基因连在pLVX‑
IRES‑ZsGreen1上。其中，CAR基因后面接了Hpa1酶切位点、His标签和Pac1酶切位点。用
EcoR1和Pac1两个限制性内切酶酶切pLVX‑CAR‑IRES‑ZsGreen1，用以鉴定CAR基因是否连
上，鉴定结果如图2所示，在琼脂糖电泳中，可见1650bp左右的条带(左边泳道为DNA 
ladder，右边泳道为质粒载体酶切后的条带，右边泳道靠近下方的条带为CAR基因)，说明已
构建好pLVX‑CAR‑IRES‑ZsGreen1质粒载体。

[0051] 然后将FasL基因插入pLVX‑CAR‑IRES‑ZsGreen1中，获得pLVX‑CAR‑FasL‑IRES‑ZsGreen1质粒载体。具体的操作方式为：用Hpa1和Pac1两个限制性内切酶对合成好的FasL
基因进行酶切，再用Hpa1和Pac1两个限制性内切酶对pLVX‑CAR‑IRES‑ZsGreen1进行酶切，
然后将FasL基因连接在pLVX‑CAR‑IRES‑ZsGreen1上。其中，FasL后面接了His标签。用Hpa1
和Pac1两个限制性内切酶酶切pLVX‑CAR‑FasL‑IRES‑ZsGreen1，用以鉴定FasL基因是否连
上，鉴定结果如图3所示，在琼脂糖电泳中，可见870bp左右的条带(左边泳道为DNA ladder，
右边泳道为质粒载体酶切后的条带，右边泳道靠近下方的条带为FasL基因)，说明已构建好
pLVX‑CAR‑FasL‑IRES‑ZsGreen1质粒载体。整合在pLVX‑CAR‑FasL‑IRES‑ZsGreen1上的CAR‑
FasL融合基因的完整序列见SEQ ID NO:6。

[0052] (二)：病毒包装：

[0053] 1、293T细胞培养：培养基为DMEM培养基，加10％FBS。当细胞生长至融合率达到80‑90％时，需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。在37℃、
5％CO2和90％相对湿度的细胞培养箱中培养。

[0054] 2、铺板：包病毒前一晚在10cm皿中铺293T细胞，使包病毒时细胞密度达到80‑90％。包病毒前1h，将细胞培养基换成DMEM培养基(1:4000加入氯喹)，放入细胞孵箱中。

[0055] 3、质粒加入：配制病毒质粒和包装质粒(psPAX2和pMD2G两种包装质粒)混合物，组成以及配比如表1所示。

[0056] 表1：病毒质粒和包装质粒混合物

[0057]

[0058] 4、将表1中的混合物与500μL 2×HBS混匀，滴加到293T细胞的培养皿中。

[0059] 5、换液：11h后换成正常培养基，24h后继续换液。

[0060] 6、荧光检测：转染293T细胞24h和48h后检测荧光，检测结果如图4和图5所示，证明转染成功。

[0061] 7、收集病毒：分别于36h、48h和60h时收集三次病毒上清，混匀。

[0062] 8、过滤：用0.45μm的滤膜过滤上清液，以除去细胞杂质等。

[0063] 9、病毒冻存：将分装好的病毒液于‑80℃冰箱中冻存。

[0064] (三)：原代人T细胞分离培养

[0065] 血液在室温采集，在抗凝容器中常温存放(保存时间不要超过4h)、常温分离，勿长时间置于4℃冰箱。分离管(达科为Cat#7121011，15mL/支)于4℃‑30℃避光保存。使用时取
出分离管，每支分离管可分离3mL‑5mL全血。向分离管中倒入血液，20℃条件下800g离心
15min。吸取PBMC(人外周血单核细胞)细胞层，PBMC层在血浆下面。然后1500rpm离心5min，
弃上清，加入1mL裂红液，冰上裂红3‑5min，加3ml RPMI1640培养基中和，然后再1500rpm离
心5min，去细胞。用5mL RPMI1640洗涤一次，进行细胞计数，然后再1500rpm离心5min，取细
胞。配制T淋巴细胞刺激液，成分以及配比见表2。将细胞用配好的刺激液重悬，在六孔板中
培养，2mL/孔。镜下观察细胞密度，每天更换刺激液，连续刺激三天。第四天将培养基换成只
含IL2的培养基。

[0066] 表2：T淋巴细胞刺激液

[0067]组分 储存浓度 工作浓度 货号
淋巴细胞培养基 / 90％ LONZA X‑VIVO 15/04‑418Q
FBS / 10％ Gibco
青链霉素双抗 100× 100U/mL  
IL2(human) 10ug/mL；1000× 10ng/mL Novoprotein
Anti‑CD3(human) 0.5mg/mL；2500× 0.2ug/mL Biolegend/317301
Anti‑CD28(human) 0.5mg/ml；2500× 0.2ug/mL Biolegend/302901

[0068] (四)T细胞病毒感染

[0069] 1、将刺激好的T细胞铺于六孔板中，密度为2‑4×106个/孔，配置病毒感染液，试剂如表3：

[0070] 表3：病毒感染液成分

[0071]

[0072] 2、平板离心：1000g，37℃，90min。

[0073] 3、细胞孵箱中放置8‑10h后，换成正常培养基(培养基中含IL‑2)。

[0074] 4、转染T细胞48h和72h后对细胞进行荧光检测，结果如图6和图7所示，证明转染成功。

[0075] 实施例2：嵌合抗原受体T细胞的制备(无增强FasL/Fas信号途径功能，CAR‑T细胞)

[0076] 本对比例基本同实施例1，不同点在于，表达载体未连接FasL基因，是只带有CAR基因的慢病毒表达载体(pLVX‑CAR‑IRES‑ZsGreen1质粒载体)。

[0077] 对比例1：含空质粒的T细胞的制备

[0078] 本对比例基本同实施例1，不同点在于，表达载体为未连接FasL基因和CAR基因的慢病毒表达载体(pLVX‑IRES‑ZsGreen1质粒载体)。

[0079] 实验例1：细胞免疫荧光检测实验

[0080] 实验方法如下：

[0081] 1、在玻片上用组化笔画圈(内围用不掉色马克笔标记)，然后用少量PBS重悬的细胞滴片，于37℃孵箱干燥，不洗。

[0082] 2、用10倍体积4％的多聚甲醛固定液在常温下固定10min，PBS浸洗10min。

[0083] 3、破膜：用含0.2％Triton X‑100的PBS在常温下对细胞破膜20min，然后用含2％BSA的PBST溶液常温封闭50min，不洗，甩掉多余封闭液直接加一抗。

[0084] 4、His一抗染色：用含有1％BSA的PBST稀释一抗，在湿盒中4℃封闭过夜(不宜超过16h)，然后PBST浸洗15min。

[0085] 5、二抗染色：用含有1％BSA的PBST稀释相应的二抗，常温孵育1h，PBST浸洗15min。注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

[0086] 6、滴加5μDAPI避光孵育5min，对标本进行染核，然后PBS浸洗10min。

[0087] 7、用含抗荧光淬灭剂的封片液封片加盖玻片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

[0088] 检测结果如图8和图9所示，图8是T细胞组(对比例1中制备)，图9是CAR‑FasL‑T细胞组(实施例1中制备)。实验结果显示：CAR基因在CAR‑FasL‑T细胞组中大量表达，在T细胞
组中表达量很低，证明CAR‑FasL‑T细胞构建成功，也证明了FasL可促进T细胞的增殖及CAR
蛋白的表达。

[0089] 实验例2：肿瘤细胞杀伤实验

[0090] 实验方法如下：将Daudi细胞(人Burkitt's淋巴瘤细胞)与T细胞按1:4的比例铺于5
48孔板中，Daudi细胞密度为1×10个/孔，共培养24h。24h后收集细胞，流式检测死细胞比
例。

[0091] 实验结果如图10和图11所示，图10为CAR‑T细胞组(实施例2中制备)，图11为CAR‑FasL‑T细胞组(实施例1中制备)。实验结果显示，CAR‑FasL‑T细胞组对细胞肿瘤细胞的杀伤
能力远大于CAR‑T细胞组，这种增强作用不是单独增强CAR蛋白的表达或者单独增强FasL的
表达所能达到的，说明在CAR‑FasL融合蛋白中，CAR蛋白和FasL蛋白相互影响，将细胞凋亡
信号级联扩大，协同增强了抗肿瘤效果。除此之外，CAR蛋白可将FasL固定于T细胞表面，使
FasL不会释放到细胞外，减少非特异性杀伤作用。且T细胞可通过CAR与肿瘤细胞特定表面
抗原的结合，将FasL/Fas相互作用靶向在肿瘤细胞上，增强抗肿瘤的效果。

[0092] 以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以
作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的
效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的
具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

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