TWS119在促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力中的应用

摘要

本发明公开了TWS119在促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力中的应用。本发明研究发现TWS119能够促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力，能够显著提高凡纳滨对虾在感染副溶血弧菌和白斑综合症病毒情况下的存活率，显著提高凡纳滨对虾的终末体质量、增重率和特定生长率，显著降低凡纳滨对虾的饲料系数，且能够显著提高凡纳滨对虾血清中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶的含量。因此，TWS119在制备促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的注射制剂，作为和/或制备促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的饲料添加剂或饲料中具有广泛的推广应用前景。

权利要求

1.TWS119在制备抑制凡纳滨对虾感染副溶血弧菌的饲料中的应用；所述TWS119在饲料中的添加量为20mg/kg。

2.TWS119在制备促进凡纳滨对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的饲料中的应用；所述TWS119在饲料中的添加量为16mg/kg。

3.TWS119在制备促进凡纳滨对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的注射制剂中的应用；所述TWS119的剂量为5mg/g。

4.根据权利要求2～3任一所述的应用，其特征在于，所述提高非特异性免疫力为提高酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和或酚氧化酶的含量。

说明书

TWS119在促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于饲料技术领域。更具体地，涉及TWS119在促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力中的应用。

背景技术

[0002] 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei），又称南美白对虾，白脚虾，隶属于节肢动物门（Arthropoda），甲壳纲（Crustacea），十足目（Decapoda），对虾科（Penaeidae），对虾属（Penaeus），原产于太平洋沿岸水域秘鲁北部至墨西哥桑诺拉一带。2017年，中国凡纳滨对虾的养殖产量达到167.2万吨，沿海地区如广东、广西、海南和福建等地养殖产量较高，占总产量的56%；因其能适应低盐度条件，内陆地区淡化养殖也颇具规模，养殖产量占凡纳滨对虾养殖总产量的44%。但是，由于对虾产业的迅猛发展，养殖过程中出现了养殖管理水平低、养殖密度过高、病害侵扰、环境污染以及抗生素的滥用等一些问题，导致对虾产业损失惨重。病害是制约对虾产业健康发展的主要瓶颈，对虾的病害是由病原体、宿主和环境共同导致的，造成对虾养殖产业损失的病原体中，60%属于病毒型病原体，20%属于细菌型病原体；其中，病毒型病原体中，以白斑综合症病毒（whitespot syndrome virus, WSSV）危害最大，使得对虾养殖业造成了巨大威胁。

[0003] 在水产养殖过程中，养殖户通常使用抗生素来应对病害的发生。虽然抗生素会起到一定的作用，但不规范和大规模的使用导致细菌对抗生素产生耐药性，从而使多种常规抗生素失效，不仅不利于病害的预防和治疗，甚至造成了环境中抗生素的残留，最终影响高等动物和人类的健康。因此，开发能够代替抗生素、无毒、无污染和高效安全的生物制剂，已成为全球对虾养殖乃至整个水产养殖领域研究的重要目标，对于对虾产业的健康发展具有重大意义。

[0004] 经典Wnt信号通路，又称Wnt/β‑catenin信号通路，主要控制细胞的增殖和分化；其中，β‑catenin是Wnt信号通路传递过程中的核心组件，细胞质内是否有结构稳定的β‑catenin是Wnt信号传导的关键。4，6‑二取代吡咯并嘧啶（TWS119）是一种Wnt/β‑catenin信号通路的激活剂，抑制GSK3β对β‑catenin的磷酸化，从而降低β‑catenin的降解，增加β‑catenin靶基因转录。TWS119能调节细胞的的增殖、分化和凋亡。目前，已有研究表明TWS119能够在一定程度上影响人的γδT细胞、胃癌SGC‑7901细胞、NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞和肾小管上皮细胞，影响鼠的肝癌细胞、小鼠神经干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞、神经元细胞和缺血性中风的大鼠，而未有关于TWS119影响其他物种的生长、非特异性免疫力和抗病力的研究报道。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有水产养殖产业滥用抗生素的的缺陷和不足，提供TWS119在促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力中的应用。

[0006] 本发明的第一个目的是提供TWS119在促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力中的应用。

[0007] 本发明的第二个目的是提供TWS119在制备促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的注射制剂中的应用。

[0008] 本发明的第三个目的是提供TWS119在作为和/或制备促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的饲料添加剂中的应用。

[0009] 本发明的第四个目的是提供TWS119在制备促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的饲料中的应用。

[0010] 本发明的第五个目的是提供一种促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的注射制剂。

[0011] 本发明的第六个目的是提供一种促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的饲料添加剂。

[0012] 本发明的第七个目的是提供一种促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的饲料。

[0013] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0014] 本发明提供的TWS119在注射入凡纳滨对虾体内时，能够显著提高凡纳滨对虾在感染WSSV情况下的存活率；饲养凡纳滨对虾的饲料中添加TWS119后，能够显著提高凡纳滨对虾在感染V. parahemolyticus和WSSV情况下的存活率，显著提高凡纳滨对虾的终末体质量、增重率和特定生长率，显著降低凡纳滨对虾的饲料系数，且能够显著提高凡纳滨对虾血清中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶的含量；说明TWS119能够促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力。

[0015] 因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

[0016] TWS119在促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力中的应用。

[0017] TWS119在制备促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的注射制剂中的应用。

[0018] TWS119在作为和/或制备促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的饲料添加剂中的应用。

[0019] TWS119在制备促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的饲料中的应用。

[0020] 优选地，所述对虾为凡纳滨对虾。

[0021] 另外，本发明还提供了一种促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的注射制剂，所述注射制剂中含有TWS119。

[0022] 本发明还提供了一种促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的饲料添加剂，所述饲料添加剂中含有TWS119。

[0023] 本发明还提供了一种促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的饲料，所述饲料中含有TWS119。

[0024] 优选地，以质量百分比计，所述饲料包括：0.001%～0.002%的TWS119、99.999%～99.998%的基础饲料。

[0025] 更优选地，以质量百分比计，所述饲料包括：0.0016%的TWS119、99.9984%的基础饲料。

[0026] 本发明具有以下有益效果：

[0027] 本发明提供了TWS119在促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力中的应用。本发明研究发现TWS119能够促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力，当TWS119在注射入凡纳滨对虾体内时，能够显著提高凡纳滨对虾在感染WSSV情况下的存活率；当饲养凡纳滨对虾的饲料中添加TWS119后，能够显著提高凡纳滨对虾在感染V. parahemolyticus和WSSV情况下的存活率，显著提高凡纳滨对虾的终末体质量、增重率和特定生长率，显著降低凡纳滨对虾的饲料系数，且能够显著提高凡纳滨对虾血清中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶的含量。

[0028] 因此，TWS119在制备促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的注射制剂，作为和/或制备促进对虾生长、提高非特异性免疫力和抗病力的饲料添加剂或饲料中具有广泛的推广应用前景。

附图说明

[0029] 图1是注射不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾GSK3β基因、β‑catenin基因表达的影响结果图。

[0030] 图2是注射TWS119对凡纳滨对虾抗WSSV免疫的影响结果图。

[0031] 图3是饲料中添加TWS119对凡纳滨对虾抗病力的影响结果图。

[0032] 图4是饲料中添加TWS119对凡纳滨对虾血清非特异性免疫酶活的影响结果图。

[0033] 图5是饲料中添加不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾抗病力的影响结果图。

[0034] 图6是饲料中添加不同浓度的TWS119凡纳滨对虾血清非特异性免疫酶活的影响结果图。

具体实施方式

[0035] 以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0036] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0037] 实施例1 注射TWS119对凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗病力的影响

[0038] 本实施例分别在凡纳滨对虾体内注射三种不同浓度的TWS119，检测不同时间内Wnt/β‑catenin信号通路关键基因GSK3β基因、β‑catenin基因的表达，依此判断TWS119对Wnt/β‑catenin信号通路活性的变化，确定有效的TWS119注射浓度及最佳时间点并进行攻毒实验，检测Wnt/β‑catenin信号通路活性的改变对凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗病力的影响。具体的实验方法和实验结果分别如下：

[0039] 1、材料、试剂与仪器

[0040] 健康的凡纳滨对虾（8～10 g）购于广东海洋大学海洋生物实习基地，并在广东海洋大学海洋生物实习基地进行实验，先在300 L的玻璃钢桶中暂养一周，期间投喂商品饲料。

[0041] TWS‑119：采购于MedChemExpress（中国）公司；RNAlater：购自德国Qiagen公司；通用RNA提取试剂盒：购自广东东盛生物科技有限公司；反转录试剂PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser，荧光定量试剂TB Green™ Premix Ex Taq  ™ II：均购自与日本Takara公司；其它化学试剂均为国产分析纯，购自湛江市科创实验室设备有限公司。

[0042] T100型梯度PCR仪，凝胶成像系统Gel Doc：均购自美国Bio‑rad公司；DYY‑7C型电泳仪：购自北京市六一仪器厂；离心机D37520Osterode am Harz：购自于德国Sigma公司；TGL‑20M台式高速冷冻离心机：购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；LightCycler480荧光定量 PCR 仪：购自瑞士 Roche 公司；Nano Drop 2000核酸测定仪：购自美国Thermo Fisher 公司。

[0043] 2、实验方法

[0044] （1）实验试剂的制备

[0045] 白斑综合症病毒（WSSV）粗提液：取0.1 g WSSV感染致死的病虾肌肉（由本实验室保存），加入1 mL的PBS缓冲液，在玻璃匀浆器中冰上研磨，随后离心取上清液（5000×g，4℃6
离心10 min），用 0.45 μm滤膜滤过上清，获得WSSV粗提液，用 PBS稀释至注射浓度为10 拷贝/g，4℃保存待用。

[0046] TWS119注射液：实验前，采用逐级扩大的方法，用蒸馏水将TWS119粉末稀释至浓度为0.5 μg/g、5 μg/g、50 μg/g的TWS119注射液，放在冰上备用。

[0047] PBS缓冲液制备：PBS粉末溶解于1 L的蒸馏水中，高温灭菌后，放于4℃冰箱待用。

[0048] ACD抗凝剂：0.48 g柠檬酸、1.37 g柠檬酸钠和1.48 g葡萄糖用纯水溶解后，定容到100 mL，高压灭菌后，分装在灭菌后的离心管中，4℃保存。

[0049] （2）供试样本的采集和处理

[0050] 将180尾凡纳滨对虾随机分为6组，每组30尾，分别注射浓度为0.5 μg/g、5 μg/g和50 μg/g 的TWS119注射液，每尾凡纳滨对虾注射50 μL。注射结束0、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h后，取凡纳滨对虾的血液样本，具体步骤如下：用已含有0.2mL ACD抗凝剂的1 mL无菌注射器，抽取凡纳滨对虾的血液样本，3尾凡纳滨对虾的血液混为1管，放置于2 mL无RNA酶离心管中，3000×g离心5 min，倒掉上清液，并加入1 mL RNAlatter，吹打待凡纳滨对虾血细胞悬浮，4℃静置一夜，然后转移到‑80℃冰箱中保存待用，用于提取凡纳滨对虾血细胞的RNA及检测基因的表达量。

[0051] （3）RNA提取和qPCR实验

[0052] 实验结束后，使用通用RNA提取试剂盒提取凡纳滨对虾血细胞RNA，并将得到的RNA进行反转录，得到cDNA；利用Primer 5.0软件设计qPCR实验所用引物，由英潍捷基贸易有限®公司（上海）代为合成引物，qPCR实验所用引物及其序列如表1所示；qPCR实验使用SYBRPremix Ex Taq™ II(Tli RNaseH Plus)试剂盒，内参基因选择延伸因子1α（elongation ‑△△Ct
factor 1α, EF1α, GenBank 序列号No. GU136229）基因，每个基因设三个重复，采用2方法对qPCR实验数据进行分析，计算GSK3β基因、β‑catenin基因的表达量。

[0053] 表1 qPCR实验所用引物及其序列

[0054] 引物 序列(5’‑3’)EF1α‑F TGCACCACGAAGCCCTTAC
EF1α‑R CAGGGTGGTTGAGGACGATC
β‑catenin‑F CTGGAGAGAGGGAGGAGATTAC
β‑catenin‑R TCTTTAGGCGGACAGCATTC
GSK3β‑F GTACATCTGCTCCCGCTATTAT
GSK3β‑R ACACATCCTGCACTCCATAC

[0055] qPCR反应体系如下：

[0056] TB Green PremixEx Taq II  5 μL

[0057] 上游引物                0.4 μL

[0058] 下游引物                0.4 μL

[0059] cDNA模板 5μL

[0060] 灭菌水                  3.2 μL

[0061] 总体积                  10 μL

[0062] qPCR反应程序为：95℃，30s，1个循环；95℃，5s，60℃，30s，40个循环；95℃，5s，60℃，1分钟，95℃，1个循环；50℃，30s，1个循环。

[0063] （4）攻毒实验

[0064] 根据GSK3β基因、β‑catenin基因表达的结果，确定TWS119的最适注射浓度及作用时间后进行攻毒实验。将凡纳滨对虾分为2组，每组30尾；每尾凡纳滨对虾分别注射50 μL PBS缓冲液（空白对照组）和TWS119注射液 (5 μg/g),注射8 h后，用制备好的WSSV粗提液感染凡纳滨对虾，每隔4 h记录死亡数量，计算存活率；组间的存活率差异采用log‑rankKaplan‑Meier 生存分析进行比较。

[0065] 3、实验结果

[0066] （1）注射不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾GSK3β基因、β‑catenin基因表达的影响结果

[0067] 注射不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾GSK3β基因、β‑catenin基因表达的影响结果如图1所示，总体而言，GSK3β基因、β‑catenin基因表达量均随着TWS119浓度的增大而增大；注射不同浓度的TWS119后0～8h，血细胞中GSK3β的表达量明显降低；注射8h后，除0.5μg/g组中GSK3β表达量下降外，其他注射浓度组中均不同程度上升；相对应地，注射不同浓度的TWS119后，β‑catenin表达量在注射后0～8h上升；不同的是，注射5μg/g和50μg/gTWS119组β‑catenin表达量在8h后呈先上升后下降趋势，而0.5μg/g组8 h后β‑catenin表达量持续下降；可以看出，在0.5 μg/g TWS119注射组、5 μg/g TWS119注射组和50 μg/g TWS119注射组中，在注射8h 后GSK3β基因的表达量均较0h显著下降，而β‑catenin基因的表达量均较0h显著上升。

[0068] 综合考虑GSK3β基因和β‑catenin基因的表达量变化情况，选择中等抑制程度即5 μg/g的剂量作为攻毒实验的注射浓度，选择注射TWS119后8h 为攻毒时间点。

[0069] （2）注射TWS119对凡纳滨对虾抗WSSV免疫的影响结果

[0070] 注射TWS119对凡纳滨对虾抗WSSV免疫的影响结果如图2所示，可以看出，注射TWS119组凡纳滨对虾的存活率显著高于空白对照组（P＜0.05）。以上结果说明：注射TWS119能够显著提高凡纳滨对虾在感染WSSV情况下的存活率。

[0071] 实施例2 饲料中添加TWS119对凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗病力的影响

[0072] 实施例1的实验结果表明对凡纳滨对虾注射TWS119能调节Wnt/β‑catenin信号通路的活性和抗病性，那么这个结果是否能产生应用价值呢？进一步地，本实施例研究在饲料中添加TWS119对凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗病力的影响，具体的实验方法和实验结果分别如下：

[0073] 1、材料、试剂与仪器

[0074] 凡纳滨对虾虾苗采购自广东省湛江市东海岛虾苗场，在广东海洋大学海洋生物实习基地养殖，先在水泥池暂养一个月，期间投喂商品饲料。暂养结束后，随机选取规格一致、健康的凡纳滨对虾（0.38±0.02）g，于300 L的玻璃钢桶中养殖。

[0075] 胰蛋白酶（trypsin，TRS）、淀粉酶（amylase，AMS）、脂肪酶（lipase，LPS）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、酚氧化酶（Phenoloxidase，PO）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的检测试剂盒均购置于采用南京建成生物工程研究所。

[0076] F750双螺杆挤条机：购自华南理工大学；B20‑HV型立式混合机：购自浙江正泰电器股份有限公司；搅拌机：购自恒联食品机械厂B20‑H；SF‑320型全不锈钢高速万能粉碎机：购自中国泰州市双峰机械有限公司；组织匀浆器：购自艾卡（广州）仪器设备有限公司；全波长酶标仪：购自美国ThermoFisher 公司。

[0077] 2、实验方法

[0078] （1）实验饲料的制备

[0079] 本实验设置3个处理，配置3种等氮等脂饲料，基础饲料组为对照组，基础饲料中添加20 mg/kg 的TWS119为实验组，以红鱼粉、豆粕、虾壳粉、花生粕、玉米蛋白粉作为蛋白源，鱼油、玉米油、大豆磷脂油作为脂肪源，基础饲料的配方及营养组成如表2所示。

[0080] 准确称取饲料的各种原料，将原料粉碎后过80目筛，对于微量的原料和添加剂采用逐级扩大的形式添加，用V型立式混合机将各种原料充分混合，将鱼油、玉米油和大豆磷脂提前混匀后加在混好的饲料中，用手搓匀至无油脂粒，过60目筛，加水在搅拌机中混匀，用双螺杆挤条机加工成1.0mm和1.5粒径的颗粒料，室内晾干后，分装保存在‑20℃冰箱中待用。

[0081] 表2 基础饲料的配方及营养组成

[0082]

[0083] （2）养殖管理

[0084] 本实验设3个处理，每个处理3个重复，每个重复40尾凡纳滨对虾。每天分别在7：00、11：00、17：00、21：00进行定量投喂实验饲料，投喂量按凡纳滨对虾体重的8%～10%计算，投喂1 h后观察凡纳滨对虾的摄食程度，养殖时间为8周；实验期间海水温度28℃～30℃，盐度为 26.5～28.0，按照自然光照，连续充氧，溶解氧＞6.8mg/L，pH值为7.8～8.2，氨氮含量低于0.03 mg/L，记录养殖过程中的凡纳滨对虾的反常现象。

[0085] （3）病原制备及攻毒实验

[0086] 养殖实验结束后，每个处理组选择60尾凡纳滨对虾进行攻毒实验，分别注射PBS缓冲液（空白对照组）、V.parahemolyticus注射液和WSSV粗提液，具体的实验方法如下：

[0087] PBS缓冲液：PBS粉末溶解于1 L的蒸馏水中，高温灭菌后，放于4℃冰箱待用。

[0088] 副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）注射液：将保存好的菌种加入到1 mL LB培养基中，放置于恒温培养箱中，37℃下200 rpm培养16 h；将所得菌液加入到装有100 mL LB培养基的250 mL锥形瓶中，放置于恒温培养箱中，37℃下调节转速为200 rpm培养6 h；然后，将所得菌液离心，4000×g离心10 min，用PBS缓冲液重悬离心两次，离心条件同上，1mLPBS缓冲液重悬作为弧菌母液，取1 μL稀释10000倍，吸取100 μL涂板，计算菌液浓度，使得V.parahemolyticus注射液的感染组注射浓度为5.5×106cfu/g。

[0089] WSSV粗提液：取0.1 g WSSV感染致死的病虾肌肉（由本实验室保存），加入1 mL的PBS缓冲液，在玻璃匀浆器中冰上研磨，随后离心取上清液（5000×g，4℃离心10 min），用 6
0.45 μm滤膜滤过上清，获得WSSV粗提液，用 PBS稀释至注射浓度为10 拷贝/g，4℃保存待用。

[0090] 将50 μL PBS缓冲液、V. parahemolyticus注射液和WSSV粗提液分别于凡纳滨对虾倒数第三个体节处注射，连续观察7天，每隔4 h统计一次凡纳滨对虾死亡个体数，用于计算存活率。

[0091] （4）供试样本的采集

[0092] 攻毒实验结束后，禁食24 h，称重，记录凡纳滨对虾存活尾数，计算存活率；用无菌注射器抽取3～4尾凡纳滨对虾的血液，4℃保存，静置一夜后，3000 r/min离心10 min，以制备血清；从每个重复中选取3～4尾凡纳滨对虾，先用1 mL无菌注射器吸取0.2 mL ACD抗凝剂，抽取凡纳滨对虾的血液，并将血液放置在2 mL无酶管中，准备2管，3000 g离心5分钟，倒掉上清液，并加入1 mL RNAlatter，4℃静置一夜，转移到‑80℃冰箱中保存待用，测定凡纳滨对虾血清非特异性免疫指标（包括酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、酚氧化酶和丙二醛）。

[0093] （5）数据统计分析

[0094] 采用SPSS 20.0统计软件对所得数据进行单因素方差分析（one‑way ANOVA）软件进行分析，如有显著性差异（P＜0.05）时，则用Duncan氏多重分析来比较；实验数据用“平均值±标准差”（mean±SD）表示；组间的存活率差异采用log‑rankKaplan‑Meier生存分析进行比较。

[0095] 3、实验结果

[0096] （1）饲料中添加TWS119对凡纳滨对虾抗病力的影响结果

[0097] 饲料中添加TWS119对凡纳滨对虾抗病力的影响结果如图3所示，其中，饲料中添加TWS119对凡纳滨对虾抗V.parahemolyticus免疫的影响结果如图（A）所示，可以看出，凡纳滨对虾感染V.parahemolyticus后，饲料中添加TWS119组凡纳滨对虾的存活率极显著高于空白对照组（P＜0.01）；饲料中添加TWS119对凡纳滨对虾抗WSSV免疫的影响结果如图（B）所示，可以看出，凡纳滨对虾感染WSSV后，饲料中添加TWS119组凡纳滨对虾的存活率极显著高于空白对照组（P＜0.01）。以上结果说明：饲料中添加TWS119能够显著提高凡纳滨对虾的抗病力。

[0098] （2）饲料中添加TWS119对凡纳滨对虾血清非特异性免疫指标的影响

[0099] 饲料中添加TWS119对凡纳滨对虾血清非特异性免疫指标的影响结果如图4所示，可以看出，与空白对照组相比，饲料中添加TWS119使得凡纳滨对虾血清中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和酚氧化酶的含量均提高，其中，酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶含量较对照组显著提高（P＜0.05）；饲料中添加TWS119使得丙二醛的含量也稍微升高，说明凡纳滨对虾可能处于一定的氧化应激状态，但与空白对照组差异不显著；表明饲料中添加TWS119对凡纳滨对虾未造成负面影响。以上结果表明：饲料中添加TWS119能够显著提高凡纳滨对虾的非特异性免疫力。

[0100] 实施例3 饲料中添加不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾生长性能、非特异性免疫力和抗病力的影响

[0101] 基于实施例1和2的实验结果，本实施例在饲料中添加不同浓度的TWS119并分析其对凡纳滨对虾生长性能、非特异性免疫力和抗病力的影响，以确定饲料中TWS119的适宜添加量，具体的实验方法和实验结果分别如下：

[0102] 1、材料、试剂与仪器

[0103] 凡纳滨对虾虾苗购自广东海兴农集团有限公司，挑选规格一致的健康的凡纳滨对虾，初始体重为0.27±0.02g，实验共设置6个处理，每个处理3个重复，每个重复饲养40尾凡纳滨对虾，养殖实验在广东省湛江市东海岛海洋生物研究基地的室内养殖系统‑300L的玻璃钢桶中进行。

[0104] 试剂与仪器均和实施例2相同。

[0105] 2、实验方法

[0106] 本实施例设置6个处理，基础饲料组为对照组（T0），基础饲料中分别添加浓度分别为0.25 mg/kg、1 mg/kg、4 mg/kg、16 mg/kg、64 mg/kg的TWS119（分别记为T0.25、T1、T4、T16、T64），配置6种等氮等脂饲料，基础饲料的配方及营养组成同表2所示，制备得到不同浓度的实验饲料，分别处理凡纳滨对虾。具体的凡纳滨对虾生长性能、抗病力和血清非特异性免疫指标的测定方法均与实施例2相同。

[0107] 攻毒实验结束后，禁食24 h，称重，记录凡纳滨对虾存活尾数，计算存活率、增重率、特定生长率和饲料系数；计算公式分别如下：

[0108] 存活率（survival rate, SR, %）=Nt/N0×100；

[0109] 增重率（weight gain rate, WGR, %）=(Wt–W0)/W0×100；

[0110] 特定生长率（special growth rate, SGR, %/d）=(lnWt–ln W0)/t×100；

[0111] 饲料系数（feed coefficient rate, FCR）=F/(Wt–W0)；

[0112] 式中，Nt、N0分别为终末尾数、初始尾数，Wt、W0分别为终末总重、初始总重，t为养殖时间，F为饲料摄入量。

[0113] 采用SPSS 20.0统计软件对所得数据进行单因素方差分析（one‑way ANOVA）软件进行分析，如有显著性差异（P＜0.05）时，则用Duncan氏多重分析来比较；实验数据用“平均值±标准差”（mean±SD）表示；组间的存活率差异采用log‑rankKaplan‑Meier生存分析进行比较。

[0114] 3、实验结果

[0115] （1）饲料中添加不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾生长性能的影响结果

[0116] 饲料中添加不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾生长性能的影响结果如表5所示，可以看出，与空白对照组相比，饲料中添加不同浓度的TWS119，使得凡纳滨对虾的存活率均有不同程度的提高，但差异均不显著，其中，T1组凡纳滨对虾的存活率最高（90.83%），T16组凡纳滨对虾的存活率为85.83%；T16组凡纳滨对虾的终末体质量、增重率和特定生长率均显著升高（P＜0.05）；T16组凡纳滨对虾的饲料系数显著降低（P＜0.05）；其余各组的终末体质量、存活率、增重率、特定生长率和饲料系数与空白对照组均无显著差异。以上结果说明：饲料中添加浓度为16 mg/kg的TWS119能够显著提高凡纳滨对虾的生长性能。

[0117] 表5 饲料中添加不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾生长性能的影响结果

[0118] 项目 T0 T0.25 T1 T4 T16 T64IBW (g/尾) 0.27±0.01 0.27±0.02 0.27±0.02 0.27±0.02 0.27±0.02 0.27±0.01
FBW (g/尾）10.26±0.00a 10.25±0.31a 10.22±0.09a 10.27±0.04a 10.84±0.32b 9.86±0.24aSR(%) 82.50±11.46 84.17±7.64 90.83±7.64 85.83±2.89 85.83±6.29 88.33±1.44
WGR (%) 3701.54±0.86a 3695.33±115.42a 3685.42±32.04a 3702.08±16.42a 3916.58±118.96b 3552.91±88.29aSGR (%/d) 6.50±0.00a 6.49±0.05a 6.49±0.02a 6.50±0.01a 6.59±0.05b 6.42±0.04a
FCR 1.14±0.01b 1.16±0.03b 1.14±0.01b 1.15±0.01b 1.07±0.03a 1.19±0.03b

[0119] 注：表中数据用平均值±标准差表示，同一行肩标不同表示差异显著（P＜0.05）。

[0120] （2）饲料中添加不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾抗病力的影响结果

[0121] 饲料中添加不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾抗病力的影响结果如图5所示，其中，饲料中添加不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾抗V.parahemolyticus免疫的影响结果如图（A）所示，可以看出，凡纳滨对虾感染V. parahemolyticus后，T0.25组、T1组、T4组、T16组凡纳滨对虾的存活率均极显著高于空白对照组（P＜0.01），T64组凡纳滨对虾的存活率与空白对照组无显著差异；其中，T4组凡纳滨对虾的存活率最高，其次分别为T0.25组、T1组、T16组、T64组。饲料中添加不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾抗WSSV免疫的影响结果如图（B）所示，可以看出，凡纳滨对虾感染WSSV后，T1组凡纳滨对虾的存活率最高，且显著高于空白对照组（P＜0.05），其余各组凡纳滨对虾的存活率与空白对照组均无显著差异。

[0122] （3）饲料中添加不同浓度的TWS119凡纳滨对虾血清非特异性免疫指标的影响

[0123] 饲料中添加不同浓度的TWS119凡纳滨对虾血清非特异性免疫酶活的影响结果如图6所示，可以看出，随着TWS119添加量的升高，T0组、T0.25组、T1组、T4组、T16组、T64组凡纳滨对虾血清中酸性磷酸化酶和过氧化氢酶的含量逐渐上升，且除了T0.25组与T0组无显著差异外，T1组、T4组、T16组、T64组凡纳滨对虾血清中酸性磷酸化酶和过氧化氢酶的含量均显著高于T0组（P＜0.05）；与T0组相比，T0.25组、T1组、T4组、T16组、T64组凡纳滨对虾血清中碱性磷酸酶的含量均升高，其中，T1组、T16组、T64组凡纳滨对虾血清中碱性磷酸酶的含量均显著升高（P＜0.05）；随着TWS119添加量的升高，凡纳滨对虾血清中超氧化物歧化酶和酚氧化酶的含量呈现先升高再降低的趋势，与T0组相比，T0.25组、T1组、T4组、T16组、T64组凡纳滨对虾血清中超氧化物歧化酶和酚氧化酶的含量均升高；其中，T1组、T4组凡纳滨对虾血清中超氧化物歧化酶的含量均显著高于T0组（P＜0.05），T0.25组、T1组、T4组凡纳滨对虾血清中酚氧化酶的含量均显著高于T0组（P＜0.05）；另外，与T0组相比，T0.25组、T1组、T4组、T16组、T64组凡纳滨对虾血清中丙二醛的含量均降低，其中，T4组、T64组凡纳滨对虾血清中丙二醛的含量均显著低于T0组（P＜0.05），说明饲料中添加不同浓度的TWS119对凡纳滨对虾未造成负面影响。

[0124] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。