一种复合菌剂及其应用

摘要

本发明公开了一种复合菌剂及其应用，所述复合菌剂含有粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens strain)TF‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2019674，具有耐高氨氮、耐高浓度氯代有机物、耐低温、耐重金属、具有同步硝化反硝化功能的特性，通过微生物协同作用，可在高浓度氯代有机物废水中实现高效脱氮。

权利要求

1.一种复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂含有粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens strain）TF-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 

2019674。

2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂还含有贪铜菌（Cupriavidus  sp.）SWA1，粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis），不动杆菌（Acinetobacter）和苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）TAC-2。

3.根据权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂的粘质沙雷氏菌TF-1、贪铜菌SWA1、粪产碱杆菌、不动杆菌、苍白杆菌TAC-2的体积比分别5 10%：10 20%：5 20%：10~ ~ ~

30%：20 50%。

~ ~

4.权利要求2 3任一项所述复合菌剂在制备氨氮去除剂中的应用。

~

5.权利要求2 3任一项所述复合菌剂在脱氨中的应用。

~

6.权利要求1 3任一项所述复合菌剂在制备氯代芳烃去除剂中的应用。

~

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述氯代芳烃为氯苯。

8.权利要求2 3任一项所述复合菌剂在去除垃圾渗滤液氨氮中的应用。

~

9.权利要求1 3任一项所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将菌株~分别用浓度大于60 mg/L的有机氯驯化，再在有机氯浓度大于60 mg/L条件下，用浓度为200

600mg/L的氨氮梯度驯化，收集菌株分别进行扩大培养，然后用含有机氯的异养硝化培养~基扩大培养，最后将菌株混合，富集培养至OD600 =0.7±0.1，即得复合菌剂。

10.根据权利要求9所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述异养硝化培养基各组分如下：异养硝化培养基：（NH4）2SO4 2.0 g/L，Na3C6H5O7 10.64 g/L；维氏盐溶液 50 mL/L，所述维氏盐溶液各组分浓度如下：K2HPO4 5.0 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，pH=7.0。

说明书

一种复合菌剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，特别涉及复合菌剂在含有机氯废水处理中的应用。

背景技术

[0002] 近年来，化工废水、垃圾渗滤液等含高浓度有机氯(浓度＞60μg/L)的高氨氮废水(氨氮浓度＞200mg/L)的排放量日益增多。而含有有机氯的高氨氮废水，处理不当直接排入水体，首先会导致水体富营养化等现象日趋严重，造成水体质量恶化。而高浓度有机氯因其化学性质稳定，很难降解，而且毒性大，甚至是致癌，一旦将它排放到环境当中，就会对水体和土壤造成不同程度的污染。

[0003] 首先去除高氨氮废水中氨氮的物化方法(如吹脱法、蒸氨塔蒸馏法，折点加氯法和FENTON氧化法等)只是在特殊的化工行业有应用，传统生物脱氮技术主要包括A/O工艺，短程硝化反硝化工艺，硝化+厌氧氨氧化等工艺。这些生物脱氮技术都是利用了自养硝化菌的特性，达到去除氨氮的目的。生物法以其无污染、经济和安全等优点被认为是目前最经济有效的水体净化方法。然而，高浓度的有机氯会造成微生物细胞渗透压快速改变，而且高浓度有机氯对微生物具有很强的毒害作用，导致菌体细胞破裂或抑制细菌生长，使生物处理系统受到破坏，因此高浓度有机氯废水的生物处理是国内外研究的热点和难点。而高浓度氨氮废水中含有的大量游离氨对自养型的硝化细菌具有极强的抑制作用，导致自养硝化菌氨氧化过程受到抑制，影响氨氮处理效率，导致这些生物方法在处理高氨氮废水时处理效果不佳；此外，自养硝化菌最适生长温度范围为25～35℃，当温度较低时，自养硝化菌停止生长，严重影响硝化反应。诸上原因造成含有机氯的高氨氮废水处理质量差、处理效率低、处理成本高等问题。

[0004] 近年来，研究者发现了特殊的异养硝化-好氧反硝化脱氮细菌，这类细菌具有同步硝化和反硝化的特性，在好氧条件下可在一个反应器中实现氨氮和总氮同步脱除，解决了硝化和反硝化过程的矛盾。还有一些有机氯高效降解菌，能实现有机氯的高效去除，而将这两类菌按比例混合后可以有效的降解含有这两种污染物的废水，这为此类废水的净化带来了新的途径。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种可用于处理含有机氯高的氨氮废水的复合菌剂。复合菌剂具有耐高氨氮、耐高浓度氯代有机物、具有同步硝化反硝化功能的特性、具有有机氯降解特性，通过五种微生物协同作用，可在高浓度有机氯条件下的好氧环境中实现高氨氮废水高效脱氮。

[0006] 本发明所述的总氮(TN)，是指氨氮(NH4+-N\NH3-N)、硝态氮(NO3-)、亚硝态氮(NO2-)的总和。所述有机氯主要指氯代芳烃、氯代脂肪烃。

[0007] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0008] 本发明的目的之一在于提供一种复合菌剂，所述复合菌剂含有粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens strain)TF-1，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2019674。

[0009] 作为本发明优选的方案，所述复合菌剂还含有贪铜菌SWA1(Cupriavidus sp.SWA1)，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，不动杆菌(Acinetobacter)和苍白杆菌TAC-2(Ochrobactrum sp.TAC-2)。

[0010] 作为本发明更有选的方案，所述复合菌剂的粘质沙雷氏菌TF-1、贪铜菌SWA1、粪产碱杆菌、不动杆菌、苍白杆菌TAC-2的体积比分别5～10％：10～20％：5～20％：10～30％：20～50％。本发明所述的可降解氯代芳烃的沙雷氏菌TF-1Serratia marcescens TF-1(CCTCC NO：M 2019674)，属于粘质沙雷氏菌属。菌落直径0.5～0.8μm，长0.9～2.0μm，端圆，兼性厌氧，多数不透明，有些虹彩；白色、粉红或红色；革兰氏染色阴性，最佳生长温度为25～40℃，pH为6.5～7.5。

[0011] 本发明所述的贪铜菌SWA1Cupriavidus sp.(CCTCC NO：M 2015045)，属于贪铜菌属，菌落直径1mm左右，半透明，突起，边缘整齐，表面有光泽，颜色呈白色透明；革兰氏染色阴性。最佳生长温度为25～40℃，pH为6.5～7.5。

[0012] 本发明所述的粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis(CICC 22642)，属于粪产碱杆菌属。直径为0.5～1.0μm，长度为0.5～2.6μm，通常为单一菌体排列，不产生孢子，革兰氏染色阴性，最适宜生长温度为20-37℃，属嗜中温菌，最适宜的pH值约为7。

[0013] 本发明所述的不动杆菌Acinetobacter(CICC 10695)，属于不动杆菌属，革兰氏染色阴性，菌体大小为1.5～2.5μm，粘液性型菌株有荚膜，无芽孢，无鞭毛，不能运动；专性需氧，最佳生长温度为28℃。

[0014] 本发明所述的苍白杆菌Ochrobactrum sp.TAC-2(CCTCC M 2018028)，属于苍白杆菌属，菌落直径1mm左右，半透明，突起，边缘整齐，表面有光泽，颜色呈白色透明；革兰氏染色阴性；最佳生长温度为25～40℃，pH为6.5～7.5。

[0015] 本发明复合菌剂中的粘质沙雷氏菌TF-1的保藏号为CCTCC NO：M 2019674(已于2019年8月保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，分类命名为：Serratia marcescens strain TF-1，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

[0016] 本发明复合菌剂中的贪铜菌Cupriavidus sp.公开于公开号为CN104830725A的中国专利。

[0017] 复合菌剂中的粪产碱杆菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(编号CICC 22642)。

[0018] 复合菌剂中的不动杆菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(编号CICC 10695)。

[0019] 复合菌剂中的苍白杆菌TAC-2的保藏号为CCTCC M 2018028(已于2018年1月保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，分类命名为Ochrobactrum sp.TAC-2，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.2所述。

[0020] 本发明的目的之二在于提供所述复合菌剂的应用，具体是：

[0021] 所述复合菌剂在制备氨氮去除剂中的应用，尤其是在高浓度有机氯下去除氨氮。

[0022] 所述复合菌剂在脱氨中的应用，尤其是在高有机氯条件下的脱氮。

[0023] 所述复合菌剂在制备氯代芳烃去除剂中的应用，优选的，所述氯代芳烃为氯苯。

[0024] 所述复合菌剂在去除垃圾渗滤液氨氮中的应用。

[0025] 本发明的目的之三在于提供所述复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：将菌株分别用浓度大于60mg/L的有机氯驯化，再在有机氯浓度大于60mg/L条件下，用浓度为200～600mg/L的氨氮梯度驯化，收集菌株分别进行扩大培养，然后用含有机氯的异养硝化培养基扩大培养，最后将菌株混合，富集培养至OD600＝0.7±0.1，即得复合菌剂。

[0026] 优选的，所述异养硝化培养基各组分如下：异养硝化培养基：(NH4)2SO4 2.0g/L，Na3C6H5O7 10.64g/L；维氏盐溶液50mL/L，所述维氏盐溶液各组分浓度如下：K2HPO4 5.0g/L，MgSO4·7H2O 2.5g/L，NaCl 2.5g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，MnSO4·4H2O 0.05g/L，pH＝7.0。

[0027] 本发明的有益效果在于：

[0028] (1)本发明提供的复合菌剂在高浓度有机氯(浓度≥200mg/L)依然可以快速生长，并长时间保持高活性，实现在高有机氯条件下的高效脱氮；

[0029] (2)本发明提供的复合菌剂在高浓度有机氯(浓度≥200mg/L)下对高氨氮、高浓度有机氯废水具有较强的耐受能力，能够在高氨氮、高浓度有机氯条件下的好氧环境中实现同步硝化反硝化脱氮和降解有机氯的过程，有效去除高氨氮废水、高浓度有机氯废水中的总氮，尤其适用于去除高氨氮、高浓度有机氯废水中的氨氮，实现在高浓度有机氯下高效去除高浓度氨氮(浓度＞200mg/L)的目的；

[0030] (3)本发明提供的复合菌剂使用方便、用量少，可直接投入水体中形成优势菌种高效去除水体中的总氮、氨氮及有机氯，具有处理效率高、处理成本低的优势。

[0031] 采用本发明复合菌剂能够有效解决有机氯(浓度≥200mg/L)和高氨氮环境下，传统生物脱氮处理中氨氮废水处理效果差、处理效率低以及处理成本高等问题。

附图说明

[0032] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

[0033] 图1为复合菌剂在氨氮浓度为800mg/L时，对氨氮和总氮的去除曲线图；

[0034] 图2为复合菌剂在氯代芳烃(氯苯)浓度为200mg/L时，对氨氮的去除曲线图；

[0035] 图3为复合菌剂在不同氯代芳烃(氯苯)浓度下生长曲线图。

[0036] 图4为复合菌剂对垃圾渗滤液中氨氮去除曲线图。

[0037] 菌种保藏

[0038] 本发明中粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens strain)TF-1是从重庆大渡口区原重庆钢铁股份公司动力厂五万立方煤气柜周边污染土壤中分离得到的菌株，送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2019674，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2019年8月29日，分类命名为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens strain)TF-1。

具体实施方式

[0039] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0040] 本发明使用的培养基如下：

[0041] 异养硝化培养基：(NH4)2SO4 2.0g/L，Na3C6H5O7 10.64g/L，维氏盐溶液50mL/L，其中维氏盐溶液各组分浓度如下：K2HPO4 5.0g/L，MgSO4·7H2O 2.5g/L，NaCl 2.5g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，MnSO4·4H2O 0.05g/L，pH＝7.0。

[0042] 无机盐-氯苯培养基组成如下：CaCl2 0.1g/L；MgSO4·7H2O 0.2g/L；NH4SO4 2.5g/L；KH2PO4 4.5g/L，NaCl 0.2g/L。

[0043] 其余试剂为市售分析纯产品。

[0044] 本发明实施例中使用的检测方法如下：菌液的OD值采用UV2000分光光度计检测，波长为600nm。各污染物的监测分析方法参考《水和废水监测分析方法》(第四版，中国环境科学出版社，2002)。

[0045] 实施例1、菌种的驯化

[0046] 沙雷氏菌Serratia marcescens TF-1(CCTCC NO：M 2019674)高有机氯、高氨氮耐受性驯化：取2mL菌液接种于装有50mL灭菌后的含有氯代有机物(浓度为200mg/L，氯苯)异-1养硝化培养基的100mL血清瓶中，充分摇匀，5℃、150r·min 条件下放入摇床中培养2d。在上述相同条件下连续传代培养，共传代5次，分别对应氨氮浓度为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L。

[0047] 贪铜菌SWA1Cupriavidus sp(CCTCC NO：M 2015045)高有机氯高氨氮耐受性驯化：取2mL菌液接种于装有50mL灭菌后的含有氯代有机物(浓度为200mg/L，氯苯)异养硝化培养基的100mL血清瓶中，充分摇匀，5℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养2d。在上述相同条件下连续传代培养，共传代5次，分别对应氨氮浓度为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、
600mg/L。

[0048] 粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis(CICC 22642)高有机氯高氨氮耐受性驯化：取2mL菌液接种于装有50mL灭菌后的含有氯代有机物(浓度为200mg/L，氯苯)异养硝化培养基的100mL血清瓶中，充分摇匀，5℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养2d，在上述相同条件下连续传代培养，共传代5次，分别对应氨氮浓度为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、
600mg/L。

[0049] 不动杆菌Acinetobacter(CICC 10695)高有机氯高氨氮耐受性驯化：取2mL菌液接种于装有50mL灭菌后的含有氯代有机物(浓度为200mg/L，氯苯)异养硝化培养基的100mL血清瓶中，充分摇匀，5℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养2d。在上述相同条件下连续传代培养，共传代5次，分别对应氨氮浓度为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L。

[0050] 苍白杆菌Ochrobactrum sp.TAC-2(CCTCC M 2018028)高有机氯高氨氮耐受性驯化：取2mL菌液接种于装有50mL灭菌后的含有氯代有机物(浓度为200mg/L，氯苯)异养硝化培养基的100mL血清瓶中，充分摇匀，5℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养2d。在上述相同条件下连续传代培养，共传代5次，分别对应氨氮浓度为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L。

[0051] 实施例2、菌种的扩大培养

[0052] 粘质沙雷氏菌TF-1Serratia marcescens TF-1.的扩大培养方法：取10～20mL经过高有机氯、高氨氮驯化后的菌液接种于装有300mL灭菌后的有机氯浓度为200mg/L的异养-1硝化培养基的500mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min 条件下放入摇床中培养4d。

[0053] 贪铜菌SWA1Cupriavidus sp SWA1.的扩大培养方法：取10～20mL经过高有机氯、高氨氮驯化后的菌液接种于装有300mL灭菌后的有机氯浓度为200mg/L的异养硝化培养基的500mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养4d。

[0054] 粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis(CICC 22642)的扩大培养方法：取10～20mL经过高有机氯、高氨氮驯化后的菌液接种于装有300mL灭菌后的有机氯浓度为200mg/L的异养硝化培养基的500mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养4d。

[0055] 不动杆菌Acinetobacter(CICC 10695)的扩大培养方法：取10～20mL经过高有机氯、高氨氮驯化后的菌液接种于装有300mL灭菌后的有机氯浓度为200mg/L的异养硝化培养基的500mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养4d。

[0056] 苍白杆菌TAC-2Ochrobactrum sp.TAC-2的扩大培养方法：取10～20mL经过高有机氯、高氨氮驯化后的菌液接种于装有300mL灭菌后的有机氯浓度为200mg/L的异养硝化培养基的500mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养4d。

[0057] 实施例3、复合菌剂的制备

[0058] 取实施例2所得粘质沙雷氏菌Serratia marcescens strain sp TF-1(CCTCC NO：M 2019674)菌液1～2ml，贪铜菌Cupriavidus sp(CCTCC NO：M 2015045)菌液1～4ml，粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis(CICC 22642)菌液1～4ml，不动杆菌Acinetobacter(CICC 
10695)菌液1～3ml，苍白杆菌Ochrobactrum sp.TAC-2菌液2～5ml，混合，得到种子液。

[0059] 取20mL种子液接种于装有1000mL灭菌后的异养硝化培养基的2000mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养4d，当OD600值升至0.7之后达到平稳期，得到复合菌剂。

[0060] 实施例4、复合菌剂去除高氨氮效果

[0061] 配置氨氮浓度为800mg/L的异养硝化培养基，向其中加入200mg/L的氯苯取100ml有机氯-异养硝化培养基于250ml血清瓶中，用微量移液器向瓶中加入2mL复合菌剂菌液(OD600＝1.0-2.0)，采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养，然后每隔24h测定菌液的OD600值确定菌体生长情况，同时测定培养基中氨氮和总氮的含量，确定氨氮和总氮的去除效果，由图1可知，在30℃条件下复合菌剂氨氮去除率达到100％，总氮去除率可达79.05％。

[0062] 实施例5、复合菌去除氯苯效果

[0063] 配置氯代芳烃浓度为60mg/L的无机盐-氯苯培养基，取100ml无机盐-氯苯培养基于250ml血清瓶中，用微量移液器向瓶中加入2mL复合菌剂菌液(OD600＝1.0-2.0)，采用橡胶垫铝盖密封，放入摇床设定在30℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养，然后每隔24h测定菌液的OD600值确定菌体生长情况，同时测定培养基中氯苯的含量，确定氯苯的去除效果，由图2可知，复合菌剂氯代芳烃去除率达到87％。

[0064] 实施例6、复合菌剂在不同浓度的氯代芳烃时菌体耐受实验

[0065] 配置氯代芳烃浓度为60mg/L、130mg/L、200mg/L的无机盐-氯苯培养基，取100ml培养基于250ml血清瓶中，用微量移液器向瓶中加入2ml复合菌剂菌液(OD600＝1.0-2.0)，采用胶垫铝盖密封，放入摇床设定在30℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养，然后每隔24h测定菌液的OD600值确定菌体生长情况，结果如图3所示。结果显示，复合菌剂能够在氯代芳烃浓度为200mg/L下生长。

[0066] 实施例7、复合菌剂处理垃圾渗滤液实验

[0067] 取100ml垃圾渗滤液(取自重庆荣昌城市生活垃圾填埋场，重庆市荣昌区七宝岩村)于250ml血清瓶中，用微量移液器向瓶中加入2mL复合菌剂菌液(OD600＝1.0-2.0)，采用胶垫铝盖密封，放入摇床设定在5℃、150r·min-1条件下放入摇床中培养，然后每隔24h测定废水中氨氮的含量，确定氨氮的去除效果，结果如图4所示。结果显示，复合菌剂可高效去除垃圾渗滤液中的氨氮，去除率可达到80％。

[0068] 在实验中发现，在其它条件不变的情况下，粘质沙雷氏菌Cupriavidus sp TF-1(CCTCC NO：M 2019674).比例在10～20％，贪铜菌SWA1Cupriavidus sp比例在10％～20％，粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis(CICC 22642)比例在5～20％，不动杆菌Acinetobacter(CICC 10695)比例在10～30％，苍白杆菌Ochrobactrum sp.TAC-2比例在20～50％，均能达到本发明的实验效果。

[0069] 复合菌剂与废水体积比为1～10％时，均能达到本发明的实验效果，综合考虑时间因素和经济性因素，复合菌剂体积为废水体积2.0～4.0％的比例时，高氨氮去除的效果最佳。

[0070] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。