一种抑制青枯病菌致病性的菜籽籽粕组合物及其应用

摘要

本发明提供了一种抑制青枯病菌致病性的菜籽籽粕组合及其应用，属于抑菌剂技术领域。菜籽籽粕组合物包括以下重量份的组分中的两种或多种：0.5～2份甘蓝菜籽粕、0.5～2份白菜籽粕和0.5～2份芥菜籽粕。抑制青枯病菌致病性的抑菌剂，包括所述菜籽籽粕组合物。所述菜籽籽粕组合物或所述抑菌剂在抗植物病害中的应用。植物菜籽籽粕在抗植物病害中的应用，所述菜籽籽粕包括甘蓝菜籽粕、白菜籽粕或芥菜籽籽粕。以青枯雷尔氏菌的运动能力、产胞外多糖能力、脱氢酶活性和/或土壤定殖能力作为检测青枯雷尔氏菌致病性的指标，结果表明采用菜籽籽粕或其组合物具有较强的抑制青枯病菌致病性。

权利要求

1.一种抑制青枯病菌致病性的菜籽籽粕组合物，其特征在于，由0.5～2重量份芥菜籽粕和0.5～2重量份白菜籽粕组成。

2.根据权利要求1所述菜籽籽粕组合物，其特征在于，由1重量份芥菜籽粕和1重量份白菜籽粕组成。

3.一种抑制青枯病菌致病性的抑菌剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述菜籽籽粕组合物。

4.权利要求1或2所述菜籽籽粕组合物或权利要求3所述抑菌剂在抗植物病害中的应用；

所述抗植物病害为抗青枯病害。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗青枯病害包括抑制青枯雷尔氏菌的运动能力、降低青枯雷尔氏菌的产胞外多糖能力、抑制青枯雷尔氏菌的脱氢酶活性或降低青枯雷尔氏菌的土壤定殖能力。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗青枯病害应用时，所述菜籽籽粕组合物的添加质量占土壤质量的0.3％～5％。

说明书

一种抑制青枯病菌致病性的菜籽籽粕组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于抑菌剂技术领域，具体涉及一种抑制青枯病菌致病性的菜籽籽粕组合及其应用。

背景技术

[0002] 青枯雷尔氏菌(Ralstonia salanacearum)是一种对作物极具危害性的土壤病原菌，对多种作物都有毁灭性的伤害。其在侵染作物过程中与很多致病因子都有关，如运动能力、产胞外多糖能力以及脱氢酶活性等。青枯菌(青枯雷尔氏菌)在土壤中侵染作物主要分为两个过程，分为在作物根部外围的定殖以及在根内部的定殖繁殖过程。运动能力可帮助病原菌向不同的栖息地过度，选择更有利的寄生环境，有研究发现在盆栽种植中接种活动性缺失的青枯菌引起的毒力有明显下降，而直接在木质部接种并未发病，说明青枯菌的运动性在早期的根部定殖中发挥了重要作用。当青枯菌侵入作物根部后，会产生大量以胞外多糖为主的分泌物堵塞损伤作物的维管束系统，产生的胞外多糖同时也能保护病原菌减少植物防御机制带来的威胁，促进病原菌在寄主体内的定殖，此外胞外多糖也常作为青枯病菌室内纯培养时检验致病能力的主要标志。关于脱氢酶，是细菌生长代谢和各类活动中所必须的关键酶，虽然青枯菌脱氢酶的研究相对较少，但也有一些研究证明了青枯菌相关脱氢酶在成膜能力、运动能力、胞外多糖等致病毒力因子方面都起到了重要作用。综上，在研究青枯病防治时，应结合青枯菌的这些生化性质，对主要的致病指标进行可靠的分析，有针对性地找寻抑病机理，才能更好的实现青枯病的高效防治。

[0003] 目前关于菜籽籽粕抑制病原菌致病能力的研究较少，大多研究仅停留在有挥发性抑菌成分的抑生效果上。有研究利用干燥器或培养皿创造密闭环境，通过中心接种或平板涂布的方式，检测病原细菌暴露于待测物质挥发物情况下的生长情况。也有研究通过化学方法提取植物组织中的挥发性成分来检测抑菌效果，但也都仅停留在对病原细菌生长活性的研究上，且提取方法并不简单易得，需根据具体成分作出改变。如若针对青枯菌也利用上述方式，首先这些方法仅能单一检测青枯菌的生长活性，往往会造成对青枯菌其他重要致病指标的忽略，导致具体致病指标数据的不充分，不利于后续防病实验的进展。并且平板涂布计数的方式误差较大，有时低效应的抑菌效果并不能很好的与对照组区别开来。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抑制青枯病菌致病性的菜籽籽粕组合及其应用，检测指标全面，且结果简单易得、重复性较好，并且灵敏度高，可根据结果识别与对照组间的微弱差异，并对各致病指标的抑菌效果作出判定。

[0005] 本发明提供了一种抑制青枯病菌致病性的菜籽籽粕组合物，包括以下重量份的组分中的两种或多种：0.5～2份甘蓝菜籽粕、0.5～2份白菜籽粕和0.5～2份芥菜籽粕。

[0006] 优选的，包括以下重量份的组分中的两种或多种：1份甘蓝菜籽粕、1份白菜籽粕和1份芥菜籽粕。

[0007] 优选的，所述菜籽籽粕组合物包括甘蓝菜籽粕和芥菜籽粕组成的组合物或白菜籽粕和芥菜籽粕组成的组合物。

[0008] 本发明提供了一种抑制青枯病菌致病性的抑菌剂，包括所述菜籽籽粕组合物。

[0009] 本发明提供了所述菜籽籽粕组合物在抗植物病害中的应用。

[0010] 本发明提供了植物菜籽籽粕在抗植物病害中的应用。

[0011] 优选的，所述菜籽籽粕包括甘蓝菜籽粕、白菜籽粕和芥菜籽籽粕中的一种。

[0012] 优选的，所述抗植物病害包括抗青枯病害。

[0013] 优选的，所述抗青枯病害包括抑制青枯雷尔氏菌的运动能力、降低青枯雷尔氏菌的产胞外多糖能力、抑制青枯雷尔氏菌的脱氢酶活性和/或降低青枯雷尔氏菌的土壤定殖能力。

[0014] 优选的，所述抗青枯病害应用时，所述植物菜籽籽粕或菜籽籽粕组合物的添加质量占土壤质量的0.3％～5％。

[0015] 本发明提供了一种抑制青枯病菌致病性的菜籽籽粕组合物，包括以下重量份的组分中的两种或多种：0.5～2份甘蓝菜籽粕、0.5～2份白菜籽粕和0.5～2份芥菜籽粕。本发明将菜籽籽粕两两组合或三种组合形成的组合物具有强烈抑制青枯病菌致病性的作用，实验表明，将菜籽籽粕组合物处理青枯雷尔氏菌，通过绘制生长曲线发现，处理后的菌有降低青枯雷尔氏菌生长活性的作用。同时以青枯雷尔氏菌的运动能力、青枯雷尔氏菌的产胞外多糖能力、青枯雷尔氏菌的脱氢酶活性和/或青枯雷尔氏菌的土壤定殖能力作为检测青枯雷尔氏菌致病性的指标，结果表明采用菜籽籽粕组合物能有效抑制青枯雷尔氏菌的运动能力、降低青枯雷尔氏菌的产胞外多糖能力、抑制青枯雷尔氏菌的脱氢酶活性和/或降低青枯雷尔氏菌的土壤定殖能力，因此，具有较强的抑制青枯病菌致病性。本发明提供检测指标全面，且结果简单易得、重复性较好，并且灵敏度高，可根据结果识别与对照组间的微弱差异，并对各致病指标的抑菌效果作出判定，为后续更深入的青枯菌抑制机理研究提供基础。

[0016] 进一步的，本发明进一步限定了所述菜籽籽粕组合物包括甘蓝菜籽粕和芥菜籽粕组成的组合物或白菜籽粕和芥菜籽粕组成的组合物。实现证明，上述菜籽籽粕两两特定的组合物比单一菜籽籽粕对青枯雷尔氏菌致病性的抑制性更强。

附图说明

[0017] 图1为本发明实施例8中甘蓝籽粕、白菜籽粕、芥菜籽粕以及白菜和芥菜形成的籽粕组合物以及对照处理下青枯菌的生长曲线图；

[0018] 图2为本发明实例9中不同处理剂量时白菜籽粕、芥菜籽粕以及白菜和芥菜形成的籽粕组合物以及对照处理下青枯菌的生长抑制情况结果图；

[0019] 图3为本发明实例10中不同处理组青枯菌的运动情况结果，左图为青枯菌的泳动能力结果图，右图为青枯菌的丛动能力结果图；

[0020] 图4-1为本发明实例10中不同处理组下青枯菌的胞外多糖产量结果图，图4-2为苯酚硫酸法多糖标准曲线；

[0021] 图5为本发明实例10中采用不同处理剂量的不同处理组下青枯菌的脱氢酶活性变化结果图；

[0022] 图6为不同籽粕在不同用量下的脱氢酶抑制效果图；

[0023] 图7为不同处理下的青枯菌定殖结果图。

具体实施方式

[0024] 本发明提供了一种抑制青枯病菌致病性的菜籽籽粕组合物，包括以下重量份的组分中的两种或多种：0.5～2份甘蓝菜籽粕、0.5～2份白菜籽粕和0.5～2份芥菜籽粕。

[0025] 在本发明中，所述菜籽籽粕组合物优选包括以下重量份的组分中的两种或多种：1份甘蓝菜籽粕、1份白菜籽粕和1份芥菜籽粕。当菜籽籽粕组合物包括两种组分时，所述菜籽籽粕组合物优选包括甘蓝菜籽粕和芥菜籽粕组成的组合物或白菜籽粕和芥菜籽粕组成的组合物。所述菜籽籽粕为菜籽炸油后剩余的下脚料。本发明对所述甘蓝菜籽粕、白菜籽粕和芥菜籽粕的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的甘蓝菜籽粕、白菜籽粕和芥菜籽粕的来源即可。

[0026] 在本发明中，所述菜籽籽粕组合物的制备方法，优选包括以下步骤：将甘蓝菜籽粕、白菜籽粕和芥菜籽粕中的两种或三种按照上述重量份混合，得到得到。

[0027] 本发明提供了一种抑制青枯病菌致病性的抑菌剂，包括所述菜籽籽粕组合物。所述抑菌剂优选还包括抑菌剂领域可接受的辅料。所述菜籽籽粕组合物在抑菌剂中的质量百分含量为50％～90％，更优选为60％～80％，最优选为70％。本发明对所述抑菌剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的抑菌剂制备方案即可。所述抑菌剂能有效抑制青枯病菌的增殖，同时抑制青枯病菌的致病性，从而减少对农作物的侵害。

[0028] 本发明提供了所述菜籽籽粕组合物在抗植物病害中的应用。所述抗植物病害优选包括抗青枯病害。所述抗青枯病害优选包括抑制青枯雷尔氏菌的运动能力、降低青枯雷尔氏菌的产胞外多糖能力、抑制青枯雷尔氏菌的脱氢酶活性和/或降低青枯雷尔氏菌的土壤定殖能力。所述抗青枯病害应用时，所述植物菜籽籽粕或菜籽籽粕组合物的添加质量优选占土壤质量的0.3％～5％。实验证明，采用所述菜籽籽粕组合物有效抑制青枯雷尔氏菌的致病性，比单一菜籽仔粕的抑制作用好。

[0029] 本发明提供了植物菜籽籽粕在抗植物病害中的应用。所述菜籽籽粕优选包括甘蓝菜籽粕、白菜籽粕或芥菜籽籽粕。所述抗植物病害优选包括抗青枯病害。所述抗青枯病害优选包括抑制青枯雷尔氏菌的运动能力、降低青枯雷尔氏菌的产胞外多糖能力、抑制青枯雷尔氏菌的脱氢酶活性和/或降低青枯雷尔氏菌的土壤定殖能力。所述抗青枯病害应用时，所述植物菜籽籽粕或菜籽籽粕组合物的添加质量优选占土壤质量的0.3％～5％。实验证明，采用所述菜籽籽粕有效抑制青枯雷尔氏菌的致病性，与不使用菜籽籽粕处理的对照组相比，具有较显著的抑制作用。

[0030] 下面结合实施例对本发明提供的一种抑制青枯病菌致病性的菜籽籽粕组合及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0031] 实施例1

[0032] 称量下列重量的菜籽籽粕：白菜籽粕5g和芥菜籽粕5g，将白菜籽粕和芥菜籽粕分别进行粉碎，过筛，得到的两种菜籽籽粕粉混合，得到菜籽籽粕组合物。

[0033] 实施例2

[0034] 称量下列重量的菜籽籽粕：白菜籽粕2.5g和芥菜籽粕10g，将白菜籽粕和芥菜籽粕分别进行粉碎，过筛，得到的两种菜籽籽粕粉混合，得到菜籽籽粕组合物。

[0035] 实施例3

[0036] 称量下列重量的菜籽籽粕：白菜籽粕10g和芥菜籽粕2.5g，将白菜籽粕和芥菜籽粕分别进行粉碎，过筛，得到的两种菜籽籽粕粉混合，得到菜籽籽粕组合物。

[0037] 实施例4

[0038] 称量下列重量的菜籽籽粕：甘蓝籽粕5g和芥菜籽粕5g，将白菜籽粕和芥菜籽粕分别进行粉碎，过筛，得到的两种菜籽籽粕粉混合，得到菜籽籽粕组合物。

[0039] 实施例5

[0040] 称量下列重量的菜籽籽粕：甘蓝籽粕2.5g和芥菜籽粕10g，将白菜籽粕和芥菜籽粕分别进行粉碎，过筛，得到的两种菜籽籽粕粉混合，得到菜籽籽粕组合物。

[0041] 实施例6

[0042] 称量下列重量的菜籽籽粕：甘蓝籽粕10g和芥菜籽粕2.5g，将白菜籽粕和芥菜籽粕分别进行粉碎，过筛，得到的两种菜籽籽粕粉混合，得到菜籽籽粕组合物。

[0043] 实施例7

[0044] 称量下列重量的菜籽籽粕：白菜籽粕5g，甘蓝籽粕5g和芥菜籽粕5g，将白菜籽粕和芥菜籽粕分别进行粉碎，过筛，得到的两种菜籽籽粕粉混合，得到菜籽籽粕组合物。

[0045] 实施例8

[0046] 生长活性测定

[0047] 青枯菌在CPG液体培养基中过夜培养，得到的菌液用无菌水水洗三遍后，将OD在600nm波长下调整至1.0。在分离培养皿的CPG固体培养基(17％的琼脂含量)中心接种5μl菌液，再在培养皿另一分隔中分别添加0.5g单独的甘蓝籽粕、白菜籽粕、芥菜籽粕以及白菜籽粕与芥菜籽粕的组合物(两者质量比为1:1，实施例1制备得到)，不加籽粕的培养皿做空白对照组(CK)，每个处理设置三个平行。培养皿用两层封口膜密封后置于30℃下静置培养4天，每过12h将生长出的青枯菌全部从培养基上刮下，溶于4mL无菌水中，在涡旋仪上均匀混合后取200μl在酶标仪上测出菌液在600nm波长下的OD600nm值用于绘制生长曲线。

[0048] 绘制的生长曲线见图1。

[0049] 由图1可知，在培养96h内，与对照组相比，四个处理组都能不同程度的抑制青枯菌的生长，其中芥菜籽粕处理组和白菜籽粕与芥菜籽粕的组合物处理组得到的青枯菌的生长曲线较强抑制，并且比甘蓝籽粕处理组和白菜籽粕处理组对青枯菌的生长抑制程度要强。

[0050] 实施例9

[0051] 实验中用直径9cm的分隔培养皿，一边倒入适宜青枯菌生长的CPG固体培养基，一边放入有挥发性的待测植物组分，密封培养3天后将菌刮下，溶于10mL无菌水中测OD600nm值，以本实验中加入的白菜籽粕、芥菜籽粕以及白菜和芥菜的组合物(质量比1:1)为例(实施例1制备得到)，设置了0.1g，0.2g，0.5g，1.0g的用量，不加籽粕的培养皿做空白对照组(CK)，每个处理设置三个平行。培养72h，将菌体刮下溶于10mL无菌水中，在600nm波长下测定OD600nm值。在实施例1中各菜籽籽粕添加量为0.5g的基础上测绘生长曲线时，考虑到青枯菌在平板上的生长特性，在点接种5μL的情况下，由图1发现青枯菌在生长到84小时开始出现平台期，因此培养时间至少设置为4天，以供实验完成时能观测到生长平台期。

[0052] 结果如图2所示。由图2可知，在设置的用量范围内都能表现出对青枯菌生长活性的抑制(实验籽粕用量范围可调整为0.1g～1.0g，但低于该范围值抑菌效果可能不明显，高于范围值籽粕在平板中不能很好地分散开，堆积量大会影响挥发物质的扩散)。

[0053] 实施例10

[0054] 采用单一菜籽仔粕或菜籽籽粕组合物分别对青枯菌的运动能力、产胞外多糖能力和脱氢酶活性以及在土壤中的定殖能力做检测，以得到对青枯菌的致病力的抑制情况。

[0055] 1、运动能力：取过夜青枯菌CPG培养液，用无菌水水洗三遍后调节OD600nm值至0.8，在分隔培养皿的琼脂含量0.3％和0.5％的CPG半固体培养基上接种2μL菌液，再在培养皿另一分隔中分别加入0.5g甘蓝籽粕、白菜籽粕以及芥菜籽粕和白菜籽粕与芥菜籽粕的组合物(两者质量比为1:1，实施例1制备得到)，不加菜籽仔粕的培养皿做空白对照(CK)，每个处理设置3个平行。将培养皿用两层封口膜密封后在30℃下水平放置，培养2天后用十字交叉法测得青枯菌的波动能力和丛动能力的运动直径。结果见图3。

[0056] 由图3可知，与对照组相比，四个处理组都能不能程度的抑制青枯菌的运动能力，四个处理组对波动能力和丛动能力的抑制作用的趋势较为一致，并且抑制程度由强到弱排序为白菜籽粕与芥菜籽粕的组合物处理组>芥菜籽粕处理组>白菜籽粕处理组>入甘蓝籽粕处理组。

[0057] 2、产胞外多糖能力：取过夜青枯菌培养液，用无菌水水洗三遍后调节OD600nm值至1.5，在分隔培养皿的CPG琼脂一边以点接种的方式接种5uL，再在培养皿另一分隔中分别加入0.5g的甘蓝籽粕、白菜籽粕以及芥菜籽粕和白菜籽粕与芥菜籽粕的组合物(两者质量比为1:1，实施例1制备得到)，不加菜籽仔粕的培养皿做空白对照(CK)，每个处理设置3个平行。培养三天后将生长的青枯菌菌苔刮下，溶于5mL无菌水中，测菌液OD600nm值，并在40℃下振荡20min充分溶解EPS后，在12000r/min转速下离心10min，弃去沉淀菌体，加入3倍体积的无水乙醇，醇沉两天以12000r/min转速下离心10min后弃去酒精得到多糖沉淀物，溶解于
5mL无菌水中，取2ml糖溶液，加1mL5％苯酚，再加入5mL浓硫酸，摇晃均匀后，沸水浴20min，在490nm处测得最大波长。

[0058] 结果如图4-1和图4-2所示。图4-1为本发明实例10中不同处理组下青枯菌的胞外多糖产量结果图，图4-2为苯酚硫酸法多糖标准曲线。与对照组相比，四个处理组对青枯菌的胞外多糖产量和OD值均有显著性抑制作用，其中青枯菌的胞外多糖产量和OD600nm值的抑制趋势较为一致，抑制程度由强到弱排序为芥菜籽粕处理组>白菜籽粕与芥菜籽粕的组合物处理组>白菜籽粕处理组>入甘蓝籽粕处理组。

[0059] 3、脱氢酶活性：取过夜青枯菌培养液，用无菌水水洗三遍后调节OD600nm值至1.0，取10mL接入30mL液体CPG培养基中，再加入0.1、0.2、0.5和1g的甘蓝籽粕、白菜籽粕以及芥菜籽粕和白菜籽粕与芥菜籽粕的组合物(两者质量比为1:1，实施例1制备得到)，不加菜籽仔粕的培养皿做空白对照(CK)，每个处理设置3个平行。所有处理至于30℃下振荡培养4h后，取8mL上层清液加入2mL浓度为60mg/L的刃天青钠缓冲液，利用荧光分光光度计，在发射波长535nm、激发波长590nm的条件下每20min测一次荧光值，通过1h内的荧光变化速率计算体系中脱氢酶活性。

[0060] 结果如图5和图6所示。图5为不同籽粕各用量处理下的体系荧光变化曲线，以前60分钟稳定的荧光值变化率来表征脱氢酶的活性。通过各处理与CK的荧光变化率比值，以公式：抑制率(％)＝1-(处理的荧光变化率/CK的荧光变化率)，计算脱氢酶的抑制率，得到图6。由图6可知，芥菜籽粕在三种类型的籽粕中对青枯菌脱氢酶活性的抑制效果最为优异，其次是白菜和甘蓝籽粕，且抑制效果均与籽粕的用量成正比。白菜和芥菜籽粕的组合处理方面，表现出了格外优异的效果，在总用量仅0.1g时就表现出了对青枯菌脱氢酶88.36％的抑制率，可以说起到了相当不错的协同作用。

[0061] 4、土壤定殖能力：取感病土壤，121℃下灭菌20min 2次，加入过夜的OD为1.0的青枯菌培养液，使土壤中青枯菌密度约为4*107CFU/g土，均匀混合后置于密封箱中，30度下培养7天使青枯菌在土壤中均匀定殖。混匀土壤后取120g土壤置于灭过菌的240mL密封玻璃罐中，并按照0.5％、1％、2％和4％的质量比分别加入甘蓝籽粕、白菜籽粕、芥菜籽粕和白菜籽粕与芥菜籽粕的组合物(两者质量比为1:1，实施例1制备得到)以及甘蓝籽粕与芥菜籽粕的组合物(两者质量比为1:1，实施例4制备得到)，不加待测物质的处理作空白对照组(CK)，每个处理设置3个平行。将玻璃瓶置于30℃下培养2周后，从每个玻璃瓶中取出0.5g土壤，用DNA试剂盒提取DNA，通过q-PCR对土壤中的青枯菌数目进行定量，检测青枯菌在土壤中的定殖能力。

[0062] q-PCR检测引物如下：Rsol-flic-F-gaacgccaacggtgcgaact(SEQ ID NO.1)；Rsol-flic-R-ggcggccttcagggaggtc(SEQ ID NO.2)。

[0063] 体系反应条件如下：

[0064]

[0065]

[0066] 结果如图7所示。所有处理对青枯菌在土壤中的定殖都起到了明显的抑制效果，且在单独籽粕的处理中，白菜型籽粕的处理效果最好，在0.5％，2％和4％籽粕施加量下土壤中的青枯菌拷贝数都明显低于甘蓝和芥菜的处理，相较于CK青枯菌数量减少了96.99％。此外，甘蓝和芥菜在添加量达到1％后，用量增加并不会对检测到的青枯菌数量有显著影响，而白菜则在添加量达到2％后不会使青枯菌数量发生显著变化。说明施入土壤中的籽粕达到一定量后，继续加大用量并不能提高对土壤中青枯菌定殖的抑制效果。而白菜加芥菜的组合处理，在总用量达到4％出现明显效果，抑制率达到了99.5％，说明白菜和芥菜的组合处理在籽粕达到一定浓度时会起到更优异的协同作用。

[0067] 本提供的菜籽仔粕及其组合物对青枯菌的致病性的抑制作用，采用的检测指标全面，且结果简单易得、重复性较好，并且灵敏度高，可根据结果识别与对照组间的微弱差异，并对各致病指标的抑菌效果作出判定，为后续更深入的青枯菌抑制机理研究提供基础。

[0068] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。