脑靶向肽及其在制备增强记忆药物中的应用

摘要

本发明公开了脑靶向肽及其在制备增强记忆药物中的应用，所述的脑靶向肽，其氨基酸序列为：MRWQEMGYIFYPRKLR‑Acp‑PRRPRRPRRPRRPR。所述的脑靶向肽可显著增强记忆，改善Aβ1‑42或LPS诱导的记忆缺陷。本发明将成为一种新的增强记忆或者改善AD患者记忆的治疗策略，成为新的治疗中枢神经系统疾病的方法，具有很大的市场价值。

权利要求

1.一种脑靶向肽在制备增强记忆药物中的应用；所述的脑靶向肽，其氨基酸序列为：MRWQEMGYIFYPRKLR‑Acp‑PRRPRRPRRPRRPRR。

2.权利要求1所述的脑靶向肽在制备阿尔茨海默病药物中的应用。

3.根据权利要求1 2中任意一项所述的应用，其特征在于，所述的脑靶向肽采用鼻腔给~

药剂型。

说明书

脑靶向肽及其在制备增强记忆药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生化技术领域，涉及脑靶向肽及其在显著增强记忆，改善Aβ1‑42或LPS诱导的记忆缺陷方面的应用，可以成为一种新的增强记忆或者改善AD患者记忆的治疗策
略。

背景技术

[0002] 随着人口老龄化，神经退行性疾病的患病人数逐年增多，据不完全统计，目前全世界约有4400万人患有痴呆症。预计到2050年人口老龄化将使其增加三倍以上，仅美国每年
的痴呆症成本已经超过6000亿美元，在英格兰和威尔士等国家，痴呆症已是导致死亡的主
要原因，约占总人口的11.6％。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又是老年痴呆中
最典型的一类，2017年世界卫生组织将AD认可为全球公共卫生优先事项。因此，对我们而
言，深入了解其发病原因与机制，并开发出相关治疗药物已迫在眉睫。

[0003] MOTS‑c是新近发现的由线粒体基因组12S rRNA中开放阅读框(sORF)编码的衍生肽，由16个氨基酸组成，序列为MRWQEMGYIFYPRKLR，其N末端11个氨基酸残基在许多物种中
非常保守。美国南加州大学Cohen教授于2015年发现此肽，并认为它可以调节细胞代谢包括
糖脂代谢和核苷酸代谢，还可以调节基因表达，如：泛素信号、核糖体成分、炎症和细胞因子
等表达。同时，他们认为相关的细胞代谢功能障碍可能会损害记忆或加速衰老，因此他们在
报道中指出，MOTS‑c可能对于延缓衰老过程是一种新的治疗策略。

[0004] 但是，对于具有细胞内靶标的治疗性肽和蛋白质，设法穿过细胞膜是成功递送这些分子药物所必需的。在AD临床治疗研究中，一系列相关抑制剂能否入脑已是评估治疗功
效的重要指标之一。MOTS‑c本身并不具备穿透血脑屏障功能，不能实现外周给药直接入脑。
我们设计并合成了一系列穿膜肽和脑靶向多肽，与MOTS‑c连接，以提高MOTS‑c的入脑率，以
作为AD病治疗的新方法。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种穿透血脑屏障的脑靶向肽。

[0006] 本发明还要解决的技术问题是提供上述脑靶向肽的应用。

[0007] AD的发病机制与大脑中免疫机制及线粒体代谢有着强烈相互作用。根据我们的实验结果，发现MOTS‑c对炎症反应和免疫相关基因的表达具有明显的负调控，中枢注射MOTS‑
c不仅可以促进记忆的形成还可以延长记忆的保留。同时，MOTS‑c可以改善由Aβ1‑42或LPS诱
导的神经炎症而引起的记忆损伤，其改善记忆损伤的原因很可能与MOTS‑c上调AMPK磷酸化
蛋白的表达有关，通过抑制神经炎症来改善记忆损伤。我们的这些前期的研究表明MOTS‑c
很可能成为一种新的增强记忆或者改善AD患者记忆的治疗策略，见图1、图2和图3。

[0008] 但是，MOTS‑c本身并不具备穿膜功能，而脑靶向药物是否可以穿越血脑屏障已经是一个重要的考虑因素。因此，我们设计穿膜肽与脑靶向肽以完成MOTS‑c的递送。在实验中
我们发现(PRR)5的穿膜活性与Antp(穿透素)类似，但细胞毒性却低于Antp。因此我们将
MOTS‑c和(PRR)5通过共价连接后形成新的分子，以提高其入脑率。

[0009] 此外，在本发明的脑靶向肽的相关实验中我们惊喜的发现(PRR)5的连接并不影响MOTS‑c的功能。因此，我们选择鼻粘膜给药的方式将脑靶向肽分子递送至大脑。鼻腔给药是
近些年较流行的给药方式，它允许药物通过细胞外三叉神经和细胞内神经元嗅觉相关途径
快速进入CNS，绕过BBB以有效地与多个脑区域相互作用，实现大分子药物快速入脑。将
MOTS‑c和MP通过鼻腔给药方式滴注于小鼠的上鼻腔内，结果显示鼻腔给予MOTS‑c组不能区
分新旧物体，而鼻腔给予MP组的小鼠却展示出良好的记忆率，其结果与侧脑室给予MOTS‑c
组的效果相当。随后将MP和MOTS‑c分别连接罗丹明(Rho)以追踪其在大脑中的分布，在小动
物成像和双光子激光共聚焦显微镜实验中，我们观察到当鼻腔给予MP后小鼠大脑中有大量
红色荧光分子，而鼻腔给予MOTS‑c组小鼠大脑中并没有观察到荧光分子。

[0010] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

[0011] 一种脑靶向肽MP，其氨基酸序列为：

[0012] MRWQEMGYIFYPRKLR‑Acp‑PRRPRRPRRPRRPRR。

[0013] 上述脑靶向肽MP在制备增强记忆药物中的应用也在本发明的保护范围内。

[0014] 上述脑靶向肽MP在制备阿尔茨海默病药物中的应用也在本发明的保护范围内。

[0015] 本发明中，所述的脑靶向肽优选采用鼻腔给药的剂型。通过鼻腔给药MP显著增强记忆，并改善了LPS诱导的记忆缺陷，应用近红外荧光小动物成像仪和双光子激光共聚焦显
微镜实验表明鼻腔给予MP后大脑摄取和分布率远高于鼻腔给予MOTS‑c。我们的结果显示
MOTS‑c可能成为一种新的增强记忆或改善AD患者记忆的治疗策略；而采用鼻腔给药方式，
可以使MP绕过BBB进入大脑，将成为一种新的治疗中枢神经系统疾病的方法。

[0016] 有益效果：本发明首次筛选出了跨膜能力强，副作用低的脑靶向肽MP具有显著增强记忆的效果，可以改善Aβ1‑42或LPS诱导的记忆缺陷。本发明公开的脑靶向肽可以成为一
种新的增强记忆或者改善AD患者记忆的治疗策略；而采用鼻腔给药方式，可以使脑靶向肽
绕过BBB进入大脑，可能成为一种新的治疗中枢神经系统疾病的方法。

附图说明

[0017] 图1.MOTS‑c促进物体识别记忆的形成和延长物体识别记忆的巩固。(A和D)当总探索时间TET为5s，训练后立即侧脑室注射或双侧海马CA1微注射MOTS‑c并且24h后检测发现，
对照组小鼠记忆率很差，与50％随机水平接近，而MOTS‑c组小鼠的记忆率为61.9％，T检验
发现该组小鼠的记忆率显著性高于50％随机水平(p<0.01)，并且双因素方差分析统计学方
法显示该组与对照组小鼠相比，有显著性差异(p<0.05)，表明MOTS‑c有助于物体识别记忆
的形成。(B‑C和E‑F)当TET为10s，训练后立即侧脑室注射或者双侧海马CA1微注射MOTS‑c，
72h后检测发现，对照组小鼠记忆率很差，MOTS‑c组小鼠却表现出良好的物体识别记忆力(T
检验：p<0.01，单因素方差分析：p<0.05)。这表明MOTS‑c有助于延长物体识别记忆的保留时
间。图中虚线表示50％的随机水平。*是与随机水平相比，#是与对照组相比。垂直线代表标
准差。

[0018] 图2.MOTS‑c可以改善由Aβ1‑42或LPS诱导的物体和位置识别记忆损伤作用。(A‑B)在NOR和OLR任务中，TET为10s，训练后立即侧脑室注射MOTS‑c(5μg)可改善由训练前14天注
射Aβ1‑42(icv；800pmol)所引起的记忆损伤(#p<0.05是与Aβ1‑42组相比)。这种记忆损伤修复
作用可以被AMPK的抑制剂dorsomorphin所阻断(#p<0.05是与Aβ1‑42+MOTS‑c组相比)。(C)侧
脑室注射了不同剂量的LPS，分别为1、2和4μg，对小鼠物体记忆的影响。(D‑E)在NOR和OLR任
务中，TET为10s，训练后立即侧脑室注射MOTS‑c(5μg)可以改善由训练前3天侧脑室注射LPS
(2μg)所引起的物体或者位置记忆损伤。同样，这种记忆损伤修复作用可以被AMPK的抑制剂
dorsomorphin所阻断。(#p<0.05是与LPS+MOTS‑c组相比)。图中虚线表示50％的随机水平。*
是与随机水平相比，#是与对照组相比。垂直线代表标准差。

[0019] 图3.MOTS‑c可以减少Aβ1‑42或LPS所诱导促炎因子的表达。(A‑B)通过实时定量PCR测定TNF‑α、IL‑6、IL‑1β、iNOS和COX‑2的含量，结果显示，Aβ1‑42或者LPS可以在mRNA水平上
显著性的上调这些促炎因子的表达，而MOTS‑c的处理可以显著性的下调由Aβ1‑42或者LPS引
起的这些促炎因子的上调。(C‑H)ELISA实验测定小鼠海马体中TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的含量，
结果显示，Aβ1‑42或者LPS可以在蛋白水平上显著性的上调这些促炎因子的表达，而MOTS‑c
的处理可以显著性的下调由Aβ1‑42或者LPS引起的这些促炎因子的上调。*表示Aβ1‑42或者LPS
组与阴性对照组相比，#表示Aβ1‑42+MOTS‑c或者LPS+MOTS‑c组与单独的Aβ1‑42或LPS组相比。
垂直线代表标准误差。

[0020] 图4.一系列脑靶向穿膜肽的筛选。(A‑B)激光共聚焦实验分别显示BV‑2和U87细胞系上一系列穿膜肽的跨膜能力鉴定(比例尺，50μm)。(C‑D)流式细胞实验分别显示BV‑2和
U87细胞系上一系列穿膜肽的跨膜能力鉴定。(E‑F)MTT实验显示这些穿膜肽BV‑2和U87细胞
系上的毒性。

[0021] 图5.罗丹明B与MP共连接得到Rho‑MP的反应步骤和条件。

[0022] 图6.鼻腔滴注MP在物体识别记忆上的作用及MP跨膜能力的鉴定。(A‑B)在NOR实验中，侧脑室给予MOTS‑c(5μg)对小鼠物体识别记忆的形成和巩固都有着促进的作用，而鼻腔
滴注MOTS‑c(50μg)组不能区分新旧物体，鼻腔滴注MP(50μg)组小鼠却展示出很好的记忆
率，显著性高于MOTS‑c滴鼻组。另外，MOTS‑c和MP通过静脉给药方式(IV)，结果显示IV 
MOTS‑c(50μg)组不能区分新旧物体，而IV MP(50μg)组小鼠却展示出很好的记忆率，显著性
高于IV MOTS‑c组。(C)对于鼻腔滴注MP在LPS引起的记忆损伤模型中，侧脑室注射MOTS‑c
组、鼻腔滴注MP组及静脉注射MP组的小鼠均能展示出良好的记忆，而鼻腔滴注MOTS‑c组和
静脉注射MOTS‑c组小鼠都不能很好地区分新旧物体。(D‑F)鼻腔滴注或者静脉注射saline、
Rho‑MOTS‑c和Rho‑MP于2h后将大脑取出并切片，激光共聚焦实验显示IN或IV后Rho‑MP广泛
分布于小鼠多个脑区，而saline和Rho‑MOTS‑c组荧光分布较少。(G‑I)鼻腔滴注或者静脉注
射saline、Rho‑MOTS‑c和Rho‑MP于2h后将大脑取出置于小动物成像仪内，结果显示IN或IV
后Rho‑MP广泛分布于小鼠大脑组织中，而saline和Rho‑MOTS‑c组荧光分布较少。这些实验
均表明新合成的MP可以透鼻吸入或者静脉注射的方式运送至中枢发挥增强记忆的作用。

具体实施方式

[0023] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本
发明。

[0024] 实施例1：MOTS‑c的穿膜活性鉴定

[0025] 侧脑室给药对于中枢神经系统疾病来说是病人不可能采用的给药方式，因此我们想知道MOTS‑c是否可以具有穿膜活性。在此实验中我们在MOTS‑c的N末端接上FITC，选择了
BV2和U87细胞作为鉴定MOTS‑c穿膜活性的体外模型。结果如图4所示，当MOTS‑c的浓度加大
至20μM时仍不能进入细胞。因此，我们需要筛选一条合适的穿膜肽作为MOTS‑c入脑的媒介。

[0026] 实施例2：细胞穿膜肽及脑靶向多肽的合成与纯化鉴定

[0027] 我们选择并合成了穿膜效果较好的7条多肽，表1为穿膜肽的序列，表2为穿膜肽的HPLC保留时间、纯度及分子量。多肽均通过固相肽合成方法合成，制备后再与FITC相连，用
于体外细胞实验筛选，得到穿膜效果好、毒性低的穿膜肽。

[0028] 表1穿膜肽的名称及对应的序列。

[0029]

[0030]

[0031] 表2穿膜肽的HPLC保留时间、纯度及分子量。

[0032]

[0033] 实施例3：激光共聚焦和细胞流式实验筛选脑胶质细胞穿膜肽跨膜能力

[0034] 采用小鼠小胶质细胞BV‑2和人胶质母细胞瘤细胞87筛选穿膜肽，①到⑦号浓度为‑5
10 M，依次加入到提前12小时种好细胞的24孔板中，孵育4个小时后洗脱几次，激光共聚焦
和流式细胞仪检测其穿膜活性，见图4。

[0035] 综合来看，②⑤穿膜效果较为稳定。

[0036] 实施例4：细胞穿膜肽毒性筛选

[0037] 选择MTT实验鉴定穿膜肽的毒性。穿膜肽的浓度为10μM，细胞为U87神经胶质瘤细胞系。从激光共聚焦和流式细胞仪实验结果可以看出，②⑤号穿膜效果较好。⑤号类似物毒
性稍比②号强，如图4。

[0038] 因此考虑到作用效果与毒性，选择②号穿膜肽作为携带MOTS‑c入脑的载体分子。

[0039] 实施例5：MP的透鼻吸入治疗记忆损伤

[0040] 1、MP分子的合成

[0041] 采用固相片段缩合法，2‑CTC Resin固相分别合成Fmoc‑MOTS‑c全保护肽片段以及H‑Acp‑(PRR)5‑O‑CTC Resin，随后将全保护Fmoc‑MOTS‑c片段与H‑Acp‑(PRR)5‑O‑CTC Resin
缩合，得到Fmoc‑MOTS‑c‑Acp‑(PRR)5‑O‑CTC Resin，最后经过裂解、纯化、冻干，得到命名为
MP的新肽，纯度98.6％。随后我们在新合成的MP分子N末端接上罗丹明(Rho)荧光分子以用
于后续的实验，具体的合成过程：采用固相片段缩合法，2‑CTC Resin固相分别合成Fmoc‑
Acp‑MOTS‑c全保护肽片段以及H‑Acp‑(PRR)5‑O‑CTC Resin，随后将全保护Fmoc‑Acp‑MOTS‑
c片段与H‑Acp‑(PRR)5‑O‑CTC Resin缩合，得到Fmoc‑Acp‑MOTS‑c‑Acp‑(PRR)5‑O‑CTC 
Resin，脱除保护Fmoc，与罗丹明B酰氯反应，最后经过裂解、纯化、冻干，得到Rho‑MOTS‑c‑
Acp‑(PRR)5‑OH纯肽，具体的合成过程如图5。

[0042] 2、鼻腔和尾静脉给予MP后的行为学作用

[0043] 采用NOR学习记忆模型探索MP鼻腔和尾静脉给药后是否可以促进小鼠记忆形成或延长记忆巩固。如图6A和B，鼻腔滴注和尾静脉注射MP可以增强物体识别记忆；将LPS微注射
至小鼠侧脑室以形成神经炎症模型，3天后，通过NOR学习记忆模型，探索MP鼻腔给药后是否
可以改善LPS引起的记忆损伤。结果表明只有侧脑室给药MOTS‑c以及鼻腔和尾静脉注射MP
的小鼠可以区分新旧物体，而鼻腔吸入和尾静脉注射MOTS‑c组小鼠完全不能区分新旧物
体，记忆率很低，表明鼻腔滴注和尾静脉注射MP可以改善LPS损伤的物体识别记忆，如图6C。

[0044] 3、小动物成像及双光子激光共聚焦显微镜证明MP的入脑率

[0045] 双光子激光共聚焦实验显示只有鼻腔滴入和尾静脉注射罗丹明标记的Rho‑MP组小鼠的大脑中分布着比较强的红色荧光分子，而对照组、鼻腔滴入Rho组、鼻腔滴入Rho‑
MOTS‑c组的小鼠大脑中均没有观察到荧光分子(图6D、E和F)。NIR fluorescence imaging
小动物成像实验显示只有鼻腔滴入罗丹明标记的Rho‑MP组小鼠的大脑中分布着比较强的
荧光，而对照组、鼻腔滴入Rho组、鼻腔滴入Rho‑MOTS‑c组的小鼠大脑中均没有观察到荧光
分子(图6G、H和I)。