一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法转让专利
申请号 : CN201910892376.0
文献号 : CN110819720B
文献日 : 2021-04-27
发明人 : 徐鹏 , 吕红皂 , 陈葆华 , 濮菲
申请人 : 厦门大学
摘要 :
权利要求 :
1.用于快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记,其特征在于所述InDel分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述用于快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记,其特征在于所述InDel分子标记由以下方法获得:从南方、北方分别采集花鲈,剪去肌肉组织,使用酚氯仿法提取DNA,随后使用IlluminaHiseq 2000平台进行高通量从重测序,每个体测序深度10~
12X;利用BWA将测序数据比对至花鲈参考基因组,使用GATK、picard、samtools软件进行基因分型,查找全基因组内的插入缺失位点及SNP位点;随后使用plink计算插入缺失位点在两个群体内的Fst值,选取两个Fst=1的插入缺失位点。
3.一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法,其特征在于包括以下步骤:
1)提取待鉴定的中国花鲈基因组DNA;
2)利用南北方花鲈基因组InDel差异,合成特定引物,具体方法为:根据南北方花鲈基因组的InDel差异,北方花鲈群体存在InDel位点,而南方花鲈群体缺失此InDel位点,因此在北方花鲈基因组染色体上的两个InDel位点的两端分别设计引物,其中北方花鲈群体的基因组DNA扩增产物的片段长度会比南方花鲈群体多出InDel位点的碱基数,使用引物设计软件Primer5分别生成两对引物,一对引物为A51,另一对引物为B46,它们的正反向引物序列分别如SEQ ID NO:3‑6所示;
A51引物核酸碱基序列:
上游引物F:GGACACCCTCAAAACTCT下游引物R:CTTTGTCAGGTCATACGGB46引物核酸碱基序列:
上游引物F:GTTCAATGGGTCTTCACG下游引物R:GTTCAATGGGTCTTCACG将合成的引物用双蒸水稀释为10μM,‑20℃保存备用;
3)以待鉴定的中国花鲈种质基因组DNA为模版,利用所合成的特定引物进行PCR扩增,具体步骤为:以待测中国花鲈的基因组DNA为模板,利用SEQ ID NO:3‑6所示的特定引物进行PCR扩增,进行PCR扩增反应;反应体系为25μL PCR反应体系:ddH2O 17.8μL, 10×Buffer ‑1 ‑1
2μL, 10 mmolL dNTP 2μL, 0.2μL Taq酶,10 μmolL F、R引物各1μL,模版DNA 1μL;PCR热循环程序:94℃预变性5min,使模版DNA充分变性,然后进入下列温度循环;94℃变性1 min,51℃退火1 min,72℃延伸1 min,重复35个热循环;72℃延伸10min,最后4℃保存;
4)使用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行验证;
5)根据目的条带差异判断待鉴定的花鲈属于哪一群体。
4.如权利要求3所述一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法,其特征在于在步骤1)中,所述提取待鉴定的中国花鲈基因组DNA的具体步骤为:从南北方花鲈种群采样地分别采集野生花鲈各至少20尾,剪去肌肉组织,使用酚氯仿法提取DNA。
5.如权利要求3所述一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法,其特征在于在步骤4)中,所述使用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行验证的具体方法为:制作2%的琼脂糖凝胶,使用50bp的DNA ladder marker,130V电压进行电泳,检测PCR是否成功扩增。
6.如权利要求3所述一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法,其特征在于在步骤5)中,所述根据目的条带差异判断待鉴定的花鲈属于哪一群体的具体方法为:根据凝胶成像中的DNA片段模式,分析判断出待鉴别的花鲈所属哪一群体,若引物A51的目的片段为168bp且引物B46的目的片段为185bp,则判断该条花鲈属于北方种群花鲈;若引物A51的目的片段为117bp且引物B46的目的片段为139bp,则判断该条花鲈属于南方种群花鲈;若扩增的目的条带不是以上两种情况,则判定待测花鲈为具有杂合基因型的南北中间群体花鲈。
7.权利要求1所述的用于快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记在花鲈分子标记辅助育种中的应用。
8.用于鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记的引物在花鲈分子标记辅助育种中的应用,所述InDel分子标记的引物序列如SEQ ID NO:3‑6所示。
说明书 :
一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法
技术领域
背景技术
我国花鲈养殖产业发展迅速,在我国以广东、福建和山东三省养殖产量最高。作为我国主要
本土海水鱼类之一,中国花鲈群体在黄渤海、东海、南海等区域均有分布,分布范围广,地理
纬度跨度大,分布范围内海洋环境差异显著,不同地理种群的遗传结构和性状均存在鲜明
差异。高纬度地区的黄渤海花鲈种群的生长速度显著高于低纬度的南海北部、东海南部地
区的花鲈种群,种质资源和遗传资源极其丰富。其中北部湾‑南海北部和渤海‑黄海北部两
个南北方种群的花鲈地理位置相隔较远,是两个极端分化的种群,两个种群之间由一系列
中间种群相连。种群遗传学分析显示,两个种群存在显著的遗传分化差异。因此,开发两个
极端分化种群的分子鉴定标记,有助于花鲈种质资源的快速鉴别。
界环境及组织类别和发育时期的影响等优越性成为目前最受青睐的鉴定方法。随着测序技
术和生物信息学的发展,全基因组重测序使我们能够在全基因组尺度更加准确的找到两个
不同种群的InDel标记。InDel标记作为近年新兴的一种分子生物技术,为锚定标记,无重复
序列,稳定性强,准确性高,适用性广。
发明内容
花鲈群体的InDel分子标记方法。
InDel分子标记缺失片段的纯合基因型对应的是南方(北部湾‑南海北部)花鲈群体,没有缺
失片段的纯合基因型对应的是北方(渤海‑黄海北部)花鲈群体。所述两对PCR引物,其核苷
酸序列为SEQ ID No:3至SEQ ID No:6所示。
进行高通量从重测序,每个体测序深度10~12X;利用BWA将测序数据比对至花鲈参考基因
组,使用GATK、picard、samtools等软件进行基因分型,查找全基因组内的插入缺失位点及
SNP位点;随后使用plink计算插入缺失位点在两个群体内的的Fst(Fixation Index,固定
指数)值,选取两个Fst=1的插入缺失位点。
如SEQ ID NO:3‑6所示。
引物,其中北方花鲈群体的基因组DNA扩增产物的片段长度会比南方花鲈群体多出InDel位
点的碱基数,使用引物设计软件Primer5分别生成两对引物,一对引物为A51,另一对引物为
B46,它们的正反向引物序列分别如SEQ ID NO:3‑6所示;
3‑6所示的特定引物进行PCR扩增,进行PCR扩增反应;反应体系为25μL PCR反应体系:
ddH2O17.8μL,10×Buffer 2μL,10mmolL‑1dNTP 2μL,0.2μL Taq酶,10μmolL‑1F、R引物各1μ
L,模版DNA 1μL;PCR热循环程序:94℃预变性5min,使模版DNA充分变性,然后进入下列温度
循环;94℃变性1min,51℃退火1min,72℃延伸1min,重复35个热循环;72℃延伸10min,最后
4℃保存。
扩增。
的目的片段为168bp且引物B46的目的片段为185bp,则判断该条花鲈属于北方种群花鲈;若
引物A51的目的片段为117bp且引物B46的目的片段为139bp,则判断该条花鲈属于南方种群
花鲈;若扩增的目的条带不是以上两种情况,则判定待测花鲈为具有杂合基因型的南北中
间群体花鲈。
定,北方花鲈种群目的条带一致(约168bp和185bp条带),南方花鲈种群目的条带一致(约
117bp和139bp)。该实验结果证明,用于鉴定南北方花鲈种群的两对InDel分子标记引物的
准确和高效性。
分子标记为共显性标记,具有扩增稳定、准确率高、检测方便、快速等优点。
分子和生物信息学方面研究等奠定基础。
附图说明
具体实施方式
氯仿法提取DNA。随后使用IlluminaHiseq 2000平台进行高通量从重测序,每个体测序深度
10~12X。利用BWA将测序数据比对至花鲈参考基因组,使用GATK、picard、samtools等软件
进行基因分型,查找全基因组内的插入缺失位点及SNP位点。随后使用plink计算插入缺失
位点在两个群体内的的Fst(Fixation Index,固定指数)值,选取了两个Fst=1的插入缺失
位点,分别位于花鲈6号和21号染色体上。
杂合基因型对应的为南北中间群体花鲈。
μL,在加入20μL的蛋白酶K(20mg/mL),混匀55℃水浴3~6h(期间将管子颠倒混匀几次)。
Taq酶,10umolL F、R引物各1μL,模版DNA 1μL。
℃保存。
鲈;如果引物A51的目的片段为117bp且引物B46的目的片段为139bp,则判断该条花鲈属于
南方种群花鲈。
2mm正方形大小的花鲈鳍条剪碎放入1.5mL无菌离心管中,加入500μL裂解缓冲液(TE)于离
心管中(10mM Tris—HCL,pH8.0,10mMEDTA pH8.0),加入10%的SDS 50μL,在加入20μL的蛋
白酶K(20mg/mL),混匀55℃水浴3~6h(期间将管子颠倒混匀几次)。裂解后,加入600μL的
酚︰氯仿︰异戊醇,其体积比为25︰24︰1,混匀15min后,12000r/min,离心15min。吸上清,约
500μL,转入新的1.5mL离心管,加入500μL氯仿︰异戊醇,其体积比为24︰1,混匀15min后,
12000r/min,离心10min。吸上清,约350μL,转入新的1.5mL离心管中,1mL‑20℃预冷的无水
乙醇,混匀后置于‑20℃静置2h。12000r/min,离心15min,弃上清。加入75%乙醇洗涤2次,置
于吸水纸上倒置晾干。加入50μL ddH20和0.5μL的RNA酶溶解,即为DNA。
通量重测序数据信息,使用GATK、picard、samtools等软件进行基因分型,查找全基因组内
的插入缺失位点及SNP位点。随后使用plink计算插入缺失位点在两个群体内的的Fst
(Fixation Index,固定指数)值,获得了两个Fst=1的InDel位点,分别位于花鲈6号和21号
染色体上。使用Primer软件分别在两个InDel位点附近设计引物,通过引物筛选得到了A51
和B46两对引物。根据本发明提供的两对引物,通过花鲈DNA的提取和普通PCR反应即可鉴定
南北方花鲈种群。
应体系为25μL PCR反应体系:ddH2O 17.8μL,10×Buffer 2μL,10mmolL dNTP 2μL,0.2μL
‑1
Taq酶,10umolL F、R引物各1μL,模版DNA 1μL;PCR热循环程序:94℃预变性5min,使模版DNA
充分变性,然后进入下列温度循环;94℃变性1min,51℃退火1min,72℃延伸1min,重复35个
热循环;72℃延伸10min,最后4℃保存。
断该条花鲈属于北方种群花鲈;如果引物A51的目的片段为117bp且引物B46的目的片段为
139bp,则判断该条花鲈属于南方种群花鲈。
尾)进行群体验证,PCR电泳结果如图2~7。结果显示,天津、烟台、文登站点花鲈种群PCR扩
增后,引物A51的目的片段均为168bp且引物B46的目的片段均为185bp,均为北方花鲈种群;
铁山港、防城港、海康港站点花鲈种群PCR扩增后,引物A51的目的片段均为117bp且引物B46
的目的片段均为139bp,均为南方花鲈种群。通过以上的鉴定也进一步验证的本发明的
InDel分子标记的准确和高效性。
InDel位点分型信息。从中挑选了南北方群体具有完全不同的等位基因的两个InDel位点。
根据InDel位点设计筛选了两对PCR引物,通过PCR引物目的条带差异可快速准确判断待鉴
定花鲈属于哪一个群体,其核苷酸序列为SEQ ID No:1至SEQ ID No:6所示。本发明通过简
单的实验操作和分析即可对北方(渤海‑黄海北部)花鲈群体和南方(北部湾‑南海北部)花
鲈群体进行种质鉴定,整个过程仅需0.5~1个工作日即可。对南北方花鲈群体进行种质鉴
定可以有效的进行种质资源评估,减少苗种混杂的盲目性,为花鲈在遗传育种、分子和生物
信息学方面研究等奠定基础。