一种调制乳粉中维生素K1和维生素K2含量的测定方法转让专利
申请号 : CN201911156430.1
文献号 : CN110824057B
文献日 : 2022-03-18
发明人 : 公丕学 , 孙珊珊 , 刘桂亮 , 张艳侠 , 薛霞 , 王明栋 , 刘艳明 , 卢兰香
申请人 : 山东省食品药品检验研究院
摘要 :
权利要求 :
1.一种调制乳粉中维生素K1和维生素K2含量的测定方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)采用酶解、皂化的方式提取待测调制乳粉中的维生素K1和维生素K2,得到样品提取液;
(2)采用柱后锌粉还原‑高效液相色谱‑荧光检测方法,对所述样品提取液中维生素K1和维生素K2进行检测,得到液相色谱数据;
(3)根据维生素K1和维生素K2的液相色谱标准工作曲线,得到待测调制乳粉中维生素K1和维生素K2的含量;
步骤(1)包括:避光条件下,将待测调制乳粉经脂肪酶酶解,氢氧化钠‑乙醇皂化,正己烷萃取,氮吹浓缩,甲醇复溶,有机滤膜过滤,得到样品提取液;
步骤(2)的色谱条件如下:
色谱柱:C18色谱柱;柱后锌粉还原柱;
流动相:含0.03%冰乙酸、1.5g/L氯化锌和0.5g/L无水乙酸钠的甲醇溶液;
流速1.0mL/min;
进样体积10μL;
柱温35℃;
步骤(2)中,荧光检测器的激发波长为326nm,发射波长为432nm。
2.根据权利要求1所述的调制乳粉中维生素K1和维生素K2含量的测定方法,其特征在于,酶解过程中,待测调制乳粉与脂肪酶的质量比为1:(0.3‑0.4),酶解时间在4h以上。
3.根据权利要求1所述的调制乳粉中维生素K1和维生素K2含量的测定方法,其特征在于,皂化过程中,在酶解后样液中加入NaOH溶液,涡旋30s后,再加入无水乙醇皂化3‑8min,其中,NaOH溶液的浓度为2‑3mol/L。
4.根据权利要求1所述的调制乳粉中维生素K1和维生素K2含量的测定方法,其特征在于,萃取过程中,使用正己烷萃取两次,饱和NaCl溶液水洗1次。
5.根据权利要求1所述的调制乳粉中维生素K1和维生素K2含量的测定方法,其特征在于,步骤(1)包括:称取2.5g待测调制乳粉于50mL离心管中,加入0.8g的脂肪酶,用10mL温水溶解,涡旋混匀,于37℃±2℃恒温水浴震荡,酶解4h后,得到酶解后样液;在所述酶解后样液中加入1mL 2.5mol/L的NaOH溶液,涡旋30s后,再加入10mL无水乙醇,混匀皂化5min,得到皂化后样液;在所述皂化后样液中加入10mL正己烷,涡旋提取5min,6000r/min离心3min,移取上层正己烷层于另一个50mL离心管,再加入10mL正己烷萃取一次,合并提取液,用10mL饱和氯化钠溶液水洗有机相后氮气吹干,用甲醇2mL复溶,过0.22μm有机滤膜,得到样品提取液。
说明书 :
一种调制乳粉中维生素K1和维生素K2含量的测定方法
技术领域
背景技术
其侧链形式不同可以分为维生素K1(叶绿醌,VK1)和维生素K2(甲萘醌类,VK2) 两种,广泛存
在于自然界中,与人体代谢密切相关,也是研究及应用最多的两类化合物。维生素K1和维生
素K2都是脂溶性维生素,对光和碱敏感,有耐热性,在生物体内具有不同强度的生物活性。
维生素K1为单一化合物,其侧链上只包含有一个异戊烯结构单元,主要来源于绿叶蔬菜(如
菠菜、甘蓝、莴苣等)与大豆及其制品。维生素K2由肠道细菌合成,另外纳豆、蛋黄、动物肝
脏、发酵品中少量含有,维生素K2是由一条C3上异戊二烯侧链和一个甲基萘醌母环组成的
系列化合物,共有14种同系物。维生素K作为一种营养补充剂应用到调制乳粉中,对于维生
素K缺乏症有很好的预防作用。
法、液相色谱‑质谱法等。其中分光光度法分析步骤繁琐、且精密度不高;高效液相色谱‑紫
外检测法选择性和灵敏度不高,无法满足食品中微痕量组分的检测需求;高效液相色谱‑质
谱法虽然具有较高的灵敏度,但其仪器复杂、成本较高,而且食品基质复杂,易影响定量准
确性。
发明内容
所述酶解后样液中加入1mL 2.5mol/L的NaOH溶液,涡旋30s后,再加入 10mL无水乙醇,混匀
皂化5min,得到皂化后样液;在所述皂化后样液中加入10mL正己烷,涡旋提取5min,6000r/
min离心3min,移取上层正己烷层于另一个50mL离心管,再加入10mL正己烷萃取一次,合并
提取液,用10mL饱和氯化钠溶液水洗有机相后氮气吹干,用甲醇2mL复溶,过0.22μm有机滤
膜,得到样品提取液。
荧光反应,产生荧光物质,从而提高其在高效液相色谱荧光检测上的灵敏度和选择性。
高。
婴幼儿调制乳粉的安全性。
附图说明
还可以根据这些附图获得其他的附图。
具体实施方式
施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施
例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性
劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
司);3‑18K型冷冻离心机(德国Sigma公司);AB204‑S型电子天平(德国Mettler Toledo公
司);MS3型旋涡混合器(德国IKA公司);SB‑800DTD超声清洗仪(中国宁波新芝生物科技股份
有限公司);SW22恒温水浴振荡器(中国宁波新芝生物科技股份有限公司);HGC‑24型氮吹仪
(中国恒奥科技有限公司);Milli‑Q超纯水系统(美国Millipore 公司)。
有限公司);碳酸钾(优级纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);标准物质:维生素K1标准品
(德国Dr.Ehrenstorfer公司);维生素K2标准品(美国Chroma Dex公司);脂肪酶(酶活力≥
700U/mg,美国Sigma公司);待测调制乳粉购自超市。
溶液保存在棕色试剂瓶中于‑18℃冰箱中储存。
述混合标准溶液用水逐级稀释成0.0025、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0μg/mL 的混合标准
工作溶液。现配现用。
脂肪酶用量不足,萃取时乳化严重,影响提取效率。脂肪酶使用过量会降低维生素K的提取
效率,可能的原因是酶的使用量太高时不利于乳粉的溶解,导致回收率下降。如图2所示,为
脂肪酶0.8g时,酶解时间对维生素K1和维生素K2提取回收率的影响图,酶解时间过短,酶解
不完全,影响后续萃取效率,酶解时间4小时以上提取效率趋于稳定,回收率均达到90%以
上。综上所述,酶解过程中,待测调制乳粉与脂肪酶的质量比为1:(0.3‑0.4),酶解时间在4h
以上。故本发明提供的测定方法中,可优选待测调制乳粉与脂肪酶的质量比为1:0.32,酶解
4小时的酶解条件。
醇皂化3‑8min,其中,NaOH溶液的浓度为2‑3mol/L。除此之外,如图3所示,低浓度的氢氧化
钠溶液(2.5mol/L)加入量为1mL时效果较好,维生素K1和维生素K2的回收率分别达到93%和
92%。氢氧化钠溶液加入量过少时,皂化不完全,萃取时不容易分层;加入量过多时,维生素
K被碱破坏,均会影响萃取效率。碱加入后,要给予一定的反应时间,约30s 后再加入乙醇,
乙醇可以保护维生素K,还可以起到消泡作用促进分层的作用。故本发明提供的测定方法
中,可优选采用2.5mol/L氢氧化钠溶液1mL加入酶解后样液,涡旋30s后,再加入10mL无水乙
醇进行皂化。
的碱液洗掉。选用饱和氯化钠溶液作为水洗溶液,即可防止液液分配过程的乳化,更有利于
分层。本申请对于正己烷的萃取剂量(10mL和15mL)、萃取次数(一次和两次)进行了考察,结
果见表1。发现10mL和15mL提取两次的结果差异不大,对维生素K1和维生素K2的提取回收率
均达到90%以上,两次萃取对维生素K1和维生素K2的提取更充分。因此,从提高前处理效率
和成本的角度,建议提取条件为10mL正己烷萃取两次,10mL饱和氯化钠溶液水洗一次。
4h后,得到酶解后样液;在所述酶解后样液中加入1mL 2.5mol/L的NaOH溶液,涡旋 30s后,
再加入10mL无水乙醇,混匀皂化5min,得到皂化后样液;在所述皂化后样液中加入10mL正己
烷,涡旋提取5min,6000r/min离心3min,移取上层正己烷层于另一个50mL离心管,再加入
10mL正己烷萃取一次,合并提取液,用10mL饱和氯化钠溶液水洗有机相后氮气吹干,用甲醇
2mL复溶,过0.22μm有机滤膜,得到样品提取液。
高效液相色谱仪荧光检测器上的响应值,提高灵敏度,必须选择合适的激发和发射波长。本
文采用Waters 2475荧光检测器的3D(three‑dimensional)扫描功能,对锌粉还原后的维生
素K1和维生素K2混合标准工作溶液进行扫描,扫描结果见图4和图5。结果表明,固定发射波
长为430nm在波长200~420nm范围内测定2种维生素K柱后锌粉还原产物的激发波长,2种维
生素K激发波长有2个吸收峰,分别为243nm和326nm,激发波长 326nm时维生素K1和维生素
K2的响应值约为243nm时的1.5倍。固定激发波长为243 nm,在253~610nm范围内测定2种维
生素K柱后锌粉还原产物的发射波长,由图4所示的维生素K1和维生素K2的最佳发射波长分
别是434nm和430nm;固定激发波长为326 nm时,在336~610nm范围内测定发射波长,由图5
所示的维生素K1和维生素K2的最佳发射波长分别是434nm和432nm。因此,本发明提供的测定
方法中,可优选326nm为最佳激发波长、432nm为最佳发射波长检测,使维生素K1和维生素K2
均具有较高的响应值。
乙酸、1.5g/L氯化锌和0.5g/L无水乙酸钠的甲醇溶液为流动相,通过4.6×150mm的Xbridge
C18色谱柱进行分离,锌粉还原柱还原后荧光检测器检验,由图6可见维生素K1和维生素 K2
的峰高、峰形较理想,出峰时间最快,缩短了分析检测时间。因此,本发明提供的测定方法
中,色谱条件如下:色谱柱:C18色谱柱;柱后锌粉还原柱;流动相:含0.03%冰乙酸、 1.5g/L
氯化锌和0.5g/L无水乙酸钠的甲醇溶液;流速1.0mL/min;进样体积10μL;柱温35℃。
述步骤(2)的色谱条件和荧光条件进行测定,以峰面积(Y)为纵坐标,对应的质量浓度(X)为
横坐标,绘制标准曲线,以3倍信噪比S/N确定检出限(LOD)。维生素 K1和维生素K2线性关系
2
良好,线性相关系数(R)均在0.999以上,维生素K1的线性回归方程为:Y=237e+006X‑2.18e
+003,LOD为0.1μg/100g;维生素K2的线性回归方程为:Y=1.55e+006X‑1.15e+004,LOD为
0.2μg/100g。
的平均回收率在80%~95%之间,精密度在0.85%~3.98%之间,表明方法的精密度和准
确度良好。
家标准的规定值,其余4份未添加;维生素K2均为检出,因调制乳粉中植物甲萘醌(维生素
K1)为维生素K添加剂,维生素K2作为营养强化剂处于发展阶段,未在市售的调制乳粉中添
加。
者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识
或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的,本发明的真正范围和精神由下面的
权利要求指出。