浙江樟体细胞胚胎发生与植株再生方法

摘要

本发明涉及一种浙江樟体胚发生与植株再生方法，包括：采集浙江樟自由授粉半同胞家系的果实，分离出未成熟合子胚进行体胚发生培养；所述体胚发生培养分为四个阶段：胚性愈伤组织诱导阶段、胚性愈伤组织增殖阶段、体细胞胚成熟阶段和体细胞胚的萌发阶段。本发明首次建立了浙江樟未成熟合子胚的胚性愈伤组织的诱导、培养技术体系，筛选出最佳胚性愈伤组织诱导培养基与增殖培养基，增殖效果良好，为浙江樟的大规模无性繁育提供一种周期短、繁殖率高且成本低廉的方法，也为建立更加高效的浙江樟遗传转化受体体系提供参考。

权利要求

1.一种浙江樟体胚发生与植株再生方法，其特征在于，包括如下步骤：采集浙江樟未成熟果实，剥取未成熟果实幼胚为外植体，接种到胚性愈伤组织诱导培养基进行胚性愈伤组织诱导，将胚性愈伤组织接种到胚性愈伤组织增殖培养基中进行胚性愈伤组织的增殖培养，将增殖后的胚性愈伤组织接种到体细胞胚成熟和萌发培养基进行体细胞胚成熟和萌发培养；

其中，所述的胚性愈伤组织诱导培养基为MS+2,4‑D 0.05 mg/L+6‑BA 2.00 mg/L+CH 2 g/L+AC 2.00 g/L+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂、MS+2,4‑D 0.1 mg/L+6‑BA 0.5 mg/L+CH 1 g/L+AC 1.00 g/L+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂或者MS+2,4‑D 0.2 mg/L+6‑BA 1.0 mg/L+CH 0.5 g/L+AC 2.00 g/L+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂；所述的胚性愈伤组织增殖培养基为MS+2,4‑D 

0.2 mg/L+6‑BA 0.1 mg/L+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+CH 2 g/L+ AC 2.0 g/L；所述的体细胞胚成熟和萌发培养基采用MS+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+CH 2 g/L；

其中，所述的未成熟果实幼胚的子叶胚占种子长度的1:6～1:4。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在未成熟果实幼胚进行体胚发生培养前，还包括对果实进行消毒，然后在无菌的环境下取出合子胚的步骤。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消毒方式为：利用75%的乙醇对浙江樟未成熟果实浸泡30s，再经体积分数0.1%的升汞消毒10～15min后，用无菌水冲洗4～5次。

说明书

浙江樟体细胞胚胎发生与植株再生方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养繁殖技术领域，具体涉及一种浙江樟体胚发生与植株再生的方法。

背景技术

[0002] 浙江樟(Cinnamomum chekiangense)为樟科樟属常绿阔叶大乔木，是我国特有植物和珍稀树种，主要分布在华东地区，在浙江、安徽、江西、福建等地零星或小片分布，资源
数量较少(孙起梦等，2008)。浙江樟材质优良，树干端直，枝叶浓密，姿态优美，鲜叶呈鲜红
色，是优良的用材与绿化观赏树种。同时，浙江樟对烟尘、二氧化硫等污染物的抗性较强，可
释放具有净化空气与保健作用的化学物质，是优良环保树种(浙江植物志编辑委员会，
1993；浙江省乡土树种研究协作组，1989)。然而，因过度砍伐利用，其野生资源日益减少，且
天然植株多数结实少，连年不稳定，表现为已结实的母树可能几年连续不结实，而具体原因
不详，导致浙江樟种苗严重供不应求。虽然扦插繁殖可在一定程度缓解种苗供应问题，但浙
江樟扦插苗存在严重偏冠现象。

[0003] 目前，对于浙江樟的研究多是浙江樟采种、育苗、抗寒性等方面的研究(王年金等，2003；郝日明等，2004；钱伟等，2007；孙起梦等，2008；谢晓金，2005)，目前浙江樟主要依靠
种子繁殖，而浙江樟天然结实率低，且不稳定，限制其大规模育苗生产应用，不能满足造林
需求，同时，种子繁殖的后代容易出现分化，不能完整保留母本的优良特性。因此，建立高效
的浙江樟无性繁殖体系具有重大意义。

[0004] 体细胞胚胎发生是目前最有应用前景的快速繁殖手段。体细胞胚具有数量多、诱导成苗率高、生产速度快、结构完整、遗传特性较稳定、再生植株变异小、其发生和发育途径
更接近自然状态等特点(路佳，2014)。建立浙江樟体细胞胚胎快繁体系，不但可以实现大量
繁殖浙江樟优质种苗，而且对于优良种质资源的保存、繁殖以及遗传改良等研究均具有重
要意义。因此，开展浙江樟体胚发生研究，克服现有技术的不足，是非常有必要的。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种浙江樟体胚发生与植株再生方法，从而建立高效的浙江樟植株再生体系。

[0006] 为了实现上述目的，本发明首先提供一组浙江樟体胚发生与植株再生培养基，其为胚性愈伤组织诱导培养基、胚性愈伤组织增殖培养基和体细胞胚成熟和萌发培养基，所
述的胚性愈伤组织诱导培养基为采用MS基本培养基，附加0.05～0.2mg/L的2,4‑D、0.5～
2.0mg/L的6‑BA、0.5～2.0g/L的水解酪蛋白(CH)以及0.5～2.0g/L的活性炭(AC)；所述的胚
性愈伤组织增殖培养基为采用MS基本培养基，附加0～2.0mg/L的2,4‑D和0～1.0mg/L的6‑
BA；所述的体细胞胚成熟和萌发培养基采用MS基本培养基。

[0007] 其中，所述的胚性愈伤组织诱导培养基优选为MS+2,4‑D 0.05mg/L+6‑BA 2.0mg/L+CH 2.0g/L+AC 2.0g/L、MS+2,4‑D 0.1mg/L+6‑BA 0.5mg/L+CH 1.0g/L+AC 1.0g/L或者MS+
2,4‑D 0.2mg/L+6‑BA 1.0mg/L+CH 0.5g/L+AC 2.0g/L。

[0008] 其中，所述的胚性愈伤组织诱导培养基还包括30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂。

[0009] 其中，所述的胚性愈伤组织增殖培养基优选为MS+2,4‑D 0.2mg/L+6‑BA 0.1mg/L。

[0010] 其中，所述的胚性愈伤组织增殖培养基还包括30g/L的蔗糖，8g/L的琼脂和2g/L的水解酪蛋白。

[0011] 其中，所述的体细胞胚成熟和萌发培养基还包括30g/L的蔗糖，8g/L的琼脂和2g/L的水解酪蛋白。

[0012] 申请人发现，在胚性愈伤组织诱导阶段，适当降低培养基硬度，可以提高胚性愈伤组织的诱导率。在胚性愈伤组织增殖和体细胞胚成熟阶段适当提高培养基硬度可以提高胚
性愈伤组织的增殖和体细胞胚的成熟效果，能减少胚性愈伤组织的褐化和玻璃化，使体细
胞胚更为健壮、畸形胚比例低。

[0013] 其次，本发明还提供一种浙江樟体胚发生与植株再生方法，其包括如下步骤：采集浙江樟未成熟果实，剥取未成熟果实幼胚为外植体，接种到所述的胚性愈伤组织诱导培养
基进行胚性愈伤组织诱导，将胚性愈伤组织接种到所述的胚性愈伤组织增殖培养基中进行
胚性愈伤组织的增殖培养，将增殖后的胚性愈伤组织接种到所述的细胞胚成熟和萌发培养
基进行细胞胚成熟和萌发培养。

[0014] 本发明所述的方法，在对未成熟果实幼胚进行体胚发生培养前，还包括对果实进行消毒，然后在无菌的环境下取出幼胚的步骤。

[0015] 其中，所述消毒方式为：利用75％(w/v)的乙醇对浙江樟未成熟果实浸泡30s，再经体积分数0.1％(w/v)的升汞消毒10min，然后用无菌水冲洗4～5次。

[0016] 其中，所述的未成熟果实幼胚的子叶胚占种子长度的1:6～1:4。

[0017] 本发明提供的方法，是专门针对浙江樟天然结实率低，缺乏高效扦插、组织培养等无性再生扩繁体系，现有种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林需要的现状，寻找一种浙
江樟优良无性系的体细胞胚胎发生与植株再生的技术，为浙江樟濒危资源的保护与利用提
供了理论依据及技术支持。在浙江樟体细胞胚胎发生的诱导阶段，以其未成熟合子胚为外
植体，在果实发育处于阶段II，即子叶胚占种子长度的1:6～1:4时，胚性愈伤组织的诱导率
最高；通过筛选不同诱导培养基对胚性愈伤组织诱导的影响，获得了浙江樟胚性愈伤组织
诱导的最佳培养基，诱导率最高可达40.56％；通过对增殖培养基的筛选，获得了胚性愈伤
组织的最佳增殖培养基，增殖倍数可达2.31；在体胚成熟与萌发培养中，使用不添加植物激
素的MS基本培养基可使体胚正常生长，体胚分化能力最高达118.03个/克，体胚萌发率平均
44.00％；植株移栽成活率为23.33％；繁殖潜能可达13613株/克·年。而且，通过体细胞胚
胎发生途径生产的浙江樟种苗，因体细胞胚胎发生过程与合子胚的发育阶段类似，获得的
体细胞胚胎与合子胚一样，体细胞胚胎萌发后获得的小苗生理年龄小，主根性强，且茎直
立，可有效避免扦插繁殖可能引起的偏冠现象。

附图说明

[0018] 图1为浙江樟的胚性愈伤组织。

[0019] 图2为浙江樟的成熟体细胞胚胎。

[0020] 图3为浙江樟的体细胞胚胎萌发的植株。

具体实施方式

[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0022] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0023] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0024] 实施例1

[0025] 分离出未成熟合子胚：于8月底采集杭州植物园生长健壮、无病虫害的优良浙江樟单株的未成熟果实。将外植体放置于流动的自来水下冲洗2h。随后在无菌室内的超净工作
台上用75％(w/v)酒精处理30s，再经体积分数0.1％(w/v)的升汞消毒10～15min，然后用无
菌水冲洗4～5次。无菌状态下，剥去种皮，取出未成熟合子胚，进行下一阶段的胚性愈伤诱
导实验。

[0026] 实施例2

[0027] 胚性愈伤组织诱导阶段：将实施例1得到的未成熟合子胚进行胚性愈伤组织诱导，采用MS培养基，附加激素浓度分别为2,4‑D0.05～0.2mg/L和6‑BA 0.5～2.0mg/L，添加
2.0g/L的CH和2.0g/L的AC，培养基中含30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂。灭菌前将培养基的pH值
调至5.8，121℃、压力101kp，高温、高压灭菌20分钟，培养温度为24±1℃，黑暗条件培养，至
诱导出胚性愈伤组织。

[0028] 观察不同发育阶段浙江樟未成熟果实幼胚的内部形态，将果实发育分为四个阶段，即第一个阶段胚与种子比例为<1:6，第二个阶段为1:6～1:4，第三个阶段1:4～1:2，第
四个阶段分别为>1:2。

[0029] 表1不同发育时期果实的胚性愈伤组织诱导率

[0030]发育阶段 I II III IV
诱导率(％) 10.00±8.16 43.33±12.47 26.67±12.47 23.33±4.71

[0031] 由表1可以看出，在果实发育处于阶段II，即子叶胚占种子长度的1:6～1:4时，胚性愈伤组织的诱导率最高。

[0032] 表2不同培养基对于浙江樟胚性愈伤组织诱导的影响

[0033]

[0034] 未成熟合子胚接入上述培养基后1周左右开始启动，合子胚子叶膨大。4周以后，有的子叶褐变，而有的则在两片子叶的结合处发生黄色颗粒状、质地较疏松的胚性愈伤组织。
这种愈伤组织在体视镜下观察，多为球形胚(图1)。

[0035] 不同培养基对于浙江樟胚性愈伤组织诱导的影响如表2所示。从表2中可以看出，最适诱导培养基为MS+2,4‑D 0.05mg/L+6‑BA2.0mg/L+CH 2.0g/L+AC 2.0g/L。

[0036] 实施例3

[0037] 胚性愈伤组织的增殖阶段：将实施例2得到的胚性愈伤组织进行增殖，采用MS培养基，附加激素如表3所示，添加2.0g/L的CH，培养基中含30g/L的蔗糖和8g/L的琼脂，其他培
养条件均与诱导阶段相同，胚性愈伤组织的生长量如下表3所示。

[0038] 表3不同培养基对胚性愈伤组织生长量的影响

[0039]

[0040] 从表3可以看出：在MS基本培养基上添加2,4‑D 0.2mg/L和6‑BA 0.1mg/L时，胚性愈伤组织的增殖倍数最高，增殖培养后的胚行愈伤组织颜色嫩黄，质地松散，颗粒状结构，
高于这个浓度或低于这个浓度时，增殖倍数下降。因此，最适增殖培养基为：MS+2,4‑D 
0.05mg/L+6‑BA 2.0mg/L+CH 2.0g/L+AC 2.0g/L。

[0041] 表4培养天数对胚性愈伤组织增殖的影响

[0042]

[0043] 由表4可以看出，使用此种方式胚性愈伤组织的增殖倍数比较稳定，不会出现较大波动，在增殖培养30天时，增殖倍数为2.31，此后增殖速率略为平稳，并且胚性愈伤组织开
始出现褐化的现象，因此培养的继代周期确定为30天。

[0044] 实施例4

[0045] 体细胞胚的成熟阶段：将实施例3得到的胚性愈伤组织进行体细胞胚的成熟培养，采用MS基本培养基，添加2g/L的CH，培养基中附加30g/L的蔗糖和8g/L的琼脂，其他培养条
件均与诱导阶段相同。

[0046] 经过成熟培养后，体细胞胚依次发育经过球形胚、心形胚、鱼雷胚，最终形成子叶胚(图2)，正常子叶胚通常具有2片子叶。使用此种方式成熟培养60天后，体胚分化能力达
118.03个/克。

[0047] 实施例5

[0048] 体细胞胚的萌发阶段：将实施例4得到的成熟体细胞进行萌发培养，采用MS基本培养基，添加2g/L的CH，培养基中附加30g/L的蔗糖和8g/L的琼脂，光照培养，其他培养条件均
与诱导阶段相同。

[0049] 1个月后观察到体细胞胚逐渐变绿，下胚轴逐渐伸长，根端出现突起，片子叶之间有绿色的芽出现。继续培养，可观察到子叶完全变成绿色，体胚基部伸长，发育成胚根，子叶
间的芽点萌发。培养90天后，体胚的萌发率达58.0％。

[0050] 正常萌发的体胚再生植株经过炼苗，可移栽入灭菌的基质中(图3)。体胚苗移栽约15d后发出新芽，检查根部有新根长出即移栽成活，移栽成活率为23.33％，成活植株长势较
好且生长一致。根据此种方法进行浙江樟的扩繁，繁殖潜能可达13613株/克·年。

[0051] 本发明中，针对体细胞胚胎发生的各个阶段都有明确的培养基方案、激素和其他营养物质的组合。浙江樟体胚分化能力最高达118.03个/克，体胚萌发率平均44.00％；植株
移栽成活率为23.33％；繁殖潜能高达13613株/克·年。

[0052] 对比例1

[0053] 于5月中旬，分别在3‑5年生和30‑50年生母树上采集当年生半木质化枝条，顶芽和侧芽分开作为插穗，修剪成带2个腋芽的茎段，并保留一叶，用200mg/L IBA处理1小时后扦
插。2个月统计扦插成活率，顶芽和侧芽作为插穗时生根率差异不显著，在58％—60％间，待
苗进一步长至20cm时统计其偏冠率。

[0054] 插穗采集位置和母树年龄对偏冠都有很大的影响，即便采用3～5年生实生苗的顶芽为插穗其偏冠率高达72.80％，而使用体胚苗进行繁殖的偏冠程度则为0。因此相比较扦
插繁殖，使用体胚苗进行扩繁的手段还是十分具有优势的。

[0055]

[0056] 采用本发明提供的技术，为浙江樟的工厂化无性繁殖育苗提供了一种周期短、繁殖率高、成本低廉的方法。突破了浙江樟天然结实率低，缺乏高效扦插、组织培养等无性再
生扩繁体系，现有种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林需要的限制，同时为林木大规模
无性繁殖、人工种子制备、优质种质资源保存与繁殖以及遗传转化等方面提供重要的方向
与理论技术支持。而且，通过体细胞途径生产的浙江樟种苗，因体胚发生过程与合子胚的发
育阶段类似，获得的体胚与合子胚一样，体胚萌发后获得的小苗生理年龄小，主根性强，且
茎直立，可有效避免扦插繁殖可能引起的偏冠现象。

[0057] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰
也应视为本发明的保护范围。