一种紫外诱变型盐单胞菌突变株及其诱变方法和应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种紫外诱变型盐单胞菌突变株及其诱变方法和应用，本发明是利用紫外线多轮循环照射技术将从柴达木盆地小柴旦盐湖分离纯化获得的一株产四氢嘧啶的盐单胞菌菌株进行照射诱变，得到能有效提高菌株Ectoine产量的盐单胞菌突变株，利用本发明诱变方法得到的突变株Ectoine产量大幅提高(增幅290％)，较母株提高2.9倍，而且成本低、操作简单、无污染以及对环境不会构成危害，在提高菌株Ectoine产量方面具有很好的发酵生产和工业应用潜力。

权利要求

1.一种紫外诱变型盐单胞菌突变株Halomonas campaniensis HU09‑32 ，于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019777。

2.根据权利要求1所述的紫外诱变型盐单胞菌突变株Halomonas campaniensis HU09‑

32在四氢嘧啶发酵生产中的用途。

说明书

一种紫外诱变型盐单胞菌突变株及其诱变方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种紫外诱变型盐单胞菌突变株及其诱变方法和应用。

背景技术

[0002] Ectoine(1,4,5,6‑tetrahydro‑2‑methyl‑4‑pyrimidnecarboxylic acid,C6H10N2O2)即1,4,5,6‑四氢‑2甲基‑4‑嘧啶羧酸，是一种氨基酸衍生物。具有增强酶活性、稳定DNA结构及保护蛋白质的功能。Ectoine已被广泛地应用于消化道疾病、干眼综合征、过敏性鼻炎、皮肤创伤与保健美容等生物医学领域，其研发产品涉及消化道药物、滴眼液、鼻喷剂、皮肤创伤药及新型生物化妆品等。公告号为CN107417669A的发明专利公开了一种3‑(1H‑吲唑)‑四氢嘧啶‑2‑酮类Ectoine衍生物制备方法，并发现其在保护心血管功能方面具有极高应用价值。公告号为CN109431870A的发明专利公开了一种含四氢嘧啶护手霜及制备方法，具有手部皮肤皲裂愈合率高、淡化色斑效果明显及加工工艺简单等优点。

[0003] 目前，Ectoine大规模生产主要以微生物发酵为主，模式菌株主要有盐单胞菌属(Halomonas)与色盐杆菌属(Chromohalobacter)，如H.elongata(DSM 2581T、1A01717与BK‑AG18)和C.salexigens DSM 3043T等。相关研究主要集中于菌株优选和发酵工艺与条件的优化。Ectoine的发酵工艺主要包括实验室条件下的单批次发酵(试管液体培养、浅层液体培养、摇瓶培养与台式发酵罐等)，中试或工业级大规模生产(分批发酵罐法、流加发酵罐法与细菌挤奶Bacterial milking技术)等，或采用不同发酵方式联用，以提高Ectoine产量。针对Ectoine积聚菌株的研究，主要集中在野生菌株的分离筛选、基因工程菌株的构建(生物合成Pathway基因和ectABC操纵子等)、模式菌株代谢流量控制发酵(Metabolic overflow，包括Carbon‑limited fed‑batch cultures、Metabolic flux analysis与Metabolic flux distribution)及优化。公告号为CN109182236A的专利通过基因敲除技术，导入Ectoine合成基因，获得一株产Ectoine大肠杆菌，经过连续发酵20～30h后，Ectoine产量达到2.5～3.5g/L。公告号CN108441460A专利对大肠杆菌基因组进行整合，导入ectABCD基因簇，重构了羟基四氢嘧啶合成途径，在5L发酵罐发酵培养36～40h后，羟基四氢嘧啶产量达到17～24g/L。公告号CN107142234A专利通过导入ectABC基因，获得重组谷氨酸棒杆菌，经分批补料发酵发酵72h，Ectoine产量达到12g/L。

[0004] 以上不同的研究方法，各具优劣，其Ectoine总体产量约提高30～79％。原始菌株的生产能力可通过物理(紫外诱变)或化学(硫酸二乙酯和甲基磺酸乙酯等)突变方式大幅度提高。其中，紫外诱变(UV mutagenesis)是一种经典微生物诱变方法，菌株对诱变因素极具敏感性，且正向突变率高，能有效提高生产菌株的产量。至此，寻找高效的能实际应用于菌株优化的选育方法，为本发明技术的初衷，在此基础上才能为Ectoine大规模发酵生产提供新的菌源，提高Ectoine的发酵生产效率。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对上述现有技术存在的问题，如基因工程技术在构建工程菌株过程中存在高研究成本，易造成生物环境污染以及工程菌稳定性不确定等问题，本发明人对一种高产量生成Ectoine的菌株进行了大量充分的研究，提供一种紫外诱变型盐单胞菌突变株及其诱变方法，利用紫外线多轮循环照射以提高菌株的Ectoine产量，并对突变菌Ectoine产量进行稳定性测定。

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种紫外诱变型盐单胞菌突变株(Halomonas campaniensis HU09‑32)，于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019777，保藏单位地址为中国武汉。

[0007] 所述盐单胞菌突变株是由产四氢嘧啶的盐单胞菌菌株(Halomonas campaniensis XH26)经紫外线照射诱变得到，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019776，于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉。

[0008] 本发明的第二个目的是提供一种紫外诱变型盐单胞菌突变株的诱变方法，所述紫外诱变型盐单胞菌突变株的诱变方法包括以下步骤：

[0009] (1)将盐单胞菌接种于100ml液体培养基中，30～35℃富集培养20～24h，制成菌落8
总数为10CFU/mL的菌悬液；

[0010] (2)将步骤(1)菌悬液稀释，取5ml稀释液置于培养皿中，搅拌震荡，并在紫外灯下照射40～50s，置于培养箱在30～35℃下培养40～48h，得到突变菌株；

[0011] (3)选取步骤(2)得到的长势良好、菌落边缘粘稠且不易拉丝的突变菌株，接种于发酵培养基中在30～35℃下发酵培养40～48h，测定四氢嘧啶的产量；

[0012] (4)筛选四氢嘧啶产量最高的突变株作为下一轮紫外诱变的菌株进行步骤(2)和步骤(3)，连续进行多轮循环操作，筛选得到四氢嘧啶产量最高的菌株，优选地，所述循环次数为9轮。

[0013] 进一步的，所述步骤(1)中的盐单胞菌是从柴达木盆地小柴旦盐湖分离纯化获得的一株产四氢嘧啶的菌株。其分离纯化方法如下，将水样于含15％NaCl的无菌盐水中进行梯度稀释，将稀释液涂布于平板上，37℃培养2～3天，待大量菌体长出后，挑取菌落特征不同的单个菌落，重新活化培养，进行分区划线，挑取单个菌落增菌培养，重复多次直至获得纯菌，‑20℃保存，备用。

[0014] 进一步的，所述步骤(1)中的液体培养基的组成为：50.0g/L NaCl，20.0g/L MgSO4.7H2O，3.0g/L柠檬酸钠，2.0g/L KCl，0.2g/L CaCl2，10.0g/L细菌蛋白胨和2.0g/L酵母抽提物，pH为7.5。

[0015] 进一步的，所述步骤(3)中的发酵培养基的组成为：60.0g/L NaCl，25.0g/L MgSO4.7H2O，55.0g/L KCl，6.5g/L L‑谷氨酸钠，7.5g/L酶水解酪素，3.0g/L柠檬酸钠，0.2g/L无水CaCl2，2.0g/L酵母提取物，pH为8。

[0016] 进一步的，所述步骤(2)中紫外灯功率为25w，照射距离30cm。

[0017] 本发明的第三个目的是提供一种紫外诱变型盐单胞菌突变株的应用，可用于四氢嘧啶发酵生产。四氢嘧啶的发酵工艺主要包括实验室条件下的单批次发酵(试管液体培养、浅层液体培养、摇瓶培养与台式发酵罐等)，中试或工业级大规模生产(分批发酵罐法、流加发酵罐法与细菌挤奶Bacterial milking技术)等，或采用不同发酵方式联用，以提高四氢嘧啶产量。本发明中的紫外诱变型盐单胞菌突变株均可用于上述发酵工艺，进行四氢嘧啶的工业化生产。

[0018] 与现有技术相比，本发明提供的一种紫外诱变型盐单胞菌突变株具有以下效果：

[0019] 研究显示，与具有生成Ectoine能力的母株相比，本申请突变株在Ectoine合成方面表现出较高水平，突变菌株Ectoine合成量高(1351.09±17.69mg/L)，该突变株Ectoine产量大幅提高(增幅290％)，较母株提高2.9倍

[0020] 其次，本发明提供的紫外诱变型盐单胞菌突变株的诱变方法，该技术不但能有效提高突变株Ectoine产量，说明该方法在提高菌株Ectoine产量方面具有很好的发酵生产和工业应用潜力。而且成本低、操作简单、无污染以及对环境不会构成危害。

[0021] 综上所述，通过本发明方法诱变选育获得的突变菌株Ectoine产量高，且菌株稳定性好。利用该诱变方法能有效提高菌株Ectoine产量，且成本较低，获得的突变株应用于批量生产后成本应还会大幅度降低。操作简单、无污染、不会对生物环境构成危害，可用于嗜盐菌、乳酸杆菌、酵母菌及曲霉菌等微生物的诱变选育，以提高微生物产物合成量。

[0022] 本发明生物样品保藏请求人为青海大学医学院基础医学研究中心，地址为青海省西宁市宁大路251号，邮编810016。

附图说明

[0023] 图1紫外线照射时间对菌株的致死率关系曲线；

[0024] 图2突变菌株电镜形态特征；

[0025] 图3是盐单胞菌母株与本发明盐单胞菌突变株菌落电镜形态比较。

具体实施方式

[0026] 为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0027] 本发明盐单胞菌突变株是由产四氢嘧啶的盐单胞菌菌株经紫外线照射诱变得到，诱变方法包括以下步骤：

[0028] (1)接种

[0029] 将从柴达木盆地小柴旦盐湖分离纯化获得的一株产四氢嘧啶的菌株盐单胞菌接8
种于100ml液体培养基中，30～35℃富集培养20～24h，制成菌落总数为10 CFU/mL的菌悬液，液体培养基的组成为：50.0g/L NaCl，20.0g/L MgSO4.7H2O，3.0g/L柠檬酸钠，2.0g/L KCl，0.2g/L CaCl2，10.0g/L细菌蛋白胨和2.0g/L酵母抽提物，调节pH为7.5。盐单胞菌菌株的分离纯化为，将水样于含15％NaCl的无菌盐水中进行梯度稀释，将稀释液涂布于平板上，
37℃培养2～3天，待大量菌体长出后，挑取菌落特征不同的单个菌落，重新活化培养，进行分区划线，挑取单个菌落增菌培养，重复多次直至获得纯菌，‑20℃保存，备用。

[0030] (2)液体培养

[0031] 将步骤(1)菌悬液稀释，取5ml稀释液置于培养皿中，搅拌震荡，并在25w紫外灯下照射40～50s，控制照射距离为30cm，照射完成后置于培养箱在30～35℃下培养40～48h，得到突变菌株；

[0032] (3)发酵培养

[0033] 选取步骤(2)得到的长势良好、菌落边缘粘稠且不易拉丝的突变菌株，接种于发酵培养基中，发酵培养基的组成为：60.0g/L NaCl，25.0g/L MgSO4.7H2O，55.0g/L KCl，6.5g/L L‑谷氨酸钠，7.5g/L酶水解酪素，3.0g/L柠檬酸钠，0.2g/L无水CaCl2，2.0g/L酵母提取物，pH为8，在30～35℃下发酵培养40～48h，测定四氢嘧啶的产量；

[0034] (4)诱变

[0035] 筛选四氢嘧啶产量最高的突变株作为下一轮紫外诱变的菌株进行步骤(2)和步骤(3)，连续进行多轮循环操作，筛选得到四氢嘧啶产量最高的菌株。

[0036] 实施例1

[0037] (1)接种

[0038] 将从柴达木盆地小柴旦盐湖分离纯化获得的一株产四氢嘧啶的菌株盐单胞菌接种于100ml由50.0g/L NaCl，20.0g/L MgSO4.7H2O，3.0g/L柠檬酸钠，2.0g/L KCl，0.2g/L CaCl2，10.0g/L细菌蛋白胨和2.0g/L酵母抽提物液体培养基中，调节pH为7.5，35℃富集培8
养24h，制成菌落总数为10CFU/mL的菌悬液。

[0039] (2)液体培养

[0040] 将步骤(1)得到菌悬液稀释，取5ml稀释液置于培养皿中，搅拌震荡，并在25w紫外灯下照射50s，控制照射距离为30cm，照射完成后置于培养箱在35℃下培养48h，得到突变菌株；

[0041] (3)发酵培养

[0042] 选取步骤(2)得到的长势良好、菌落边缘粘稠且不易拉丝的突变菌株，接种于由60.0g/L NaCl，25.0g/L MgSO4.7H2O，55.0g/L KCl，6.5g/L L‑谷氨酸钠，7.5g/L酶水解酪素，3.0g/L柠檬酸钠，0.2g/L无水CaCl2和2.0g/L酵母提取物组成的发酵培养基中，发酵培养基的组成为：，pH为8，在30～35℃下发酵培养40～48h，测定四氢嘧啶的产量；

[0043] (4)诱变筛选

[0044] 筛选四氢嘧啶产量最高的突变株作为下一轮紫外诱变的菌株进行步骤(2)和步骤(3)，连续进行9轮循环操作，筛选得到四氢嘧啶产量最高的菌株。

[0045] 实施例2

[0046] (1)接种

[0047] 将从柴达木盆地小柴旦盐湖分离纯化获得的一株产四氢嘧啶的菌株盐单胞菌接种于100ml由50.0g/L NaCl，20.0g/L MgSO4.7H2O，3.0g/L柠檬酸钠，2.0g/L KCl，0.2g/L CaCl2，10.0g/L细菌蛋白胨和2.0g/L酵母抽提物液体培养基中，调节pH为7.5，30℃富集培8
养，制成菌落总数为10CFU/mL的菌悬液。

[0048] (2)液体培养

[0049] 将步骤(1)得到菌悬液稀释，取5ml稀释液置于培养皿中，搅拌震荡，并在25w紫外灯下照射50s，控制照射距离为30cm，照射完成后置于培养箱在30℃下培养40h，得到突变菌株；

[0050] (3)发酵培养

[0051] 选取步骤(2)得到的长势良好、菌落边缘粘稠且不易拉丝的突变菌株，接种于由60.0g/L NaCl，25.0g/L MgSO4.7H2O，55.0g/L KCl，6.5g/L L‑谷氨酸钠，7.5g/L酶水解酪素，3.0g/L柠檬酸钠，0.2g/L无水CaCl2和2.0g/L酵母提取物组成的发酵培养基中，调节pH为8，在35℃下发酵培养48h，测定四氢嘧啶的产量；

[0052] (4)诱变筛选

[0053] 筛选四氢嘧啶产量最高的突变株作为下一轮紫外诱变的菌株进行步骤(2)和步骤(3)，连续进行9轮循环操作，筛选得到四氢嘧啶产量最高的菌株。

[0054] 实施例3：盐单胞菌紫外照射诱变试验

[0055] 步骤1.将盐单胞菌(Halomonas campaniensis XH26)接种于100mL由50.0g/L NaCl，20.0g/L MgSO4.7H2O，3.0g/L柠檬酸钠，2.0g/L KCl，0.2g/L CaCl2，10.0g/L细菌蛋白胨和2.0g/L酵母抽提物组成的液体培养基中，液体培养基pH为7.5，35℃富集培养24h后，8 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6
制成10CFU/mL菌悬液，并依次稀释为10 、10 、10 与10 浓度，各取5mL稀释液置于90mm的培养皿中，放入无菌磁力搅拌子，后置于磁力搅拌器上，在紫外灯下(功率25W，照射距离
30cm，提前预热30min)照射，取照射后的菌悬液置于35℃培养箱培养48h。

[0056] 紫外线照射时间对菌株的致死率和正向突变率试验：

[0057] 将上述培养后的盐单胞菌在紫外灯下(功率25W，照射距离30cm，提前预热30min)分别照射10～70s(间隔10s)。取照射后的菌悬液0.1mL均匀涂布平板(每梯度3～5个)，以未经照射的菌悬液为对照，后将平板置于35℃培养箱，培养48h计数致死率和正突变率。

[0058] 正突变率(％)＝正突变株数/诱变后菌落数×100；

[0059] 致死率(％)＝(对照CFU‑处理CFU)/对照CFU×100。

[0060] 紫外线照射时间对菌株的致死率和正向突变率的关系如图1所示，当紫外照射时间为50s后菌株致死率达到80％以上，70s以后菌株致死率达到了100％左右。随紫外照射时间的延长，菌株的正突变率也在增加。由于短时间照射不能达到较稳定的突变状态，按照诱变剂量选择的一般原则，致死率为70％～80％的剂量，菌株突变性可以保持在较稳定的水平。当紫外线处理50s时致死率为75％，因此本发明选取50s为最佳诱变时间。

[0061] 步骤2.紫外诱变后选取菌落较大、长势良好、菌落边缘粘稠且不易拉丝的突变菌株，接种于由60.0g/L NaCl，25.0g/L MgSO4.7H2O，55.0g/L KCl，6.5g/L L‑谷氨酸钠，7.5g/L酶水解酪素，3.0g/L柠檬酸钠，0.2g/L无水CaCl2和2.0g/L酵母提取物组成的发酵培养基中培养，发酵条件为培养基灭菌参数为121℃，15分钟；发酵pH 8，OD600 2.199，发酵温度35℃，摇床速度160rpm，发酵时间48h，发酵结束后通过高效液相色谱法(HPLC)测定Ectoine产量。

[0062] 步骤3.筛选四氢嘧啶产量最高的突变株作为下一轮紫外诱变的菌株进行上述步骤，连续进行多轮循环操作，筛选得到四氢嘧啶产量最高的菌株即为本发明突变菌株。具体操作为，将每轮诱变后的突变菌连续培养3次(2天/次)，测定Ectoine产量确定其稳定性。Ectoine提取方法：将培养12h的菌株扩大培养到250mL锥形瓶中，放入摇床连续培养48h后测OD600，然后用50mL的离心管集菌两次，12 000rpm离心5min，弃上清，用无菌水快速洗涤两次，12 000rpm简短离心，弃上清；加入99％的乙醇10mL，用组织研磨器高速研磨3～4min，
12 000rpm离心5min，取出上清至10mL烧杯中，放入60℃烘干箱中烘干4h；再加入2mL超纯水，重溶Ectoine后经0.22μm水系微孔过滤器过滤，即Ectoine提取液。

[0063] HPLC检测条件：乙腈为流动相，检测波长210nm，流速为1.0mL/min，柱压3.486～4.761MPa，柱温30℃，胞内Ectoine抽提液上样量10μL。采用9轮循环紫外照射进行进行诱变选育，通过连续培养检测Ectoine产量，筛选Ectoine产量最高突变菌株，作为下一轮紫外诱变的出发菌株，依次重复步骤1与步骤2，连续进行9轮紫外诱变筛选，结果显示，随着诱变次数的增加，诱变菌株表现出生长速度降低、Ectoine产量减少及菌落形态改变等现象，因此本发明选取9轮紫外诱变选育作为本发明诱变次数。

[0064] 实施例4：盐单胞菌(Halomonas campaniensis XH26)与本发明突变菌株形态学与生物化学鉴定

[0065] 将盐单胞菌菌株在由50.0g/L NaCl，20.0g/L MgSO4.7H2O，3.0g/L柠檬酸钠，2.0g/L KCl，0.2g/L CaCl2，10.0g/L细菌蛋白胨和2.0g/L酵母抽提物组成的OSM培养基上培养，如图2A菌落形态呈圆形，形态适中，易粘连，乳白色，隆起，湿润状，边缘规则，不透明。
电镜下XH26菌体形态呈长杆状(图3B，C)，略带弯曲，菌体的长度为(3～5)μm×(0.5～0.8)μm，两端圆润，无鞭毛。见图2，7株突变菌通过电镜观察菌体形态均呈椭圆形杆状，略带弯曲，菌体的长度为(2～4)μm×(0.5～0.8)μm，两端圆润，无鞭毛。其中，突变菌株与XH26菌株菌落相似，但是突变菌株菌落边缘不规则，呈向外侵袭状，透明(见图3D)。

[0066] 在相同培养条件下，突变菌株较XH26菌株生长速度快，菌落较大。电镜下观察，突变菌株与XH26菌株菌体形态相近(见图3C，F)，但是突变菌株长度明显变短，随着菌体长度的减短，其弯曲度不再明显。通过微量生化反应板进行生化实验(糖类发酵实验、同化碳源试验、蛋白质和氨基酸代谢试验及硝酸盐还原等试验)，对菌株进行生化特性鉴定，鉴定结果见表1。

[0067] 表1生理生化鉴定表

[0068]

[0069]

[0070] 实施例5：盐单胞菌突变菌株Ectoine产量与稳定性测定

[0071] 将最终筛选出的突变菌株接种于固体培养基上，连续转接培养40天(2天/次)。与初代对比，观察突变菌株每次转接后的生长特性，并接入发酵培养基中，按照实施例1中培养条件进行培养(每组样品设置6组平行)后，测定发酵液的Ectoine产量，进行突变菌稳定性测定。

[0072] 经过9轮循环诱变，共获得272株突变菌，最终筛选出7株Ectoine产量较高的突变菌株，见表2，诱变菌株1、诱变菌株2及诱变菌株7的Ectoine产量相当，分别为原始菌株的2.1、2.4及2.1倍，诱变菌株3、诱变菌株5与诱变菌株6的Ectoine产量分别为1154.29mg/L、
1165.16mg/L与1202.98mg/L，其中诱变菌株4的Ectoine产量最高，达到1351.09mg/L为原始菌株的2.9倍，具有显著差异(P<0.05)。因此，选取诱变菌株4作为本发明的最终菌株。

[0073] 表2紫外诱变突变菌株Ectoine产量

[0074]菌株 Ectoine含量 增长率 细胞干重
原始XH26 456.82±15.72 ‑ 0.71±0.04
诱变菌株1 963.96±14.11 210 0.68±0.04
诱变菌株2 1097.02±17.23 240 0.71±0.03
诱变菌株3 1154.29±13.84 250 0.72±0.04
诱变菌株4 1351.09±17.69 290 0.72±0.03
诱变菌株5 1165.16±19.05 250 0.71±0.03
诱变菌株6 1202.98±18.16 260 0.75±0.04
诱变菌株7 993.36±18.47 210 0.72±0.03

[0075] 表3突变株遗传稳定性的测定

[0076]

[0077]

[0078] 可见，在本发明实施例3和5的基础上筛选获得的突变菌株，其Ectoine产量高(1351.09±17.69mg/L)。与现有技术的其他菌相比，Ectoine产量在同一个水平级上。并且，本发明经过连续培养(40天)，其Ectoine的产量表现出良好的稳定性(见表3)，没有恢复亲本菌株的迹象，明显优于原始菌株，显示出很好的生产和应用前景。

[0079] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。