一株粘质沙雷氏菌SZ201及其应用

摘要

本发明公开了一株粘质沙雷氏菌SZ201及其应用，该粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SZ201已于2019年8月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019597，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，所述的粘质沙雷氏菌SZ201应用于烤烟生产，可有效提高烤烟植株及叶片钾吸收量，降低打顶期后植株钾素回流量，有利于提升烟叶品质，因而作为烤烟专用生物有机肥优良生产菌株，应用前景好。

权利要求

1. 一株粘质沙雷氏菌SZ201，其特征在于：粘质沙雷氏菌SZ201的分类命名为：粘质沙雷氏菌，拉丁学名为：Serratia marcescens，已于2019年8 月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019597，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路

299号武汉大学。

2.根据权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌SZ201，其特征在于：粘质沙雷氏菌SZ201的

16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌SZ201，其特征在于：粘质沙雷氏菌SZ201为小杆状，革兰氏阴性，无芽孢，有鞭毛，无荚膜。

4.根据权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌SZ201，其特征在于：粘质沙雷氏菌SZ201在牛肉膏蛋白胨培养基上培养48 h，菌落呈红色，性状为圆形或不规则，菌落直径2～3 mm，边缘整齐，表面湿润、光滑。

5.权利要求1所述粘质沙雷氏菌SZ201的应用，其特征在于：将粘质沙雷氏菌SZ201应用于烤烟生产，提高烤烟叶片的钾含量。

6.权利要求1所述粘质沙雷氏菌SZ201的应用，其特征在于：将粘质沙雷氏菌SZ201菌剂、或其培养液应用于烤烟生产，提高烤烟叶片的钾含量。

7.权利要求1所述粘质沙雷氏菌SZ201的应用，其特征在于：将粘质沙雷氏菌SZ201用于制备提高烤烟叶片钾含量的生物制剂，该生物制剂包含粘质沙雷氏菌SZ201粉剂，或其培养液。

说明书

一株粘质沙雷氏菌SZ201及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物领域，具体的说，是一株粘质沙雷氏菌SZ201及其应用。

背景技术

[0002] 烟草（Nicotiana tabacum L）是我国重要的经济作物，在国民经济发展中占有重要地位，也是山区烟农增收、农村脱贫致富的重要特色产业之一。2018年，我国烟草行业实现工商税利总额11500亿元。烟叶既是卷烟的原料，烟叶中所含的烟碱、茄尼醇和尼古丁等大量天然化学物质，又是优质的化工和医药原料，因而烟草在全世界大面积种植，但如何稳定和提高烤烟质量，仍然是亟待解决的问题。

[0003] 钾是植物生长发育所必须的三大营养元素之一，在植物的生长发育和代谢过程中具有重要作用，能够作为多种酶的活化剂，增强植物对氮素的利用，促进植物体内同化物如蛋白质、糖类的合成与转运，参与细胞渗透调节，增强植物的光合作用，增强植物的抗逆性，同时作物的品质密切相关。植物缺钾会导致作物生长缓慢，叶片沿叶缘出现黄色或呈烧焦状，根系发育不全。

[0004] 钾是烟草植株生长需求量最大的元素，通常为氮素需求量的1.4倍、磷素需求量的3.5倍。而且，钾是公认的烟草品质元素，对提高烟叶可用性起着重要作用。国际上，优质烟叶平均钾含量大于2%，而我国大部分烟区烟叶的钾含量平均值为1.8%，低于优质烟叶钾含量国际标准。因此，烟叶钾含量偏低已成为制约我国烟草品质，尤其是烤烟品质的一个重要因子。研究发现，受烤烟品种养分吸收特性的影响，进入打顶期后大多数烤烟品种叶片中钾含量呈现大幅下降趋势，是影响烤烟品质的提升的重要因素。生产上常见的应对措施一是选育富钾基因型烤烟品种，二是在后期增施或追施化学钾肥。但若长期过量施用化肥，既增加了生产成本，又引起土壤结构变差，破坏土壤微生物群落结构和功能多样性，还由于养分流失造成面源污染发生。为此，2016年农业农村部提出了“农药化肥双减”计划；2017年起实施了《开展果菜茶有机肥替代化肥行动》案。大力推广有机肥和生物有机肥使用，减少化肥使用量，是国家十三五规划中的重要内容之一。

[0005] 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）又称灵杆菌，产生鲜红色素，广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群。研究表明，粘质沙雷氏菌具有多种生物活性，越来越受到研究者的重视。检索中国专利公布网后可知，国家专利局近年来已授权了与粘质沙雷氏菌有关的发明专利32件，有33件处于实审状态，这些发明专利的内容主要集中于粘质沙雷氏菌用于发酵生产灵杆菌素、分子生物学研究材料、发酵液研发抗癌药物、作物病原拮抗菌、作物促生菌、有机污染物降解菌、土壤重金属修复菌等方面，但尚未见到用粘质沙雷氏菌生产生物有机肥，降低烤烟植株钾素回流，促进烤烟钾素吸收，从而提高烤烟叶片钾含量，提升烤烟品质的研究报道和专利技术。

发明内容

[0006] 本发明针对现有我国烤烟叶片钾含量低的技术难题，提供了一株粘质沙雷氏菌SZ201，该菌株具有优良的促进烤烟叶片钾素吸收的作用，能有效降低打顶期后烤烟植株的钾素回流，因此，本发明还提供了该菌株在提高烤烟叶片钾含量的应用，可以促进烤烟叶片中的钾含量提升，进而提升烟叶品质。

[0007] 本发明通过下述技术方案实现：

[0008] 本发明从四川省崇州市桤泉镇四川农业大学现代农业研发基地的水稻田中采集还田试验的小麦秸秆，通过分离、纯化得到了粘质沙雷氏菌SZ201。粘质沙雷氏菌SZ201为小杆状，革兰氏阴性，无芽孢，有鞭毛，无荚膜。在牛肉膏蛋白胨培养基上培养48 h，菌落呈红色，性状为圆形或不规则，菌落直径2～3 mm，边缘整齐，表面湿润、光滑。

[0009] 提取所述的菌株SZ201的总DNA，扩增16S rDNA片段，测得的16S序列如SEQ ID NO.1所示。将所测得的16S 序列在美国国立生物信息中心（NCBI）数据库进行比对，SZ201与GenBank中的模式菌株粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens subsp. marcescens）ATCC T13880的相似度最高（99.6%），从而确定了SZ201在分类上属于粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens subsp. marcescens）。

[0010] 基于以上特征，本发明提供了一株粘质沙雷氏菌SZ201，粘质沙雷氏菌SZ201的分类命名为：粘质沙雷氏菌，拉丁学名为：Serratia marcescens，已于2019年8 月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019597，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

[0011] 本发明所得到的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SZ201应用于烤烟生产，能提高烤烟叶片的钾含量，特别能在烤烟打顶期后，降低烤烟植株中钾素回流量的应用。

[0012] 将所述粘质沙雷氏菌SZ201菌剂、或其培养液应用于烤烟生产，提高烤烟叶片的钾含量，也在本发明的保护范围内。

[0013] 另外本发明还包括将粘质沙雷氏菌SZ201用于制备提高烤烟叶片钾含量的生物制剂，该生物制剂包含粘质沙雷氏菌SZ201粉剂，或其培养液，该生物制剂还可与有机肥混合制得微生物肥料等。

[0014] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

[0015] 本发明提供了一株粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SZ201，生产生物有机肥，应用于烤烟生产，烤烟上部和中部叶片钾含量分别提高了6.71%和11.83%。同时降低了烤烟不同部位叶片和根茎的钾素回流，降低幅度为9.81%～24.06%，同时，粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SZ201具有较强的提升土壤养分有效性的能力，可作为优良菌株用于农业生产，应用前景良好。

附图说明

[0016] 图1为粘质沙雷氏菌SZ201在牛肉膏蛋白胨培养基上培养的菌落形态。

[0017] 图2为粘质沙雷氏菌SZ201显微镜观察菌体形态。

[0018] 图3是粘质沙雷氏菌SZ201的16S rDNA序列的系统发育图。

具体实施方式

[0019] 下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。

[0020] 应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0021] 实施例1：

[0022] 本实施例涉及对沙雷氏菌SZ201的分离、纯化和保存。

[0023] 样品采集：从四川省崇州市桤泉镇四川农业大学现代农业研发基地水稻田，采集秸秆还田实验中已部分腐解小麦秸秆样品，低温保存带回实验室。

[0024] 培养基制备：牛肉膏蛋白胨配方为牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，氯化钠 5 g，琼脂20 g，pH7.0-7.2，水1000 mL。

[0025] 菌株分离纯化：取小麦秸秆还田的水稻土样品5.0 g，加入到45 mL 无菌水，28 ℃和140 r/min条件下振荡培养2 h；吸取1 mL样液，采用梯度法制备菌悬液，稀释至10-5，各取1mL的10-3、10-4和10-5菌悬液，于牛肉膏蛋白胨培养基平板涂布，28℃培养2-3 d。待长出菌落后，从平板上挑选形态不同的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线，28℃培养1-2 d，挑取单菌落简单染色或革兰氏染色，结合显微观察，直至获得纯菌株，编号为SZ201。纯化后的菌株接入牛肉膏蛋白胨培养基试管斜面培养基4℃保存。

[0026] 如图1所示，为本实施例的分离纯化得到的菌株SZ201在牛肉膏蛋白胨培养基平板培养培养48 h后的菌落形态，为圆形，红色（即图中深色显示部分），直径为1 2 mm，边缘整~齐，扁平湿润。图2为SZ201的菌体显微形态，为小杆状，革兰氏阴性，无芽孢，有鞭毛，无荚膜。

[0027] 实施例2：

[0028] 本实施例涉及粘质沙雷氏菌SZ201的16S rDNA的扩增测序及系统发育分析[0029] 提取粘质沙雷氏菌SZ201菌株的总DNA，以总DNA为模板，用27F和1492R为引物扩增16S 片段，PCR反应用Bio-RADMyCyclerTM仪器。

[0030] 反应体系（50μl）：2×PCRMix25μl，引物27F和1492R（10μM）各1μl，DNA模板1μl，加超纯水补足至50μl；引物27F和1492R的核苷酸序列如SEQID No. 2和SEQID No. 3所示。

[0031] PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环30次；72 ℃最终延伸8 min。

[0032] PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到上海生工生物工程有限公司进行序列测定。用软件DNAMAN7.0进行基因序列相似度的计算。所测序列结果如SEQID No. 1。

[0033] 将所得的序列结果在美国国立生物信息中心（NCBI）数据库中进行比对，选择雷氏菌属的相似性最高的模式菌株为参比菌株，用MEGA 7.02邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树，如图3所示，自展值（bootstrap）1000。并将SZ201的16S rDNA序列与模式菌株T粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens subsp. marcescens）ATCC 13880的进行分析，其相似度为99.6%。

[0034] 基于以上特征，将菌株SZ201鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescen）。该菌株已于2018年8月2日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019597。

[0035] 实施例3：

[0036] 本实施例涉及粘质沙雷氏菌SZ201制备生物有机肥。

[0037] 将粘质沙雷氏菌SZ201接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基上活化培养，28℃培养至对数生长期，待菌株SZ201培养至指数生长期，按照有机肥重量的5%，将菌液加入有机肥中，有机肥充分与菌液混匀后，制备得到粘质沙雷氏菌生物有机肥。该生物有机肥中活菌数＞0.2亿/g。

[0038] 实施例4

[0039] 本实施例涉及粘质沙雷氏菌SZ201在提高烤烟叶片钾含量的效果实验

[0040] 以云烟87为材料，进行盆栽实验，供试土壤采自供试土壤采集自四川省成都市龙泉驿茶店镇双林村（E 104°20'38"，N 30°30'11"），土壤类型为中性紫色土，初始肥力特征：碱解氮44.08mg/kg，速效磷8.55mg/kg，速效钾66.01mg/kg，有机质1.85%，实验地点四川农业大学成都校区实验大棚。盆栽试验设T1、T2两个处理，其中，T1施入与T2处理等量的有机肥，T2施用SZ201生物有机肥。接种方式为SZ201生物有机肥穴施，施用以实例3制备的生物有机肥。具体做法：将供试土壤充分混匀，称量装盆（6kg/盆），按处理施用有机肥和生物有机肥，烤烟生长期间保持环境通风、光线充足，土壤含水量控制在20%-30%，浇灌用水为去氯水。在烤烟打顶期和成熟期，分别采集烤烟植株根、茎和叶等样品，105℃杀青，80℃烘干至恒重，粉碎过35目筛，采用H2SO4-H2O2消煮—火焰光度计法测定植物不同部位全钾含量（%），并计算烤烟植株钾素回流率。

[0041] 烤烟植株钾含量增加率%=（T2钾含量-T1钾含量）/ T1钾含量*100%

[0042] 烤烟植株钾素回流率%=（打顶期钾含量-成熟期钾含量）/打顶期钾含量*100%[0043] 表1结果表明，T2处理与T1处理相比，成熟期上部和中部叶片钾含量分别提高了6.71%和11.83%。进一步分析了不同处理打顶期后烤烟植株不同部位钾素回流率变化，较之T1，T2处理显著减少了烤烟不同部位叶片的钾素回流率。其中，烤烟植株上部叶片钾素回流率下降了11.32%，降幅最大；根和茎秆中钾素回流率降分别降低了7.86%和5.73%。

[0044] 表1 各时期不同处理不同部位钾素含量

[0045]

[0046] 注：同一部位不同处理作显著性分析，同一列内小写字母不同表示差异显著（p<0.05）。

[0047] 实施例5：

[0048] 本实例涉及施用粘质沙雷氏菌SZ201可提高土壤有效养分含量。

[0049] 在烟草盆栽实验中，设计了不接菌对照（T1），接种沙雷氏菌SZ201（T2），研究了供试菌株对烤烟植株不同生育期对土壤缓效钾和速效磷含量的变化情况。分别于团棵期、打顶期和成熟期采集不同处理烤烟根际土壤，土样干燥后，经过除杂，风干，研磨，过筛处理，土壤缓效钾含量采用HNO3煮沸法测定，土壤速效磷含量采用NaHCO3浸提法测定。

[0050] 表2结果表明，T2处理能显著提高烤烟不同生长时期土壤缓效钾和有效磷的含量。接种SZ201后，烤烟团棵期和成熟期土壤缓效钾含量分别增加了4.05%和2.61%，土壤有效磷含量分别增加了17.50%和14.71%，有效地提高了土壤养分的利用效率。

[0051] 表2 不同处理土壤缓效钾和速效磷含量变化

[0052]

[0053] 注： 同一时期不同处理间同一列内小写字母不同表示差异显著（p<0.05）。

[0054] 由上述实施例1-5可以知道，本发明针对现有我国烤烟叶片钾含量低的技术难题，从小麦秸秆还田的水稻土中分离纯化得到一株粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SZ201，该粘质沙雷氏菌SZ201应用于烤烟生产，具有提高烤烟叶片钾含量的效果，尤其，针对四川省烤烟的主栽品种云烟87，施用SZ201生物有机肥，不仅能显著提高该品种烤烟上部和中部叶片的钾含量，还能减少打顶期后烤烟根、茎及不同部位叶片钾素回流量。当然，本发明涉及的粘质沙雷氏菌SZ201在应用于烤烟生产时，还可作为生物制剂进行使用。除此之外，本发明还涉及将粘质沙雷氏菌SZ201用于提高植烟土壤的有效养分，经试验证明，接种粘质沙雷氏菌SZ201后的植烟土壤，其缓效含量和有效磷含量均得到增加，对改善植烟土壤有效养分具有一定的促进作用。

[0055] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。