一种犬细小病毒CPV-HuN1703株及其应用

摘要

本发明涉及一种犬细小病毒CPV‑HuN1703株及其应用，其血凝效价与现有分离毒株相当，但增殖能力优于CPV标准株和发明人早先分离的CPV毒株，是良好的灭活疫苗毒株；将其灭活后制备得到的灭活疫苗能够有效刺激接种动物产生有效水平的IgG抗体，应对不同CPV毒株的感染，且抗体产生水平高，对动物的保护性能高。

权利要求

1.一种犬细小病毒CPV-HuN1703株，其微生物保藏编号为CGMCC No.17583；分类命名：犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）；保藏时间是2019年04月24日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.根据权利要求1所述的犬细小病毒CPV-HuN1703株在制备治疗犬细小病毒感染药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的犬细小病毒CPV-HuN1703株在制备预防犬细小病毒感染的疫苗中的应用，所述疫苗为灭活疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的灭活疫苗是由佐剂和灭活的犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液制备而成。

5.根据权利要求4所述的应用，所述佐剂为所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、Gel 

01、蜂胶、ISA206和ISA760VG中的一种或几种。

6.根据权利要求4所述的应用，所述疫苗经由以下方法制备得到：步骤a，按照常规方法培养猫肾传代细胞F81：生长液为含5%胎牛血清的MEM，其中生长液含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL，在37℃，5%CO2培养箱中培养传代，待细胞生长至

80%汇合度时，用PBS洗涤1次后更换为无血清培养基；

步骤b，取含量为5×104TCID50/ml 的犬细小病毒CPV-HuN1703株按5%的体积百分比接种到步骤a制备的长势良好的F81细胞，37℃吸附1小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM作为维持液继续培养；

步骤c，接毒后，每日观察3次，记录细胞病变情况，待细胞病变率达80%以上时进行收获，-80℃反复冻融三次，8000 rpm离心15min，收集上清液，即为病毒液；

步骤d，将步骤c制备得到的病毒液经20倍浓缩后，加入0.2%甲醛37℃灭活24小时得到犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液；

步骤e，将犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液和佐剂在无菌环境中搅拌混合均匀，即制得所述灭活疫苗。

7.根据权利要求6所述的应用，所述佐剂为ISA206。

8.根据权利要求7所述的应用，所述灭活疫苗中含有犬细小病毒CPV-HuN1703株≥5.5×105TCID50/头份，ISA206 50% V/V。

9.根据权利要求6所述的应用，所述疫苗的使用方式为肌肉注射或滴鼻免疫。

10.根据权利要求9所述的应用，所述疫苗的使用方式为肌肉注射。

说明书

一种犬细小病毒CPV-HuN1703株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一株犬细小病毒CPV-HuN1703株及其应用。

背景技术

[0002] 近年来，随着人们生活水平的不断提高，宠物已成为人们生活中不可或缺的部分，迅速膨胀的宠物行业给社会发展带来活力的同时也存在诸多亟待解决的问题，例如，犬瘟热、犬细小病毒病、犬冠状病毒病等传染病在世界范围内广泛流行，迅速蔓延，对养犬业造成巨大危害。其中，犬细小病毒病尤为严重，致死率高达 50%～90%，严重危害了养犬业的发展。

[0003] 犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus  , CPV) 感染引起的以呕吐、腹泻、白细胞减少和出血性肠炎为特征的具有高度接触性的急性烈性传染病，犬细小病毒（CPV）病自发现以来一直是危害犬类健康的最严重的传染病之一，尤其对 2～6 月龄的幼犬危害最大，犬细小病毒分布在世界各地，能够感染犬科和鼬科动物，发病率高达 70%-100 % , 死亡率高达 50 %。随着我国生活水平的提高，警犬、实验用宠物犬饲养量的增加，犬细小病毒病日益严重，对犬饲养业带来巨大的损失，也严重威胁我国养犬业的发展。

[0004] 犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）属于细小病毒科，细小病毒属成员之一，CPV 结构为等轴对称的，近似球状的二十面体，直径约为 18 nm～26 nm，外观为圆形或六边形，没有囊膜。由于 CPV的结构十分紧密，对各类物理化学等刺激具有很强的抵御能力，65 ℃、30min 处理后仍具有感染性；长时间低温环境下，其感染性不会有变化，室温条件下存活时间为 3 个月左右，在粪便中可存活超过半年以上。CPV 感染后，发病快并且死亡率较高，因而预防 CPV 比治疗更有效果，疫苗接种是控制 CPV 爆发和流行的主要方法。幼犬易感染病毒，即使接种了疫苗也会出现感染，因为幼犬体内的母源抗体会干扰疫苗的作用，导致免疫失败，所以许多研究者致力于克服干扰，研究更有效的疫苗。

[0005] 灭活苗是使用灭活的病毒接种动物，最初的灭活苗是使用 FPV 接种犬，这是因为 FPV 与 CPV 同源比例较高，能起到一定的预防效果。后来有研究者将CPV 强毒株灭活，注射犬群免疫，相比较 FPV 灭活苗的免疫效果更理想，在接种后不良反应不明显，安全可靠。CPV 到目前为止只有一个抗原型，即 Thomson 和 Kelly分离到 CPV-2，但是 CPV 存在抗原漂移，其后出现了在宿主范围、血凝性和抗原性上都发生了变化的不同亚型 CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)和 CPV-2c(b)。随着病毒的不断变异，给此病的治疗以及预防带来了新的挑战。

[0006] 发明专利申请CN201611031801.X公开了一株犬细小病毒毒株CPV-YH，以及所述的犬细小病毒毒株CPV-YH在制备犬细小病毒疫苗、诊断试剂方面的用途；发明人早年也曾参与CPV相关工作的研究，分离得到CPV-NY130615株（卜宾等，“1株犬细小病毒的分离鉴定及其生物学特性研究”，《河南农业科学》，2015,44（18）：121-127，140）。然而，正如专利申请CN201611031801.X所指出的，我国的CPV分离株也存在基因变异现象，通过病毒发生的自然宿主漂移发生时结果是很严重的，因为这种病毒可以通过先天免疫和非适应的宿主群广泛传播。由于具有很快的变异速度，现临床使用的灭活疫苗与弱毒疫苗的免疫效果都不同程度下降，现有疫苗并不能完全满足疾病防控和市场消费需求。

[0007] 因此，为了更有效地预防控制犬细小病毒病，亟需分离出新的CPV毒株，用于开发新的犬细小病疫苗。

发明内容

[0008] 为了解决现有CPV预防中存在的问题，本发明提供了一株新的犬细小病毒CPV-HuN1703株，以及该病毒株在制备疫苗、病毒诊断试剂等方面的用途。该犬细小病毒CPV-HuN1703株具有免疫原性能好，用其制备的疫苗对于犬细小病毒病具有良好的保护效力。

[0009] 为解决以上技术问题，达成本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

[0010] 本发明提供了一种犬细小病毒CPV-HuN1703株，其微生物保藏编号为CGMCC No.17583；分类命名：犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）；保藏时间是2019年04月24日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

[0011] 本发明还请求保护犬细小病毒CPV-HuN1703株在制备治疗犬细小病毒感染药物中的应用。

[0012] 具体地，本发明请求保护犬细小病毒CPV-HuN1703株在制备预防犬细小病毒感染的疫苗中的应用。优选地，所述疫苗为灭活疫苗。

[0013] 具体的，所述灭活疫苗是由佐剂和灭活的犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液制备而成。

[0014] 优选的，所述佐剂为所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、Gel 01、蜂胶、ISA206和ISA760VG中的一种或几种。

[0015] 优选的，所述疫苗经由以下方法制备得到：

[0016] 步骤a，按照常规方法培养猫肾传代细胞F81：生长液为含5%胎牛血清的MEM（含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL），在37℃，5%CO2培养箱中培养传代，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS洗涤1次后更换为无血清培养基；

[0017] 步骤b，取含量为5×104TCID50/ml 的犬细小病毒CPV-HuN1703株按5%的体积百分比接种到步骤a制备的长势良好的F81细胞，37℃吸附1小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM作为维持液继续培养；

[0018] 步骤c，接毒后，每日观察3次，记录细胞病变（CPE）情况，待细胞病变率达80%以上时进行收获，-80℃反复冻融三次，8000 rpm离心15min，收集上清液，即为病毒液；

[0019] 步骤d，将步骤c制备得到的病毒液经20倍浓缩后，加入0.2%甲醛37℃灭活24小时得到犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液；

[0020] 步骤e，将犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液和佐剂在无菌环境中搅拌混合均匀，即制得所述灭活疫苗。

[0021] 优选的，所述佐剂为ISA206。

[0022] 优选的，所述灭活疫苗中含有犬细小病毒CPV-HuN1703株≥5.5×105TCID50/头份，ISA206 50%（V/V）。

[0023] 本发明还请求保护所述灭活疫苗在制备用于预防犬细小病毒感染药物中的应用，所述犬细小病毒感染导致的病症为犬病毒性肠炎、犬传染性肠炎、或者犬非脓性心肌炎。

[0024] 优选的，所述疫苗的使用方式为肌肉注射或滴鼻免疫，更进一步优选为肌肉注射。

[0025] 基于以上技术方案，本发明具备如下优点和有益效果：

[0026] 本发明基于湖南衡阳地区流行的CPV毒株，筛选得到一株致病性较强的强度毒株，其血凝效价与现有分离毒株相当，但增殖能力优于CPV标准株和发明人早先分离的CPV毒株，是良好的灭活疫苗毒株；将其灭活后制备得到的灭活疫苗对动物而言具有很高的保护水平，且其能够有效刺激接种动物产生有效水平的IgG抗体，试验表明CPV-HuN1703株灭活疫苗能够应对不同CPV毒株的感染，而其他疫苗毒株对于动物的保护率都不及本发明的疫苗株；本发明的CPV-HuN1703疫苗毒株具有良好的免疫原性，能够很好的刺激机体产生有效的抗体，且抗体产生水平高，对动物的保护性能最高，其所取得效果是现有毒株所不能达到的。

附图说明

[0027] 图1：CPV-HuN1703株在F81细胞上产生CPE的情况图：A，正常的F81细胞；B，接种CPV后产生的CPE。

[0028] 图2：CPV-HuN1703株的PCR鉴定图：M，Marker；泳道1，CPV-HuN1703株；泳道2，阴性对照。

[0029] 图3：动物回归实验剖检和病理图：A，犬小肠剖检；B，犬小肠病理切片。

[0030] 图4：首次免疫接种后犬体内血清效价变化图。

具体实施方式

[0031] 实施例1：犬细小病毒CPV-HuN1703株的分离和鉴定

[0032] 1.1 病料来源及采集：采集自湖南省衡阳市某宠物医院收治的严重发病犬，病死后的病料。

[0033] 临床发现该犬表现精神沉郁、不思饮食、严重腹泻伴有呕吐，粪便带红色血块，有肠黏膜脱落，经现有药物手段，难以阻止病情恶化。取现场拉稀粪便，采用胶体金试纸条检测CPV 抗原，检测结果呈现阳性。

[0034] 病死犬经消毒后，采集犬的心脏、肝脏、脾脏、淋巴结、小肠及肠内容物等组织病料，置于-70℃条件保存。

[0035] 其他病毒来源：

[0036] CPV标准株（CVCC AV298），来自中国兽医药品监察所（HA效价为1:1024）。

[0037] CPV-NY130615株，为发明人早期分离，本实验室保藏。

[0038] 病毒的分离与鉴定：

[0039] 取保存的病死犬小肠及肠内容物病料，刮取肠粘膜及其肠内容物，研磨病料后按1:5（W:V）的比例加入PBS，反复冻融3次后， 12000r/min 离心 10min，取上清液，加入青、链霉素混合液（终浓度为 1000IU）混合均匀后，用0.22μm滤膜滤过除菌后即为待接种病毒液样品，-20℃保存备用。

[0040] 按照细胞培养液体积的 10%，将待接种病毒液样品接种于生长良好的F81 细胞，然后放置在培养箱中37℃培养，同时设置空白细胞作为对照，每天观察细胞病变情况。若无病变，则于培养5天后收获，反复冻融3次，连续盲传至第6代，若连续6代都无病变则视为阴性；若出现细胞病变，出现CPE达到80%时，收获病毒液，经-20℃反复冻融3次后置于-80℃保存备用，作为病毒分离液。

[0041] 经观察，待接种病毒液样品接种F81细胞后，即出现轻微的CPE变化，盲传至第3代时出现明显的CPE变化，表现为贴壁细胞边缘界线明显、细胞呈现拉网状、呈梭形、最终脱落崩解。在此基础上，再连续接种培养3 代，均表现出很好的CPE，由此即分离得到犬细小病毒，命名为CPV-HuN1703株。

[0042] 病毒的鉴定与保藏：

[0043] （1）细胞培养及CPE：将收获的第3代病毒培养液进行传代培养，将病毒分离液按照5%含量接种于生长良好的F81 细胞，37℃吸附1h，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM作为维持液继续培养，37℃连续培养5天，观察病变情况，具体病变情况参见说明书附图1。在接种后第 3 天即出现典型的细胞病变，呈现细胞脱落，大面积的“拉网状病变”（见说明书附图1）。

[0044] （2）核酸鉴定：采用发明人早期参与构建的检测方法（参见卜宾等，“1株犬细小病毒的分离鉴定及其生物学特性研究”，《河南农业科学》，2015,44（18）：121-127，140），对分离得到的第3代病毒培养液进行PCR鉴定。从说明书附图2可以看出，第3代病毒培养液可以扩增出682 bp条带，与预期片段长度一致，而阴性对照无条带，经测序比对，确认为CPV病毒。这一结果表明，所分离得到的病毒培养液中的病毒为CPV。

[0045] （3）血凝试验

[0046] 使用血凝板，第一孔加 PBS 50μL，再加待检样品 （第6代病毒培养液）50μL，混匀后移出 50μL至第二孔，倍比稀释，最后弃去 50μL，再作一行重复，第 12 孔为 PBS 对照。然后向每个反应孔加入 50μL 1%的猪红细胞（用 PBS 处理猪红细胞），放置 4℃孵育1h，以凝集 50%的红细胞的最大稀释度为该样本的 HA 效价。具体结果参见下表1。

[0047] （4）病毒滴度测定：

[0048] 将所分离的病毒（第6代病毒培养液）用 MEM 做 10-1-10-10倍稀释，同步接种于 F81 细胞培养板，每个稀释度 6 个重复，100μL/孔，放置培养箱中静置培养，观察病变，第 5 天观察 CPE，记录阳性孔，计算病毒的 TCID50。具体结果参见下表1。

[0049] 表1 CPV-HuN1703株与对照株的血凝效价和 TCID50对照结果

[0050]

[0051] 基于以上结果可知，CPV-HuN1703株第3代的血凝效价为1:1024，病毒含量为108.75 TCID50/mL，其血凝效价与现有分离毒株相当，但增殖能力优于CPV标准株和发明人早先分离的CPV-NY130615株。

[0052] （5）动物回归实验：

[0053] 根据实验动物卫生要求进行，选取衡阳市普通杂交幼犬6只，约 40-50日龄，采血，进行血常规检测，采集粪便，进行 PCR 检测，母源抗体≤1:4，未接种任何疫苗的犬，记录临床表现，观察一周，CDV 和 CPV 检测均为阴性，用于攻毒试验。其中4只为攻毒组，每只口服1mL第5代病毒稀释液（105.0TCID50/mL）；2只为对照组，每只口服1mL补液盐水。统计接种后的发病情况，并对攻毒组进行剖检，观察病理变化。

[0054] 结果，全部4只攻毒犬第3天均发病，发病表现为食欲减退、腹泻、血便的症状，体温升高，体重减轻，从粪便 PCR 中检测到病毒的排出，对照组正常。

[0055] 口服组四只犬全部死亡，剖检发现，主要病变在小肠部位，空肠和回肠充血，肿胀，小肠粘膜坏死、脱落，肠内混合有大量的血液，颜色暗红，肠壁变薄，肠壁上可见到灰色溃疡灶。通过病理切片看出，病变主要在肠黏膜层，黏膜结构破坏，肠腺萎缩消失，浅层黏膜上皮局灶性脱落，固有层淤血，具体见说明书附图3。

[0056] 经分离鉴定，获得了一种犬细小病毒CPV-HuN1703株，其微生物保藏编号为CGMCC No.17583；分类命名：犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）；保藏时间是2019年04月24日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

[0057]  实施例2：犬细小病毒CPV-HuN1703株用于疫苗的制备

[0058] （1）疫苗的制备

[0059] 一种犬细小病毒灭活疫苗，所述疫苗经由以下方法制备得到：

[0060] 步骤a，按照常规方法培养猫肾传代细胞F81：生长液为含5%胎牛血清的MEM（含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL），在37℃，5%CO2培养箱中培养传代，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS洗涤1次后更换为无血清培养基；

[0061] 步骤b，取含量为5×104TCID50/ml 的犬细小病毒CPV-HuN1703株按5%的体积百分比接种到步骤a制备的长势良好的F81细胞，37℃吸附1小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM作为维持液继续培养；

[0062] 步骤c，接毒后，每日观察3次，记录细胞病变（CPE）情况，待细胞病变率达80%以上时进行收获，-80℃反复冻融三次，8000 rpm离心15min，收集上清液，即为病毒液；

[0063] 步骤d，将步骤c制备得到的病毒液经20倍浓缩后，加入0.2%甲醛37℃灭活24小时得到犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液；

[0064] 步骤e，将犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液和佐剂在无菌环境中搅拌混合均匀，即制得所述灭活疫苗。

[0065] 所述佐剂为ISA206。

[0066] 所述灭活疫苗中含有犬细小病毒CPV-HuN1703株≥5.5×105TCID50/头份，ISA206 50%（V/V）。

[0067] （2）疫苗的检验

[0068] 按照以上方法制备两批次疫苗，批号分别为20180501，20180601。

[0069] 常规检验：两批疫苗外观呈粉红色乳胶状，且经无菌检测和支原体检测，均呈现阴性，经常见病毒检测，除CPV以外，常见的犬类病毒如CDV、CCV、CRV、CAV-1等，检测均为阴性。

[0070] 安全性检验：取经检测CPV病原和抗体均为阴性30-40日龄的普通杂交幼犬10只，随机分为2组，每组5只，每只肌注10头份的疫苗，临床观察一个月，均100%健活，未见不良反应发生，表明本发明的两批次疫苗均安全。

[0071] 实施例3：疫苗效力检测试验

[0072] 3.1 材料与方法

[0073] 作为对照，分别采用CPV标准株、CPV-NY130615株依据实施例2的灭活疫苗的制备方法，分别制得一批次的产品。商品化疫苗选用宠必威®优免康（主要免疫犬瘟、犬细小、肝炎和犬副流感，批号：A505A01）

[0074] 取经病原检测和抗体检测均为阴性的30-40日龄的杂交幼犬25只，随机分为5组，每组5只，分别命名为对照组、CPV-HuN1703组、CPV标准组、CPV-NY130615组、商品化疫苗组，其中对照组注射50%ISA206佐剂（50% ISA206+50%生理盐水），CPV-HuN1703组、CPV标准组、CPV-NY130615组分别注射实施例2制备的20180601批次疫苗、基于CPV标准株、CPV-NY130615株制备得到的疫苗。每只犬注射量均为1头份（1mL/头份，病毒含量为5.5×105TCID50/头份）。商品化疫苗组注射商品化疫苗1头份（按说明书使用）。

[0075] 在注射后第7天、14天、21天和28天，以及二免后第7天，采用ELISA检测方法检测试验犬中的抗体水平（参见发明人在先专利：CN201410830855.7）。检测结果参见图4。

[0076] 在第28天进行第二次免疫，二免后7天，采用CPV强毒进行攻毒，攻毒方式为：口服CPV标准毒株培养液、CPV-HuN1703毒株培养液和CPV-NY130615毒株培养液各1mL，病毒含量均≥1×105TCID50/mL。观察攻毒后各组的发病和存活情况，具体结果参见表2。

[0077] 表2 攻毒后的存活率

[0078]

[0079] 基于以上表2的结果可知，本发明所得到的CPV-HuN1703所制备得到的灭活疫苗具有最好的保护效果，其对实验动物实现了全保护，存活率100%，而对照组的死亡率较高，在攻毒14天后，实验犬全部死亡，而CPV标准组、CPV-NY130615组以及商品化疫苗组的保护率分别为4/5，3/5和4/5，由此可见，本发明的疫苗株能够应对不同CPV毒株的感染，而其他疫苗毒株对于动物的保护率都不及本发明的疫苗株。

[0080] 另外，基于本发明说明书附图图4可知，本发明的CPV-HuN1703所制备得到的灭活疫苗在接种后第7天和第14天都表现出各组次中最高的血清效价，第21天时，各接种动物都达到首免后最高的抗体效价，其中CPV-HuN1703组、CPV-NY130615组和商品化疫苗组的血清效价均为1:6400；而CPV标准组的血清效价略低，随后，IgG抗体呈现下降趋势，第28天二免后的第7天，本发明的CPV-HuN1703所制备得到的灭活疫苗组效价最高，为1:12800，其他组别均为1:6400。可见，本发明的CPV-HuN1703疫苗毒株具有良好的免疫原性，能够更好的刺激机体产生有效的抗体，且抗体产生水平高，对动物的保护性能最高，其所取得效果是现有毒株所不能达到的，是预料不到的。

[0081] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。