一种突变基因及其用于构建蹼足病小型猪模型的用途

摘要

本发明提供一种小型猪的RIPK4突变基因，所述突变基因与野生型猪RIPK4基因相比，具有c.1397_1398insA的突变。本发明提供了一种构建体，所述构建体包含所述RIPK4突变基因。本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞由所述构建体转化受体细胞获得。本发明提供了一种制备蹼足病小型猪模型的方法，所述方法包括：改变小型猪的RIPK4基因，使RIPK4基因的位于第8号外显子的第1397位碱基和1398位碱基之间插入腺嘌呤A。利用本发明提供的RIPK4突变基因制备大型蹼足病猪模型，研究蹼足病的发病机理，对于临床预防、诊断和治疗蹼足病具有重大的指导意义。

权利要求

1.一种小型猪的RIPK4突变基因，所述突变基因与野生型猪RIPK4基因相比，具有c.1397_1398insA的突变；

其中，所述RIPK4突变基因的序列如SEQ ID NO: 29所示。

2.一种构建体，所述构建体包含如权利要求1所述的RIPK4突变基因。

3.一种重组细胞，所述重组细胞由如权利要求2所述的构建体转化受体细胞获得。

4.根据权利要求3所述的重组细胞，其中，所述重组细胞为猪细胞。

5.根据权利要求3所述的重组细胞，其中，所述重组细胞为巴马小型猪细胞。

6.一种制备蹼足病小型猪模型的方法，所述方法包括：改变小型猪的RIPK4基因，使RIPK4基因的第1397位碱基和1398位碱基之间插入腺嘌呤A，

其中，改变后的RIPK4基因的序列如SEQ ID NO: 29所示。

7.一种非诊断目的的筛选具有RIPK4突变基因的蹼足病小型猪模型的方法，所述方法包括以下步骤：

1）提取待测生物样品的核酸DNA；

2）确定所述核酸DNA的序列；

3）所述核酸的序列或其互补序列，与野生型RIPK4基因相比具有c.1397_1398insA突变，所述突变是蹼足病的指示；

其中，所述突变型RIPK4基因的序列如SEQ ID NO: 29所示，所述生物样品选自血液、皮肤、毛发和肌肉中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，确定所述核酸的序列包括如下步骤：

采用猪RIPK4基因的特异性引物进行PCR，得到扩增产物并对扩增产物进行测序；

其中，正向引物序列如SEQ ID NO: 27所示，反向引物序列如SEQ ID NO: 28所示。

9.一种筛选RIPK4基因突变蹼足病小型猪模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RIPK4基因的特异性引物；

其中，正向引物序列如SEQ ID NO: 27所示，反向引物序列如SEQ ID NO: 28所示。

10.如权利要求1所述的突变基因、如权利要求2所述的构建体、如权利要求3至5中任一项所述的重组细胞或如权利要求9所述的试剂盒在制备用于筛选蹼足病的动物模型中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述动物模型为哺乳动物模型。

12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述哺乳动物为小鼠、猴或小型猪。

说明书

一种突变基因及其用于构建蹼足病小型猪模型的用途

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种RIPK4突变基因，本发明还涉及该突变基因用于构建蹼足病(Bartsocas‑Papas syndrome)小型猪模型的用途以及一种蹼足病小型
猪模型的构建方法。

背景技术

[0002] 小型猪是一种非常好的可用于研究人类疾病的致病病因、分子机制以及治疗方法的动物模型。巴马小型猪为我国特有的地方猪种，主要产自中国广西省，在外观上巴马猪表
现为典型的“两头乌”特征，即头部和臀尾部毛发为黑色，而其他部分为白色。近年来，巴马
猪因其具有体型较小以及解剖学结构与人类相近的优势，逐渐被广大科学工作者认定为是
构建人类疾病医学研究的大动物模型的良好材料，故此具有极高的培育价值。

[0003] 蹼足病(Bartsocas‑Papas syndrome)是一种在新生儿中发病率较低的遗传出生缺陷，常常导致死亡，主要表现为唇裂/腭裂的症状，还有其它方面的异常，如皮肤皱褶，并
趾(并指)，生殖器异常等。

[0004] 现有的Bartsocas‑Papas syndrome综合征的疾病模型是小鼠，但小鼠的生理结构上与人类相差甚远，所以，亟需在与人类生理结构相近的大型动物中构建该疾病的模型，从
而为针对该疾病的病理研究、药物筛选、药效评价等研究提供支持。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种小型猪的RIPK4突变基因，具有该突变基因的转基因家系小型猪的表型和遗传模式与人类蹼足病(Bartsocas‑Papas syndrome)相
符合，可以作为该人类遗传疾病的大动物模型，从而为针对该疾病的病理研究、药物筛选、
药效评价等研究提供支持。

[0006] 一方面，本发明提供了一种小型猪的RIPK4突变基因，所述突变基因与野生型猪RIPK4基因相比，具有c.1397_1398insA的突变。

[0007] 具体地，所述突变基因的突变位点位于第8号外显子，所述腺嘌呤(A)插入到1397位碱基和1398位碱基之间，导致其编码氨基酸发生移码突变(p.Asn466LysfsTer169)。具体
地，所述RIPK4突变基因的466位天冬酰胺(Asn)突变为赖氨酸(Lys)，后面翻译的氨基酸发
生移码突变。

[0008] 优选地，所述RIPK4突变基因序列如SEQ ID NO:29所示。

[0009] 优选地，所述小型猪为巴马小型猪。

[0010] 另一方面，本发明提供了一种构建体，所述构建体包含所述RIPK4突变基因。

[0011] 本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞由所述构建体转化受体细胞获得。优选地，所述重组细胞为猪细胞，更优选地为巴马小型猪细胞。

[0012] 根据本发明的实施例，所述重组动物细胞的基因组中具有编码突变型RIPK4的核酸序列，其中，与野生型RIPK4相比，所述突变型RIPK4的蛋白质翻译466位天冬酰胺(Asn)突
变为赖氨酸(Lys)，后面翻译的氨基酸发生移码突变。

[0013] 再另一方面，本发明提供了一种制备蹼足病小型猪模型的方法，所述方法包括：

[0014] 改变小型猪的RIPK4基因，使RIPK4基因的位于第8号外显子的第1397位碱基和1398位碱基之间插入腺嘌呤A。

[0015] 在本发明的一些实施例中，根据实际需要，利用基因工程技术，改变正常猪的RIPK4基因，在第1397位碱基和1398位碱基之间插入腺嘌呤A，获得蹼足病猪模型。在另一些
实施例中，也可以利用基因工程技术改变除猪以外的其它动物的RIPK4基因的相应位点，从
而获得所需的大型或小型蹼足病动物模型，例如蹼足病猴模型，蹼足病小鼠模型，等等。

[0016] 本发明还提供一种筛选RIPK4基因突变的蹼足病小型猪模型的方法，所述方法包括以下步骤：

[0017] 1)提取待测生物样品的核酸DNA；

[0018] 2)确定所述核酸DNA的序列；

[0019] 3)所述核酸的序列或其互补序列，与野生型RIPK4基因相比具有c.1397_1398insA突变，所述突变是蹼足病的指示；

[0020] 所述生物样品选自血液、皮肤、毛发和肌肉中的至少一种。

[0021] 在步骤2)中，确定所述核酸的序列包括如下步骤：

[0022] 采用猪RIPK4基因的特异性引物进行PCR，得到扩增产物并对扩增产物进行测序；

[0023] 优选地，所述正向引物(F)序列如SEQ ID NO:27所示，反向引物(R)序列如SEQ ID NO:28所示。

[0024] SEQ ID NO:27 5’‑3’:CGCCCCTCTAGGTCTCAGAT；

[0025] SEQ ID NO:28 5’‑3’:GGCATTGACGCTGATCTTGC

[0026] 本发明还提供一种筛选RIPK4基因突变蹼足病小型猪模型的试剂盒，包括液态的或粉末状的猪RIPK4基因的特异性引物。所述试剂盒可以包括PCR所需的其它试剂，如缓冲
液、dNTP、聚合酶；还可以包括回收PCR产物所需的试剂和耗材，如溶胶液、收集管、洗涤液
等。以待测样品的DNA为模板，利用所述试剂盒和本发明提供的筛选RIPK4基因突变蹼足病
猪的方法进行检测，操作简便，能快速鉴别大量样品。

[0027] 为获得蹼足病的大型动物模型，本发明对巴马小型猪进行ENU(N‑乙基‑N‑亚硝基脲)化学诱变，向野生型雄性小型猪注射ENU，得到F0代小型猪；然后将其与同品种的野生型
雌性小型猪交配，获得F1代小型猪；将F1代雄性小型猪和野生型雌性小型猪交配，获得F2代
小型猪；所述的F1代雄性小型猪小型猪所述的F2代雌性小型猪交配，获得F3代小型猪(野生
公猪51头，野生母猪34头，畸形公猪12头，畸形母猪9头，畸形比例为21/106＝19.81％)，所
述的F3代小型猪进行表型筛选，获得具有蹼足病表型的家系小型猪，其携带RIPK4纯合突变
基因。

[0028] 本发明的家系小型猪的蹼足病性状遗传模式符合常染色体单基因隐性遗传的孟德尔遗传定律(正常表型公猪51头，正常表型母猪34头，畸形公猪12头，畸形母猪9头，畸形
比例为21/106＝19.81％)。统计F3代中野生型个体和突变表型个体的数量，并进行比对，由
于野生型：突变型比例约为1:1，符合孟德尔显性遗传1:1的分离定律；同时，在突变体中既
有雌性与雄性的比例接近1:1，表明该突变表型与性别无关，从而确定所述突变表型是常染
色体显性遗传的。

[0029] 在根据本发明的一个实施方案中，所述ENU的注射剂量为50～100mg/kg，更优选地，所述ENU的注射剂量为60～70mg/kg；进一步优选地，所述ENU的注射剂量为65mg/kg。

[0030] 在根据本发明的一个实施方案中，还包括：检测ENU注射后的野生型雄性小型猪的精液品质，当注射后的野生型雄性小型猪的精液品质回复正常水平后，再使注射后的野生
型雄性小型猪与同品种野生型雌性小型猪交配。

[0031] 表型分析结果显示，本发明的蹼足病小型猪模型体型显著变小，背部皮肤有黑斑，甚至全部变黑，耳朵黏连在皮肤上，口鼻有融合，没有尾巴，四肢较短，并且脚趾发育不全。

[0032] 通过全基因组关联分析，确定了蹼足病小型猪模型的致病基因为RIPK4基因，对RIPK4基因的外显子全测序，结果显示，所述突变基因的突变位点位于第8号外显子，第1397
位碱基和1398位碱基之间插入腺嘌呤A，能够导致RIPK4的蛋白质翻译466位天冬酰胺(Asn)
突变为赖氨酸(Lys)，后面翻译的氨基酸发生移码突变。根据数据检索得知，RIPK4基因在人
类、猴、猪、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠、大鼠等哺乳动物中十分保守，因此，利用本发明提供
的RIPK4突变基因制备大型蹼足病猪模型，研究蹼足病的发病机理，对于临床预防、诊断和
治疗蹼足病具有重大的指导意义。

[0033] 再一方面，本发明提供了本发明的基因突变动物在作为用于研究人类蹼足病的模型中的用途。优选地，所述基因突变动物优选为巴马小型猪。

[0034] 在根据本发明的一个实施方案中，本发明通过对小型猪模型进行遗传连锁分析和基因克隆测序确定突变位置；优选地，通过基因克隆测序得到与RIPK4位点紧密连锁的突变
位点。

[0035] 再一方面，本发明提供了本发明的突变基因、构建体、重组细胞或试剂盒在制备用于筛选治疗和/预防蹼足病的动物模型中的用途；优选地，所述动物模型为哺乳动物模型；
更优选地，所述哺乳动物为小鼠、猴或小型猪。

[0036] 本发明提供的带有RIPK4基因突变的小型猪，其表型与人类蹼足病十分相似，从而提供了一种非常好的人类蹼足病的动物模型，可用于人类蹼足病病因病理研究，治疗方式
研究及药物筛选。另外，本发明提供的方法避免了巴马猪与其他白色的猪种杂交，不会引入
外源遗传信息，因而不会增加巴马猪遗传背景的复杂度，这有助于下一步纯化遗传背景和
近交系的建立。

附图说明

[0037] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0038] 图1为本发明的蹼足病巴马小型猪模型(Mut)和野生型小猪(WT)的全身表型；

[0039] 图2为本发明的蹼足病巴马小型猪模型(Mut)和野生型小猪(WT)的基因型鉴定结果，箭头所示为基因编码区的突变位点；

[0040] 图3为对本发明的蹼足病巴马小型猪模型和野生型小猪的皮肤进行了HE染色，其中WT为野生型小猪，Mut为本发明的蹼足病巴马小型猪模型，结果发现突变猪的表皮角化层
有显著的异常，主要表现为角化层较为疏松；

[0041] 图4为本发明的蹼足病巴马小型猪模型和野生型小猪的RIPK4蛋白的表达情况，发明人构建了体外超表达载体RIPK4‑HA‑WT和RIPK4‑HA‑Mut并转染293T细胞，然后检测RIPK4
的表达情况；结果发现，RIPK4突变后，蛋白有显著的降解，说明突变影响了蛋白的稳定性。

具体实施方式

[0042] 下面结合附图和实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

[0043] 广西巴马小型猪 购自第三军医大学，在中国科学院动物研究所北方大动物研究基地繁育

[0044] ENU                     Sigma(N8509bulk package)

[0045] 麻醉剂(氯胺酮)          东北农业大学

[0046] 犬醒宝尼可刹米注射液    江西博大动物医药保健公司

[0047] 实施例1蹼足病巴马小型猪遗传家系的建立

[0048] 1)向广西巴马小型猪公猪注射ENU，注射计量为65mg/kg，注射频率为每周一次，连续三周，

[0049] 2)精液品质检测，诱变后公猪精液进行品质检测，检测指标包括公猪精液体积、精子密度、精子存活率和畸形率，至质量回复到正常水平后，与野生型母猪交配，产生F1代。

[0050] 3)用F1代小型公猪与同品种的野生型雌性小型猪交配，获得F2代小型猪；

[0051] 4)用F1代小型公猪与同其后代F2雌性小型猪交配，获得F3代小型猪；

[0052] 5)大规模筛查特殊表型，观测F3代猪中是否有特殊表型。

[0053] 6)F1公猪和F2母猪进行交配产生F3代，确定其遗传模式。对新生猪进行表型筛选，得到发育畸形的广西巴马小型猪。

[0054] 7)在该突变家系，F3代共出生85头两头乌，21头畸形个体，卡方检验(X2＝1.5220<3.81，P>0.05)可以确定，该突变是符合孟德尔遗传模式的。

[0055] 如图1所示的，“RIPK4‑/‑”为获得的人类蹼足病的小型猪模型，其表型为四肢较短，背部大部分区域为黑色，口鼻融合等；“+/+”为野生型的广西巴马小型猪，其表型为两头
乌。

[0056] 实施例2蹼足病巴马小型猪遗传家系的基因突变定位

[0057] 通过对F3代猪进行遗传连锁分析和基因克隆测序确定突变位置，提取F3代猪耳组织的DNA，并通过设计引物进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分离，得到与RIPK4位点紧密连
锁的突变位点。

[0058] 1.DNA提取和质量检测

[0059] ①取适量耳组织装入1.5ml离心管，用小剪刀剪碎，加入500μL的SNET溶液和10μL蛋白酶K，在摇床中55℃，200rmp震荡过夜消化；

[0060] ②待组织消化完全，12000rmp离心1min使毛发沉淀，将上清转移到新的1.5ml EP管；

[0061] ③加入500μL苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，在常温下震荡30min；

[0062] ④将溶液在12000rmp，15min离心，小心吸取200μL上清转移至新的离心管，避免中间蛋白层荡起；

[0063] ⑤在上清中加入200μL的异丙醇，轻轻上下颠倒约1min，12000rmp，离心15min；

[0064] ⑥在离心管底部可见少量白色沉淀，倒掉溶液，注意不要倒掉沉淀，加入1ml 70％乙醇，轻弹离心管底部使沉淀浮起；

[0065] ⑦12000rmp，离心5min，保留DNA沉淀，将乙醇吸出，室温晾干DNA；

[0066] ⑧加入100μLTE，静置10min，用枪轻轻吹打溶液使DNA溶解；

[0067] ⑨使用NANOdrop对DNA溶液进行浓度和质量检测，DNA浓度应＞100ng/μL，A260/280在1.8‑2.0之间，A260/230＞2；

[0068] ⑩将DNA溶液稀释至100ng/μL，吸取2μL DNA溶液混合1μL10×loadingbuffer，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，120V，20min。质量合格的DNA样品应为主带清晰无断裂，无蛋
白和RNA污染。

[0069] 2.引物设计

[0070] 针对NCBI数据库中目标基因RIPK4基因的外显子的序列，利用Primer5软件进行引物设计，设计好的引物序列(表1)送至Invitrogene进行引物合成。

[0071] 表1引物序列

[0072]

[0073]

[0074] 3.PCR扩增

[0075] 使用天根2×Taq PCRmix进行PCR，25μL体系

[0076]

[0077] 使用如下PCR扩增程序：

[0078] 在94℃下，预变性3min；94℃变性30s，50‑65℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃温育10min。

[0079] 得到的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳中电泳检测产物，然后进行下步测序。如果扩增的序列中为纯合A插入(c.1397_1398insA)，则对应的猪为致病猪。

[0080] 如图2所示，下部为本发明的巴马小型猪模型的基因型鉴定结果，而上部为野生型广西巴马小型猪的基因型鉴定结果。其中，蹼足病巴马小型猪模型的所述突变基因序列如
SEQ ID NO:29所示。

[0081] 其中，加粗ATG是起始密码子；斜体加粗为终止密码子。

[0082] 下划线处表示突变基因的突变位点，其位于第8号外显子，第1397位碱基和1398位碱基之间插入腺嘌呤A，能够导致RIPK4的蛋白质翻译466位天冬酰胺(Asn)突变为赖氨酸
(Lys)

[0083] SEQ ID NO:29

[0084]

[0085]

[0086]

[0087] 实施例3蹼足病巴马小型猪遗传家系的特征分析

[0088] 表型分析发现，该突变猪体型显著变小，背部皮肤有黑斑，甚至全部变黑，耳朵黏连在皮肤上，口鼻有融合，没有尾巴，四肢较短，并且脚趾发育不全。RIPK4敲除小鼠表现出
皮肤表皮分化异常，发明人对该突变猪的皮肤进行了HE染色(图3)，结果发现突变猪的表皮
角化层有显著的异常，主要表现为角化层较为疏松。

[0089] 实施例4 RIPK4的蛋白质的表达

[0090] 由于没有在猪上可以使用的RIPK4 N端抗体，发明人构建了体外超表达载体RIPK4‑HA‑WT和RIPK4‑HA‑Mut并转染293T细胞，然后检测RIPK4的表达情况。结果发现，
RIPK4突变后，蛋白有显著的降解，说明突变影响了蛋白的稳定性(图4)。

[0091] 实施例5蹼足病巴马小型猪遗传工程疾病动物模型制备

[0092] 通过CRISPR/Cas9系统介导的高效遗传修饰，将RIPK4基因突变位点(c.1397_1398insA)靶向导入正常猪RIPK4基因相应序列，阳性猪表现为蹼足病表型并呈显性遗传。

[0093] 1.设计gRNA，以第8号外显子为模板，设计可以打靶突变位点(c.1397_1398insA)附近序列的gRNA；

[0094] 2.体外切割实验鉴定步骤1中的gRNA打靶效率；

[0095] 3.将Cas9质粒和步骤2中筛选到的gRNA质粒转染胎儿成纤维细胞之后，对阳性细胞进行筛选和鉴定。将筛选到的含有RIPK4基因突变位点(c.1397_1398insA)的细胞进行扩
繁和冻存；

[0096] 4.以步骤3中胎儿成纤维细胞作为核供体，进行体细胞核移植和胚胎移植，从而获得蹼足病巴马小型猪遗传工程疾病动物模型。

[0097] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在
形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。